Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Zebra Balıklarının Yumurtalık Foliküllerinde Foliküler Hücrelerin ve Oositlerin Ayrılması

8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62027

⸱

18 Nisan 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Sciences, Northwest Normal University, 2State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, 3Department of Bioscience, Tokyo University of Agriculture

Bu makalede

Özet

Burada, zebra balığında yumurtalık gelişiminin araştırılmasını kolaylaştıracak zebra balığı yumurtalık foliküllerindeki foliküler hücreleri ve oositleri ayırmak için basit bir yöntem sunuyoruz.

Özet

Zebra balığı omurgalıların yumurtalık gelişimini incelemek için ideal bir model haline gelmiştir. Folikül, oositler ve çevresindeki foliküler hücrelerden oluşan yumurtalığın temel birimidir. Foliküler hücrelerin birincil kültürü, gen ekspresyonunun analizi, oosit olgunlaşması ve in vitro fertilizasyon vb. Geleneksel yöntem, zahmetli, zaman alıcı ve oositte yüksek hasara sahip olan her iki bölmeyi ayırmak için önseçim kullanır. Burada, çekilmiş bir cam kılcal damar kullanarak her iki bölmeyi ayırmak için basit bir yöntem belirledik. Stereomikroskop altında, oositler ve foliküler hücreler çekilmiş ince cam kılcal damarda pipetleme ile kolayca ayrılabilir (çap folikül çapına bağlıdır). Geleneksel yöntemle karşılaştırıldığında, bu yeni yöntem hem oositleri hem de foliküler hücreleri ayırmada yüksek verimliliğe sahiptir ve oositlere düşük hasara sahiptir. Daha da önemlisi, bu yöntem pre-vitellogenez aşamasında da dahil olmak üzere erken evre foliküllere uygulanabilir. Böylece, bu basit yöntem foliküler hücreleri ve zebra balığı oositlerini ayırmak için kullanılabilir.

Giriş

Zebra balığı omurgalı gelişimi ve fizyolojisi çalışması için önemli bir model organizmadır. Zebra balığı, yumurtalık gelişiminin moleküler mekanizmalarını incelemek için iyi bir model olarak hizmet edebilir1,2,3. Yumurtalık gelişiminin birçok özelliği, balıklardan memelilere evrim sırasında çok korunur1,2. Diğer omurgalılara benzer şekilde, zebra balığı yetişkinleri, tüm gelişim evrelerindeki yumurtalık köklerini içeren asenkron yumurtalıklara sahiptir4. Folikül yumurtalığın temel üreme elemanıdır. Folikül, foliküler hücre adı verilen bir veya birkaç somatik hücre katmanı ile çevrili oositten oluşur. Foliküllerin gelişimi, oositler ve foliküler hücreler arasındaki çift yönlü iletişime bağlıdır5. Foliküler hücre birincil kültürü, gen ekspresyon analizi, oosit olgunlaşması ve in vitro fertilizasyon gibi farklı araştırma amaçları için foliküler hücrelerin ve oositlerin yumurtalık foliküllerinden ayrılması hayati önem taşımaktadır.

Geleneksel ayırma yöntemleri arasında mekanik olarak emişlere göre ayırma ve enzymatic sindirim6,7,8,9,10 bulunur. Bununla birlikte, mekanik ayırma, zaman alıcı ve zahmetlidir. Ayrıca ayırma sırasında oositte yüksek hasara neden olacaktır. Enzim sindirim yönteminin kullanımı basit olmasına ve kısa bir süre gerektirmesine rağmen, tedavi süresi ve enzim konsantrasyonu doğrulanmalıdır ve izole edilen oositlerin bütünlüğü ve hayatta kalma oranı ideal değildir. Bu nedenle, çekilen cam kılcal borular kullanarak her iki bölmeyi de farklı gelişim aşamalarında ayırmak için basit bir yöntem oluşturduk.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Balık deneylerinde yapılan tüm işlemler Kuzeybatı Normal Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu'nun yönetmeliklerine uygundur.

1. Hazırlıklar

  1. Hayvan
    1. Vücut uzunluğu 4-6 cm olan yetişkin dişi zebra balığı kullanın.
      NOT: Yerel bir pazardan zebra balığı kullandık.
    2. Zebra balığını yaklaşık 28 °C'de 14 saat açık ve 10 saat karanlık döngüye sahip sirkülasyonlu bir su sisteminde tutun.
    3. Yeni yumurtadan çıkmış salamura karides ile günde iki kez balık besleyin.
  2. Çekilmiş cam kılcal damar
    1. 15 cm'lik bir cam kılcal damar kullanın ve ısıtmak için kafasını bir alkol yakıcıya yerleştirin. Cam kılcal damarların bir ucunun bir ucunun elinde tutun ve diğer ucunun asalarla tutun.
    2. 5-10 saniye ısıttıktan sonra, alkol yakıcının ateşinde cam kırmızı ve yumuşak hale gelir. Kılcal damarların gerekli çapta açılmasını sağlamak için cam kılcal damarın başını uzunlatır.
      NOT: Çap folikül çaplarına bağlıdır: previtellojenik (PV; yaklaşık 0,30 mm çapında), erken vitellojenik (EV; yaklaşık 0,40 mm çapında), midvitellojenik (MV; yaklaşık 0,50 mm çapında), geç vitellojenik (LV; yaklaşık 0,60 mm çapında) ve tam yetişkin ama olgunlaşmamış (FG; yaklaşık 0,65 mm çapında).
    3. Cam kılcal damarların açılmasını, ayrılmış foliküllerin boyutu biraz daha küçük olan uygun çapa uzatın. Yumurtalık foliküllerinin boyutundan çok daha büyük bir açıklığa sahip cam kılcal damarlar ayırma yapamaz, ancak çok daha küçük olanlar ayırma sırasında folikülleri kırar. Cam kılcal damarların gerilmesini birkaç kez uygulayın.
      NOT: Isıtma süresi cam kılcal damarların boyutuna bağlıdır. Cam kılcal damarı alkol yakıcının ateşine doğrudan germeyin. Cam kılcal damarı kırar.
    4. Cam kılcal damarı bir ampul kesici ile kesin ve düzgün bir kesi elde etmek için cam kılcal damarıpslarla kırın.
      NOT: Cam kılcal damarın keskin veya kırık bir şekilde açılması foliküllere zarar verir.
    5. 30 cm plastik bir tüp kullanarak, bir ucu filtre elemanı olan 1 mL pipet ucu yerleştirin, çekilen cam kılcal damarı pipet ucuna yerleştirin ve başka bir uçta 200 μL pipet ucu bağlayın.

2. Zebra balığı oositlerinin ve foliküler hücrelerin farklı aşamalarda ayrılması

  1. Zebra balığı yumurtalığının diseksiyonu
    1. Bir buz kovasını bulamacı buzla dolu 4/5'e doldurun ve bulamacı buzun yüzmesine izin vermek için yeterli balık suyu ekleyin. 2-5 dakika bekleyin, su sıcaklığını kontrol edin ve sıcaklığın 2-4 ° C arasında olduğundan emin olun.
    2. Balıkların solungaç hareketini durdurana kadar en az 2-5 dakika buzlu suya balık yerleştirerek yetişkin dişileri uyuşturun. Ölümü sağlamak için keskin bir makas kullanarak omuriliği keserek balığın kafasını koparın.
    3. Balığı diseksiyon plakasınaps ile yerleştirin.
    4. Aşağıdaki gibi kesmek için kesme makası kullanın. Kloakadan karın orta çizgisi boyunca solungaçlara kadar diseksiyon yapın. Kloacanın arkasından kes. Ön ucundan sırt tarafına kesin. Vücudun bir tarafındaki cildi ve kasları hafifçe çıkarın. İç organları açığa çıkar ve tüm yumurtalığıps ile dışarı çıkar.
    5. Hemen, yumurtalıkları% 60 Leibovitz'in L-15 (L-15) ortamını içeren 100 mm'lik bir kültür kabına hafifçe yerleştirin.
  2. Yumurtalık köklerinin izolasyonu
    NOT: Benimsediğimiz evreleme sistemi Selman vd.4'ün orijinal tanımına dayanmaktadır.
    1. Daha önce açıklandığı gibi bir çift ince asa kullanarak farklı aşamalardaki folikülleri manuel olarak izoleedin 8.
    2. Yumurtalık köklerini aşağıdaki aşamalarda gruplaştırın: PV, EV, MV, LV ve FG aşamaları.
  3. Foliküler hücrelerin ve oositlerin yumurtalık foliküllerinden ayrılması
    1. Farklı aşamalardaki yumurtalık köklerini% 60 L-15 orta içeren temiz bir Petri kabına koyun.
    2. 1.2. adımdan çekilen cam kılcal damarı kullanarak, folikülleri 2-3 cm cam kılcal damara emin ve üfleyin.
      NOT: Cam kılcal damarların açma çapı uygun olduğunda folikül bir kez solunarak oositten ayrılabilir.
      1. Foliküler hücre tabakası oosit'e sıkıca tutturulmuşsa, tam bir ayırma yapmak için 2-3 kez tekrarlayın. Foliküle zarar verecek daha küçük bir kılcal damardan bir folikülü zorlamak için birden fazla girişimden kaçının.
        NOT: Soluma ve üfleme sürecinde foliküler tabaka düşer ve oositten ayrılır ve son olarak foliküler hücreler ve denuded oositler ayrılır (Şekil 1).
    3. Denuded ama bozulmamış oositleri biriktirin ve daha fazla test için hayatta kalan denuded oositleri toplayın.
    4. Foliküler hücrelerin sağlam foliküllerden ayrılıp ayrılmadığını araştırmak için, bozulmamış folikülleri ve ayrılmış oositleri 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) ile lekelendirin.
      1. Numuneleri oda sıcaklığında (RT) %4 tamponlanmış paraformaldehitte 1 saat sabitlayın. PBS ile birkaç kez yıkayın.
      2. RT'de DAPI tarafından 30 dakika leke. PBS ile birkaç kez yıkanır. Floresan mikroskopla görüntüleyin ve fotoğraflayın (örneğin, Leica DFC7000 T).
    5. Tamamlanan ayrımı onaylamak için, bozulmamış folikülleri ve ayrılmış oositleri 4 °C'de bir gecede %4 tamponlanmış paraformaldehite sabitlayın ve -25 °C'de intissue-dondurucu ortamı (örneğin Leica) gömün.
      1. Sabit dokuları bir mikrotom üzerinde kesin ve cam slaytlara monte edin.
      2. PBS'deki bölümleri yıkayın ve hücre çekirdeğini DAPI ile görselleştirin. Floresan mikroskopta görüntüleyin ve fotoğraflanın.

3. Tüp bebek (IVM) ve in vitro fertilizasyon (IVF)

NOT: IVF IVM prosedürü daha önce küçük modifikasyon 11 , 12,13ile açıklandığı gibi takip edildi.

  1. Yetişkin zebra balığı dişisinden yumurtalık diseksiyonundan önce taze olgunlaşma ortamı (+DHP ortamı) hazırlayın. Taze olgunlaşma ortamını hazırlamak için, Leibovitz'in L-15 mL'lik mL ortasını, pH 9.0'ı 15 mL konik tüplere ekleyin. 17α-20β-dihidroksi-4 pregnen-3-bir (DHP) (5 mg/mL), 490 μL dH 2 O ve%10sığır serum albüminin (BSA) 500 μL'sini ekleyin.
  2. Hank'in çözümünü ve E3 çözümünü önceden hazırlayın. Baars ve ark.14tarafından açıklandığı gibi Hanks'in çözümünü hazırlayın. E3 ortamını hazırlayın: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4ve% 1-5 Metilen Mavisi.
  3. Zebra balığı yumurtalığının diseksiyonu ve 2. adım adımda olduğu gibi yumurtalık foliküllerinin izolasyonu gerçekleştirin.
  4. Tam yetişkin evre folikülleri toplayın ve olgunlaşmamış oositler olarak kullanın. Her yetişkin dişi zebra balığı için en az 150-200 tam yetişkin evre folikül izole edilebilir. IVM için sağlam ve sağlıklı folikülleri seçin.
  5. Tam büyüyen evre folikülleri +DHP ortamında 12 kuyulu plakalarda kuluçkaya yatırarak, oositlerin bozulmadan kalmasını sağlamak için periyodik olarak kontrol edin. Pasteur pipet ile yutkunuyor oositleri çıkarın.
    NOT: Oosit olgunlaşması sırasında, oositler giderek yarı saydam hale gelecektir. Oositlerin çoğunluğu 2 saat boyunca DHP tedavisinden sonra yarı saydam hale gelir. Bu, iletilen ışık optikleri ile diseksiyon mikroskobu altında gözlemlenebilir.
  6. Adım 2.3'te açıklandığı gibi, olgunlaşmış her oositten en dıştaki foliküler hücreleri çıkarın.
  7. Denuded oositleri birkaç damla kültür ortamına sahip bir Petri kabına aktarın ve gübrelemeye devam edin.
  8. Hanks'in çözeltisinin 500 μL'sinde en az üç erkekten alınan testisleri kullanarak taze sperm çözeltisini hazırlayın. Sperm çözeltisini, döllenme gücünü 2-3 saate kadar tutabileceği buza koyun.
  9. Bir Petri kabına denuded ve olgunlaşmış oositlere 100 μL sperm çözeltisi ekleyin. Sperm çözeltisini yumurtaların arasına yavaşça ekleyin ve sperm ve yumurtaları pipet ucu kullanarak birlikte döndürün.
  10. Yumurtaları etkinleştirmek için hemen 1 mL E3 orta çözelti ekleyin ve yine bir pipet ucu kullanarak yumurtaları ve spermleri hafifçe döndürün.
  11. Gübreleme sonrası yaklaşık 1 dakika sonra (mpf), plakayı E3 orta çözeltisi ile doldurun. Tam korozyon genişlemesi 10-15 mpf içinde gözlemlenebilir.
  12. 35-45 mpf arasında, simetrik bölünme geçiren embriyoları 2 hücreli aşamaya seçin ve bu nedenle döllenir. Hücre bölünmesi olmayan embriyoları çıkarın.
  13. Embriyoların Petri kabında 28 °C'de gelişmesine izin verin, 10 cm plaka başına 80 embriyo sınırı vardır. Embriyo gelişimini görüntüleyin ve fotoğraflayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu yöntem, zebra balıklarında yumurtalık folikül gelişiminin farklı aşamalarında foliküler hücreleri ve oositleri ayırmak için kullanılabilir. Şekil 1 zebra balığı oositlerinin ve foliküler hücrelerin kılcal cam tüp kullanılarak yumurtalık foliküllerinden ayrılmasını göstermektedir(Şekil 1). Foliküler hücrelerin sağlam foliküllerden ayrılıp ayrılmadığını araştırmak için, PV aşamasından FG aşamasına kadar farklı folikül aşamalarından sağlam foliküller ve ayrılmış...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada foliküler hücrelerin ve oositlerin zebra balığı yumurtalık foliküllerinden basit ve hızlı bir şekilde ayrılması için yeni bir yöntem tarif ediyoruz. Bu yöntemin geleneksel yönteme göre çeşitli avantajları vardır. Bunlar arasında birincil olan, sadece tek ve harici bir manipülasyon gerektiğinden, yüksek verimlilik ve etkinlikle büyük ölçüde artan ayırma kolaylığıdır. Bu nokta mikroskobik anatomide iyi olmayan araştırmacılara uygulanabilirliği arttırır. Deneyimlerimize göre, foliküler hücreleri ve oositleri cam kılc...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı [32060170, 31601205 ve 31560334], Çin Burs Konseyi ve Tatlı Su Ekolojisi ve BiyoteknolojiSi Devlet Anahtar Laboratuvarı fonu tarafından desteklenen misafir bilim adamı projesi [2020FB05] tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
17&alfa;,20β-DHPCayman16146-5 (5 mg)
24 oyuklu plakaCorning3524
Ampul kesiciAS ONE5-124-22 1 torba (100 adet)
Susuz Na2HPO4Kaixin Chemical500 g
Salamura karidesHongjie250 g
CaCl2Beichen Fangzheng500 g
Kültür kabıBiosharpBS-90-D (10PCS/PK)
DAPISolarbioS2110 (25mL)
Diseksiyon MikroskobuZEISSStemi 305
Diseksiyon forsebiVETUSHRC30
Diseksiyon makasıKefu160 mm 
Floresan Stereomikroskop LeicaM205C
Cam kılcalIWAKIIK-PAS-5P (200 adet/paket)
Hoechst 33342SolarbioC0031 (1 mg)
KClBeichen Fangzheng500 g
KH2PO4Kaixin Chemical500 g
Leibovitz' s L-15 ortaGibco41300-039 (10 kez; 1L)
MgSO4 ve boğa; 7H2OBeichen Fangzheng500 g
Mikropipet uçlarıAxygenMCT-150-C
NaClBeichen Fangzheng500 g
NaHCO3Beichen Fangzheng500 g
Penicilia-streptomyciaGibco#15140122 (100 mL)
StereomikroskopZEISSKeşfet.v20

Kaynaklar

  1. Clelland, E., Peng, C. Endocrine/paracrine control of zebrafish development. Molecular and Cellular Endocrinology. 312, 42-52 (2009).
  2. Ge, W. Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).
  3. Li, J., Ge, W. Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies. Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).
  4. Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).
  5. Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science. 296, 2178-2180 (2002).
  6. Liu, L., Ge, W. Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary. Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).
  7. Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation. Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).
  8. Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish. Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).
  9. Pang, Y., Thomas, P. Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish. Developmental Biology. 342, 194-206 (2010).
  10. Peyton, C., Thomas, P. Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio). Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).
  11. Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (122), e55213(2017).
  12. Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).
  13. Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135, 285-292 (2008).
  14. Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments. , e54492(2016).
  15. Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Scientific Reports. 6, 34555(2016).
  16. Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Zebrafish Over FolikülleriFoliküler Hücre AyrıştırmaOosit İzolasyonuÇekilmiş Cam Kılcal BoruStereomikroskop TekniğiOosit OlgunlaşmasıIn Vitro FertilizasyonÇıplak OositlerFoliküler Hücre KültürüOver Folikülü Aşamaları
Zebra Balıklarının Yumurtalık Foliküllerinde Foliküler Hücrelerin ve Oositlerin Ayrılması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.