Floresan sızıntı tahlili, peptit/membran etkileşimlerinin araştırılmasını sağlayan basit bir yöntemdir, böylece çeşitli biyolojik süreçlere dahil olmaları ve özellikle hücre nüfuz eden peptitlerin doğrudan hücresel translokasyon işlemi sırasında fosfolipid bilayerleri rahatsız etme yeteneği.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hücre Delici Peptit ile Membran Dengesizleşmesini Araştırmak için Floresan Sızıntı Tahlil
Bu makalede
Özet
Özet
Hücreye nüfuz eden peptitler (CPP'ler), plazma zarını geçebilen ve bir kargoyu hücrelere aktarabilen taşıyıcılar olarak tanımlanır. Bu aktivite için gerekli olan temel ortak özelliklerden biri, CPP'lerin plazma membranı (lipitler) ve daha çok membranın hücre dışı matrisinin bileşenleri (heparan sülfat) ile etkileşimlerinden kaynaklanandır. Nitekim, doğrudan translokasyon veya endositoza bağımlı içselleştirmeden bağımsız olarak, lipid bilayerleri hem plazma zarı seviyesinde hem de hücre içi trafik (endosomal veziküller) düzeyinde içselleştirme sürecine dahil olurlar. Bu yazıda, olası CPP-membran dengesizliğini/etkileşimini tespit etmek ve içselleştirme mekanizmasındaki rollerini ele almak için floresan sızıntı testinde büyük bir unilamellar veziküllerin (LUV' ler) formülasyonu, saflaştırılması, karakterizasyonu ve uygulamasının farklı adımlarını açıklayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Plazma membran içeriğini yansıtan lipid bileşimine sahip LUV'lar, hem floresan boyayı hem de bir quencher'ı kapsüllemek için üretilir. Ekstravesiküler ortamda peptitlerin eklenmesi ve OV'ler üzerinde peptit-membran etkileşimlerinin indüksiyonu, böylece bir sızıntıyı ortaya çıkaran floresanlarda doza bağlı bir şekilde önemli bir artışa neden olabilir. Örnekler burada, çeşitli hücre hatlarında hızlı ve verimli bir siRNA teslimatı gösteren yakın zamanda geliştirilen triptofan (W) ve arginin (R) zengin Amfipatik Peptitler (WRAP'ler) ile sağlanmaktadır. Son olarak, bu etkileşimlerin doğası ve lipitlere olan yakınlık, membran translokasyonunu ve/veya endosomal kaçışı anlamak ve iyileştirmek için tartışılır.
Giriş
Doksanlı yıllardaki keşiflerinden sonra, plazma membran 1,2aracılığıyla kargoların verimli bir hücresel teslimatını teşvik etmek için hücre nüfuz eden peptitler (CPP'ler) geliştirilmiştir. CPP'ler genellikle çok çeşitli kökenlere sahip, genellikle 8 ila 30 amino asit olan kısa peptitlerdir. İlk olarak "doğrudan translokasyon" taşıyıcıları olarak tanımlandılar, yani plazma zarını geçebildiler ve herhangi bir endositotik yoldan bağımsız olarak hücrelere bir yük aktarabildiler ne enerji gereksinimi ne de reseptör tutulumu. Bununla birlikte, daha fazla araştırma, bu ilk gözlemlerin esas olarak deneysel eser nedeni....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Büyük Unilamellar Vezikles (LUVs) hazırlanması
- Luv'ları floresan sızıntı tahlilleri için hücre zarı taklitleri olarak kullanımları için hazırlayın.
- Hamilton cam şırıngar fosfatidylcholine (DOPC, 786.11 g/mol), sphingomyelin (SM, 760.22 g/mol) ve Kolesterol (Chol, 386.65 g/mol) ile molar oranında 4:4:2 karıştırın. Lipid çözeltisi, 25 mL'lik cam yuvarlak alt şişede 25 mg/mL'de bir metanol/kloroform (3/1; hacim/hacim) çözücüde çözünen her lipitin stok çözeltisinden elde edilir. 4 μmol DOPC, 4 μmol SM ve 2 μmol Chol'a dayanan lipid çözeltisi, sırasıyla 126 μL, 117 μL ve 31 μL karıştırılarak stok çözeltisinden elde edilir.
DİkKAT: Metanol toksik v....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Floresan kaçak tahlili prensibi Şekil 1'de gösterilmiştir. Ayrıntılı olarak, floresan bir boyayı ve bir quencher'ı (floresan sinyali yok) kapsülleyen büyük unilameller vesicles (LUV'lar) ilgi çekici biyomolekül ile tedavi edilir. Peptidin lipid zarları ile etkileşimi nedeniyle, membran geçirgenliği, yeniden yapılanma ve hatta yırtılma anlamına gelebilir, floresan boyası ve quencher LUV'lardan salınır. Tampondaki sonraki seyreltmeler floresan sinyalinin artmas.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Sunulan floresan sızıntı tahlili, hücreye nüfuz eden peptit ile membran dengesinin bozulmasını gidermek için basit ve hızlı bir yöntemdir. Yapması kolay, aynı zamanda farklı membran etkileşimi olan peptitler veya diğer membran etkileşimi molekülleri arasında dolaylı bir karşılaştırma sağlar. Protokolün kritik adımlarıyla ilgili olarak, bu test taban çizgisi (tek başına LUV'lar) ve maksimum floresan salınımı (Triton durumu) arasında göreceli değerler sağladığından, genellikle LUV'lerin konsantrasyonu, yalnızca LUV'lerin k.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, makalenin eleştirel incelemesi için Emilie Josse'ye teşekkür eder. Bu çalışma "La Ligue contre le Cancer", "Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer" ve "Centre National de la Recherche Scientifique" (CNRS) vakfı tarafından desteklendi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 25 mL cam yuvarlak tabanlı şişe | Pyrex | ||
| 8-aminonaftalin-1, 3, 6-trisülfonik asit, disodyum tuzu (ANTS) | Invitrogen | A350 | Işıktan koruyun |
| Kloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Kolesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| DOPC (dioleoilfosfatidilkolin) | Avanti Polar | 850375P | Havadan koruyun |
| Ekstruder | Avanti Polar | 610000 | |
| Florimetre | PTI Serlabo | ||
| 50 &mikro; L cam şırınga | Hamilton | 705N | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| LabAssay Fosfolipid ve nbsp; | WAKO | 296-63801 | |
| sıvı kromatografi kolonu | Sigma-Aldrich | ||
| Metanol | Carlo Erba | 414902 | |
| Çekirdek polikarbonat membran (0.1 & mikro; m gözenek boyutu, 25 mm çap) | Whatman | 800309 | |
| polistiren küvet, 10 x 10 x 45 mm | Grener Bio-One | 614101 | |
| polistiren yarı mikro küvet, DLS | Fisher Scientific | FB55924 | |
| p-ksilen-bispiridinyum bromür (DPX) | Invitrogen | X1525 | Işıktan koruyun |
| kuvars floresan küvet | Hellma | 109.004F-QS | |
| rotavapor sistemi | Heidolph | Z334898 | |
| Sephadex G-50 reçine | Amersham | 17-0042-01 | |
| Sodyum azid (NaN3< / sub>) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodyum klorid (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sonikatör banyosu USC300T | VWR | 142-6001 | |
| Sphingomyelin | Avanti Polar | 860062P | Havadan koruyun |
| Triton X-100 | Eromedex | 2000-B | |
| Zetaziser NanoZS | Malvern | ZEN3500 |
Kaynaklar
- Langel, U. Handbook of Cell-Penetrating Peptides. , CRC Press. (2006).
- Deshayes, S., Morris, M. C., Divita, G., Heitz, F. Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 62 (16), 1839-1849 (2005). ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
