Tiyoglikolik Asit (TGA) Kullanılarak Bitki Biyokütle Lignin İçeriğinin Tahmini

Lignin, bitki hücre duvarlarının hayati yük taşıyan bileşenlerinden biridir ve Dünya'daki en bol ikinci polimerdir^1. Kimyasal olarak, lignin aromatik polimerlerin doğal yenilenebilir kaynağını oluşturan ve biyomalzemelerin sentezini oluşturan yüksek moleküler ağırlıklı karmaşık fenolik bileşiklerden oluşan çapraz bağlı bir heteropolimerdir^2,3. Bu doğal polimer bitki büyümesi, gelişimi, hayatta kalma, mekanik destek, hücre duvarı sertliği, su taşıma, mineral taşıma, konaklama direnci, doku ve organ gelişimi, enerji birikimi ve biyotik ve abiyotik gerilmelerden korunmada önemli roller oynar^4,5,6,7. Lignin öncelikle üç farklı monolignoldan oluşur: fenil propanoid yolundan elde edilen iğne yapraklı, sinapil ve p-coumaryl alkoller^8,9. Lignin miktarı ve monomerlerin bileşimi bitki türlerine, doku / organ tipine ve bitki gelişiminin farklı aşamalarına göre değişir¹⁰. Lignin, kaynak ve monolignol bileşimine göre geniş ölçüde yumuşak ağaç, sertağaç ve çim lignin olarak sınıflandırılır. Softwood öncelikle% 4 p-coumaryl ve% 1 sinapil alkol ile% 95 iğne yapraklı alkolden oluşur. Sertağaç eşit oranlarda iğne yapraklı ve sinapil alkollere sahipken, çim lignin çeşitli oranlarda iğne yapraklı, sinapil ve p-coumaryl alkollerden oluşur^11,12. Monomerlerin bileşimi, hücre duvarının lignin mukavemetini, ayrışmasını ve bozulmasını ve moleküler yapıyı, dallanmayı ve diğer polisakkaritlerle çapraz bağlantıyı belirlediği için kritik öneme sahiptir^13,14.

Lignin araştırmaları, düşük maliyeti ve yüksek bolluğu nedeniyle yiyecek arama, tekstil endüstrileri, kağıt endüstrileri ve biyoetanol, biyoyakıt ve biyo-ürünler için önem kazanmaktadır^15,16. Lignin ölçülmesi için enstrümantal yöntemler (örneğin, yakın kızılötesi (NIR) spektroskopisi, nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ve ultraviyole (UV) spektrofotometrisi) ile birlikte çeşitli kimyasal yöntemler (örneğin, asetil bromür, asit deterjanları, Klason ve kalıcı^{oksidasyon)kullanılmıştır.} Lignin analiz yöntemleri genellikle elektromanyetik radyasyon, gravimetri ve çözünürlük esas alınarak sınıflandırılır. Elektromanyetik radyasyonla lignin tahmininin arkasındaki prensip, belirli dalga boylarında ışığı emdiği lignin kimyasal özelliğine dayanıyordu. Bu sonuçlar lignin karbonhidratlardan daha güçlü bir UV emiciliğe sahip olduğu ilkesine dayanarak tahmin edilmiştir. 1962'de Bolker ve Somerville, ahşaptaki lignin içeriğini tahmin etmek için potasyum klorür peletleri kullandılar¹⁸. Bununla birlikte, bu yöntem, lignin olmayan fenolik bileşiklerin varlığı ve uygun bir yok olma katsayısının bulunmaması nedeniyle otsu örneklerden lignin içeriğinin tahmininde sakıncalara sahiptir. 1970 yılında Fergus ve Goring, Guaiacyl ve Şırınil bileşik emilim maksimasının 280 nm ve 270 nm'de olduğunu ve bu sayede Bolker ve Somerville yönteminin yok olma katsayısı sorununu düzelttik^19. Daha sonra, fenolikleri karakterize etmek için son derece hassas bir teknik olan kızılötesi spektroskopi, az miktarda bitki biyokütle örnekleri ile lignin tahmini için de kullanılmıştır. Bu teknolojinin bir örneği, dağınık yansıtıcı Fourier dönüşüm spektrofotometrisiydi. Ancak bu yöntem, UV yöntemine benzer uygun bir standart yok²⁰. Daha sonra lignin içeriği NIRS (kızılötesi spektroskopiye yakın) ve NMR (nükleer manyetik rezonans spektroskopisi) tarafından tahmin edildi. Bununla birlikte, bu yöntemlerde dezavantajlar vardır, lignin kimyasal yapısını değiştirmezler, saflığını^{korurlar 20}.

Gravimetrik Klason yöntemi, odunsu sapların lignin tahmini için doğrudan ve en güvenilir analitik yöntemdir. Gravimetrik lignin tahmininin temeli, lignin olmayan bileşiklerin hidroliz /çözünürlüğü ve gravimetri için çözünmeyen lignin^{toplanmasıdır 21}. Bu yöntemde, karbonhidratlar lignin kalıntısı^20,₂₂çıkarmak için konsantre H 2 SO₄ ile biyokütlenin hidrolizi ile^{çıkarılır.} Bu yöntemle tahmin edilen lignin içeriği asit çözünmeyen lignin veya Klason lignin olarak bilinir. Klason yönteminin uygulanması bitki türüne, doku tipine ve hücre duvarı tipine bağlıdır. Tanenler, polisakkaritler ve proteinler gibi lignin dışı bileşenlerin değişken miktarlarda bulunması, asit çözünmeyen / çözünür lignin içeriğinin tahmininde orantılı farklılıklara neden olur. Bu nedenle, Klason yöntemi sadece odunsu saplar^17,23gibi yüksek lignin içerikli biyokütlenin lignin tahmini için önerilir. Asetil bromür (AcBr), asit çözünmeyen lignin ve tiyoglikolik asit (TGA) gibi çözünürlük yöntemleri, lignin içeriğinin çeşitli bitki biyokütle kaynaklarından tahmin edilmesi için en sık kullanılan yöntemlerdir. Kim ve arkadaşları, çözünerek lignin çıkarılması için iki yöntem belirledi. İlk yöntem lignin çözünmeyen bir kalıntı olarak çözünmeyen bir kalıntı olarak ayıklanırken, ikinci yöntem çözünür fraksiyonda lignin ayırır, çözünmeyen kalıntı olarak selüloz ve hemiselüloz bırakır²⁴.

Çözünürlük esasına dayalı lignin tahmininde kullanılan benzer yöntemler tiyoglikolik asit (TGA) ve asetil bromür (AcBr)^{yöntemleridir 25}. Hem TGA hem de asetil bromür yöntemleri, çözünür lignin emiciliğini 280 nm'de ölçerek lignin içeriğini tahmin ediyor; ancak, AcBr yöntemi lignin çözünürlüğü sürecinde xylans bozulur ve lignin içeriğinde yanlış bir artış gösterir²⁶. Tiyoglikolat (TGA) yöntemi, TGA ile lignin benzil alkol gruplarının tiyoether gruplarıyla spesifik bağlanmaya bağlı olduğu için daha güvenilir bir yöntemdir. TGA bağlı lignin HCl kullanılarak asidik koşullar altında çökelmez ve lignin içeriğinin emiciliği 280 nm²⁷olarak tahmin edilir. TGA yöntemi, daha az yapısal modifikasyon, çözünür bir lignin tahmini şekli, lignin olmayan bileşenlerden daha az parazit ve TGA ile spesifik bağlanma nedeniyle lignin kesin tahmini gibi ek avantajlara sahiptir.

Bu TGA yöntemi, lignin içerik tahmini için kullanılan bitki biyokütle örneğinin türüne göre değiştirilmiştir. Burada, lignin içeriğini tahmin etmek için hızlı TGA pirinç pipetleri²⁷ yöntemini pamuklu dokulara modifiye ettik ve uyarladık. Kısaca, kurutulmuş toz bitki örnekleri proteinleri ve alkol çözünür fraksiyonunu çıkarmak için protein çözünürlüğü tamponuna ve metanol ekstraksiyonuna tabi tutuldu. Alkol çözünmeyen kalıntısı Asidik koşullarda TGA ve çökelme lignin ile tedavi edildi. Ticari bambu lignin kullanılarak lignin standart eğrisi oluşturulmuş ve bir regresyon çizgisi (y = mx+c) elde edildi. "x" değeri 280 nm'de lignin ortalama emiş değerlerini kullanırken, pamuk bitkisi biyokütle örneklerinde bilinmeyen lignin konsantrasyonunu hesaplamak için regresyon hattından "m" ve "c" değerleri girildi. Bu yöntem beş aşamaya ayrılmıştır: 1) bitki örneklerinin hazırlanması; 2) örnekleri su ve metanol ile yıkamak; 3) pelet TGA ve asit ile tedavi lignin çökeltmek için; 4) lignin yağışı; ve 5) numunenin standart eğri hazırlama ve lignin içeriği tahmini. İlk iki aşama öncelikle bitki malzemesi hazırlamaya ve ardından alkol çözünmeyen malzemeyi elde etmek için su, PSB (protein çözünürlüğü tamponu) ve metanol ekstraksiyonlarına odaklanır. Daha sonra TGA (tiyoglikolik asit) ve HCl ile tedavi edilerek üçüncü fazda lignin ile kompleks oluşturuldu. Sonunda, HCl, emiciliğini 280 nm²⁸olarak ölçmek için sodyum hidroksitte çözünen lignin çökeltmek için kullanıldı.

1. Bitki örneklerinin hazırlanması

1. Seradan iki aylık pamuk bitkilerini toplayın (Şekil 1A).
2. Bitkinin etrafındaki toprağı gevşeterek toprağı ve kökleri sağlam yanal köklerle ayırmak için bitki saksılarını hafifçe çevirin (Şekil 1B).
3. Toplanan bitkileri, tüm kiri temizlemek için suyla dolu tepsilerde iyice yıkayın (kök örnekleri için) (Şekil 1C).
4. Ayrılmış kök, kök ve yaprak dokularını kurutmak ve etiketlemek için kağıt havlu kullanın (Şekil 1D). Mantar kirlenmesini önlemek için oda sıcaklığında 2 gün boyunca kuru hava (Şekil 1E).
5. Örnek dokuları etiketli kaplara/alüminyum folyolara aktarın ve 7 ila 10 gün boyunca 49 °C'de sıcaklık kontrollü bir inkübatörde kuluçkayayatırın (Şekil 1F).
   NOT: Daha yüksek sıcaklıklar lignin yapısını değiştirebilir. Alternatif olarak, bitki biyokütlede herhangi bir kimyasal değişikliğe neden olmadan numuneleri 1 ila 2 gün kurutmak için bir dondurarak kurutucu kullanılabilir.
6. İnkübatör kurutulmuş dokuyu 5 mm boyutunda parçalara kesmek için bir bıçak kullanın veya alternatif olarak bitki dokularını öğütmek için bir biyokütle öğütücü kullanın (Şekil 1G, Şekil 1H).
   NOT: Biyokütle öğütücü/bıçak, her numune kesildikten/öğütüldükten sonra temizlenmelidir.
7. Kesilmiş doku/ biyokütle topraklanmış bitki malzemesini öğütme şişelerine aktarın ve bir dondurucu değirmeni veya sıvı N₂ile kriyojenik öğütücü kullanarak 1 mm büyüklüğünde ince toz haline getirin.
8. Örnekleri 10 CPS (her döngü aralığı 2 dk) oranında üç döngü boyunca tekdüze bir toz haline getirin(Şekil 1I, 1J, 1K).
   NOT: Deney bu noktada duraklatılabilir ve numuneler uzun süreli depolama için hava geçirmez kaplarda oda sıcaklığında saklanabilir.

2. Numuneleri su, PSB ve metanol ile yıkamak

1. Laboratuvar not defterinde lignin içeriği tahmini için kullanılan tüm boş 2 mL mikrobuge tüplerinin ağırlığını ölçün ve kaydedin.
2. Zemin numune tozunun 20 mg'ını önceden tartılmış tüpe aktarın. Tüpü doku ve doku tozu ile tartın ve bu ağırlıkları laboratuvar defterine kaydedin.
3. 2 mL mikrobuj tüplerinin tümünü (açık kapaklı) 20 mg doku tozu ile bir ısı bloğunda veya 60 °C'de fırında 1 saat boyunca kuluçkaya bırakın.
4. Kuluçkadan sonra, numuneleri oda sıcaklığında (RT) 10 dakika soğutur.
5. Her mikroyapı tüpüne 1,8 mL su ekleyin ve girdapla karıştırın. Ardından, RT'de 10 dakika boyunca 25.200 x g'da (15.000 rpm) santrifüj ve üstnatantı atın (Şekil 2).
6. Tutulan her peletin içine 1,8 mL Protein Çözünme tamponu (PSB)(Tablo 1)ekleyin ve girdapla karıştırın. RT'de 10 dakika boyunca 25.200 x g'da (15.000 rpm) santrifüj ve süpernatantı atın.
7. Her örnek için 2.6 adımlarını tekrarlayın.
8. Her pelete 1,8 mL su ekleyin, girdapla karıştırın ve 10 dakika boyunca 25.200 x g'da (15.000 rpm) santrifüj ekleyin. Santrifüjlemeden sonra peletin tasarruf edin ve süpernatantı atın.
9. Tutulan pelete 1,8 mL metanol ekleyin ve 60 °C ısı bloğunda 20 dakika kuluçkaya yatırın. Ardından, RT'de 10 dakika boyunca 25.200 x g'da (15.000 rpm) santrifüj. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve peletin muhafazası (Şekil 2).
10. Her örnek için 2.9 adımlarını tekrarlayın.
11. Peletin HAVASINI RT'de kurutun veya vakumla kurutarak hemen ilerleyin. Vakum kuruması, 30 °C'de vakum kurutucu kullanarak 2 ila 3 saat boyunca veya pelet tamamen kuruyana kadar kurutun.
    NOT: Deney bu noktada gece boyunca hava kurutarak duraklatılabilir veya vakumla kurutularak devam edilebilir.
12. Kuruduktan sonra, numune tüplerini kurutulmuş peletle tartın ve laboratuvar defterindeki ilgili boş tüp ağırlığının yanındaki ağırlığı kaydedin. İki değeri çıkararak pelet ağırlığını tahmin edin. Bu ağırlıklar lignin ekstraksiyon sürecinin sonunda lignin tahmini için kullanılacaktır.
13. Lignin ekstraksiyonunun bu noktasında, lignin standart eğrisinin üretimi için ticari bambu ligninini ekleyin. Ticari bambu lignin 0,5 mg artışlarla 0,5 mg ila 5 mg arasında değişen ayrı tüpler halinde ölçün (0,5 mg, 1 mg, 1,5 mg, 2 mg, 3 mg, 3,5 mg, 4 mg, 4,5 mg ve 5,0 mg). Üç teknik çoğaltma için her konsantrasyonu üç kez ölçün.
    NOT: Bundan böyle yukarıdaki adımda ölçülen standartlar, kurutulan numunelerle aynı şekilde işlenmiştir.

3. Lignin çökeltmek için TGA ve asit ile pelet tedavisi

1. Yukarıdaki adımdan alınan denek işlenmiş numuneler, ölçülen standartlarla birlikte TGA (tiyoglikolik asit) tedavisine kadar.
2. Her peletin içine 1 mL 3 N HCl (Tablo 1) ve 100 μL TGA ekleyin.
3. Vortex ve bir duman davlumbazında 3 saat boyunca önceden ısıtılmış 80 °C ısı bloğunda kuluçkaya yatırın (Şekil 2).
   NOT: 80 °C'deki ısıtma adımı izlenmelidir. Yüksek basınç birikmesi kapakları açabilir ve kimyasal dökülmelere yol açabilir. Vidalı kapak tüpleri önerilir, ancak bu tür dökülmeleri önlemek için alternatif olarak bu adım sırasında 2 mL tüpler gevşek bir şekilde kaplanabilir.
4. Kuluçkadan sonra, RT'de 10-15 dakika ve santrifüjde 25.200 x g'da (15.000 rpm) 10 dakika RT'de tüpleri soğutur.
   NOT: Asit ve organik çözücülerden elde edilen atıklar ayrıştırılmalı ve havalandırılmış kapaklı cam kaplarda saklanmalıdır. TGA-asit atıkları ve asit atıklarının toplanması için ayrı cam kaplar kullanın.
5. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve peletin tutul. RT'de 10 dakika boyunca 1 mL su ekleyin, girdapla karıştırın ve 25.200 x g'da (15.000 rpm) santrifüj ekleyin.
6. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve peleti 1 N NaOH'da 37 °C çalkalayıcı / termal karıştırıcıda 24 saat boyunca düşük hızda karıştırın (Şekil 2).
   NOT: Bu kuluçka süresi 1 saat^7'yedüşürülebilir.
7. Kuluçkadan sonra, RT'de 10 dakika boyunca 25.200 x g 'da (15.000 rpm) 2 mL mikrobuj tüplerini santrifüj edin.
   NOT: Prosedür, doğada aşındırıcı olan güçlü asitlerin ve diğer kimyasalların kullanımını içerir. Bu nedenle, lignin tahmini süreci boyunca uygun KKD giyilmesi önerilir. TGA güçlü hoş olmayan bir kokuya sahiptir ve doğada aşındırıcıdır. Bu nedenle, sadece duman kaputunda kullanılması önerilir.

4. Lignin yağışı

1. Süpernatantı taze bir 2 mL mikrofuge tüpüne aktarın ve 4 saat veya gece boyunca 4 °C'de 200 μL konsantre HCl. Incubate ekleyin (Şekil 2).
   NOT: Soğutma adımı bir geceye uzatılarak ekstraksiyon işlemi bu noktada duraklatılabilir.
2. RT'de 10 dakika boyunca 25.200 x g'da (15.000 rpm) santrifüj ve peleti 1 mL 1 N NaOH'da çözün.
3. NaOH'da peletin tamamen askıya alınmasını sağlamak için RT'deki çalkalayıcıda 10 dakika kuluçkaya yaslanın.
4. Son olarak, bir spektrofotometre kullanarak numunelerin emiciliğini 280 nm olarak ölçün ve standart lignin eğrisi ile karşılaştırın.
5. Kalibrasyon eğrisi regresyon hattı değerlerini ve çıkarılan numunelerin absorbanslarını 280 nm'de kullanarak lignin bilinmeyen konsantrasyonunu ölçün.

5. Numunede standart eğri hazırlama ve lignin tahmini

1. Lignin standartlarını TGA tedavisinden alınan deneysel örneklerle aynı şekilde işleyin.
2. Ticari bambu lignin standartlarını 0.5 mg, 1 mg, 1.5 mg, 2 mg, 2.5 mg, 3.0 mg, 3.5 mg, 4.0 mg, 4.5 mg ve 5 mg'dan başlayarak 0.5 mg artışlarla ölçün. Daha sonra, TGA, HCl tarafından yapılan işlem, 1 N NaOH'da çözünür ve ardından absorbansı 280 nm'de ölçer (Şekil 3A).
3. Standart lignin eğrisinin dağınık bir grafiğini oluşturmak için lignin konsantrasyonu ve absorbans okumalarının değerlerini kullanın (Şekil 3B).
4. 280 nm'deki ayıklanmış örneklerin ortalama absorbanslarından "x" değerleri ve lignin standart eğri gerileme çizgisinden "c" değerlerini kullanarak hazırlanan örneklerin bilinmeyen lignin içeriğinin tahmin edilmesi için dağınık çizimde oluşturulan y = mx+c regresyon çizgisini kullanın.
5. Mg başına lignin konsantrasyonu elde etmek için mg (yaklaşık 15 mg) metanol ekstraksiyonu sonra vakum / hava kurutulmuş bitki biyokütle örneğinin toplam ağırlığına lignin içeriğini elde edilen y değerine bölün. Ardından, mg başına lignin yüzdesini hesaplamak için bu değeri 100 ile çarpın.

Farklı dokulardaki lignin içeriklerindeki farklılıklar için iki farklı pamuk deneysel çizgisi karşılaştırıldı. Her numunenin çıkarılan lignin içeriği 280 nm olarak ölçüldü ve ilgili absorbans değerleri kaydedildi. Her biyolojik yinelemenin ortalama absorbans değerleri lignin standart eğrisinin regresyon çizgisi ile karşılaştırıldı (Tablo 2, Şekil 3C). Regresyon çizgisi, y = mx + c, çıkarılan deneysel çizgilerin bilinmeyen lignin içeriğini hesaplamak için kullanılır, örnek 1 ve örnek 2. Ortalama OD değerlerinin sonuçları "x" olarak değiştirilirken, "m" ve "c" değerleri mg'da lignin konsantrasyonu "y" elde etmek için lignin standart eğrisinin regresyon çizgisinden takıldı (Tablo 3, Şekil 3B). Bir sonraki adımda, 1 mg lignin içeriği başına hesaplamak için, metanol ekstraksiyonu sonrası "y" değerini numunenin ağırlığına (15 mg) bölün. Aşağıdaki adımda, gram başına hesaplamak için (= 1.000 mg) y/15 değeri 1.000 ile çarpılmış. Lignin % 'sini almak için y/15 değerini 1.000'e böleriz ve 100 ile çarparız. Üç biyolojik replik için lignin % ortalaması (her satır, örnek 1 ve örnek 2) iki deneysel çizgi örnek 1 (,7) arasında karşılaştırıldı. ve örnek 2 (,3). Lignin değerleri, TGA yönteminin güvenilir bir yöntem olduğunu ve lignin içeriğini ölçmek için son derece spesifik olduğunu öne süren biyolojik çoğalmalar arasında tutarlıydı. İki deneysel pamuk hattının farklı doku tipleri (kök, kök ve yapraklar) arasında karşılaştırma çalışmaları da yapıldı ve her iki çizgi de yapraklarda nispeten daha düşük lignin içeriği gösterdi (%3.4) saplarla karşılaştırıldığında (%9,4 ila %9,9) ve kökler (%9,4 ila %9,2) (Tablo 4, Şekil 4).

Şekil 1: Bitki biyokütle örneğinin hazırlanması.  (A) Yeşil evden pamuk bitki malzemesi topladı. (B) Kökleri ayırmak için yavaşça tencereleri çevirdi. (C) Tüm kiri temizlemek için suda iyice yıkanır. (D) Ayrılmış kök, kök ve yaprak dokuları. (E) Dokuyu ayırdıktan sonra 2 gün boyunca havayla kurutulmuş doku. (F) Hava kurutulmuş doku 10 gün boyunca 49 °C'de inkübatöre aktarılır. (G) Bitki biyokütle örneklerini öğütmek için biyokütle öğütücü kullanılmıştır. (H) Zemin bitkisi biyokütle kök, kök ve yaprak örnekleri. (I) Öğütme şişelerine öğütme numuneleri yüklenir, dondurucu değirmen odasına yerleştirilir, dondurucu değirmeninde 3 döngü boyunca 10 CPS oranında topraklanır. (J) Dondurucu değirmeninde öğütüldükten sonra ince öğütülmüş doku tozu gösteren öğütülmüş şişeler. (K) Öğütme için dondurucu değirmeni kullandıktan sonra kök, kök ve yaprak doku tozunun ince öğütülmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: TGA aracılı lignin ekstraksiyonunda yer alan kritik adımlar. TGA yöntemi kullanılarak bitki biyokütlesinden lignin ekstraksiyonuna ve lignin içeriği tahminine kadar kritik adımların akış şeması: 1. Bitki örneklerinin yeterli kurutma ve dondurucu değirmeni kullanılarak ince toz haline getirilerek hazırlanması; 2. 20 mg doku tozu PSB, metanol ve su yıkama, kurutulmuş ve çıkarılmış alkol çözünmeyen malzemeye tabi tutuldu; 3. TGA ve asit kullanılarak lignin çökelme; 4. Ticari bambu lignin kullanılarak lignin standart eğrisinin hazırlanması; 5. Lignin içeriğinin tahmini. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Numunede standart eğri hazırlama ve lignin tahmini. (A) 280 nm'de absorbans okumalarından lignin standart eğrisi üretmek için kullanılan farklı konsantrasyonlarda ticari bambu lignin gösteren tablo. (B) Tablo A. (C) Örnek 1 ve örnek 2'nin tahmini kök doku lignin içeriğini temsil eden çubuk grafikler kullanılarak Excel programı ile oluşturulan dağınık çizim. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Protokolde kullanılan çözümlerin hazırlanması. Protokolde kullanılan farklı çözümlerin hazırlanmasını gösteren tablo.

Tablo 2: Lignin standart eğrisi 0.5 mg ila 3.5 mg endüstriyel bambu lignin arasında hazırlanmıştır. M ve c değerlerini gösteren regresyon çizgisine sahip dağınık grafik. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 3: 280 nm 'de (x olarak) örneklerin absorbans okumaları ve standart eğri eğrisinden 'm' ve 'c' değerleri kullanılarak bilinmeyen lignin içeriğinin hesaplanmasında kullanılan Lignin şablonu. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 4: Çiçek açma sonrası aşamada pamuk bitkisinin farklı dokularından (kök, kök ve yapraklar) lignin içeriği. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.