Method Article

Omurgalı Eksenel Uzama ve Segmentasyonunu İncelemek için Üç ve Dört Boyutlu Görselleştirme ve Analiz Yaklaşımları

DOI:

10.3791/62086

⸱

February 28th, 2021

 ,  ,  , 
1Instituto Gulbenkian de Ciência, 2Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 3NOVA School of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, fare embriyolarının üç ve dört boyutlu görüntü verilerinin, toto optik projeksiyon tomografisi ve multifoton mikroskobu kullanılarak canlı görüntüleme ve tam montajlı immünofloresan boyama ile elde edilen eksenel uzama ve segmentasyon bağlamında görselleştirilmesini ve analizini sağlayan hesaplamalı araç ve yöntemleri açıklamaktayız.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Somitogenez, omurgalı embriyonik gelişiminin bir işaretidir. Yıllardır, araştırmacılar bu süreci ex vivo ve in vitro yaklaşımları kapsayan çok çeşitli teknikler kullanarak çeşitli organizmalarda inceliyorlar. Bununla birlikte, çoğu çalışma hala iki boyutlu (2D) görüntüleme verilerinin analizine dayanmaktadır, bu da karmaşık bir 3D alanda oldukça dinamik etkileşimler içeren eksenel genişleme ve somitogenez gibi gelişimsel bir sürecin doğru bir şekilde değerlendirilmesini sınırlar. Burada, bu gelişimsel süreçlerde yer alan hücreleri (örneğin, nöromezodermal progenitörler) incelemek için fare canlı görüntüleme elde etme, veri kümesi işleme, görselleştirme ve 3D ve 4D olarak analiz etme tekniklerine izin veren teknikleri açıklıyoruz. Ayrıca, fare embriyolarında optik projeksiyon tomografisi ve tam montajlı immünofloresan mikroskopisi için adım adım bir protokol sağlıyoruz (numune hazırlamadan görüntü elde etmeye kadar) ve 3D görüntü verilerini işlemek ve görselleştirmek için geliştirdiğimiz bir boru hattını gösteriyoruz. Bu tekniklerden bazılarının kullanımını genişletiyoruz ve eksenel genişleme ve somit oluşumu (örneğin, 3D rekonstrüksiyonlar) hakkındaki mevcut anlayışımızı geliştirmek için kullanılabilecek farklı yazılımların (örneğin, Fiji / ImageJ, Drishti, Amira ve Imaris) belirli özelliklerini vurguluyoruz. Toplamda, burada açıklanan teknikler, gelişim biyolojisinde 3D veri görselleştirme ve analizinin önemini vurgulamaktadır ve diğer araştırmacıların omurgalı eksenel uzantısı ve segmentasyonu bağlamında 3D ve 4D görüntü verilerini daha iyi ele almalarına yardımcı olabilir. Son olarak, çalışma omurgalı embriyonik gelişimini öğretmeyi kolaylaştırmak için yeni araçlar da kullanmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Omurgalı vücut ekseni oluşumu, embriyonik gelişim sırasında meydana gelen oldukça karmaşık ve dinamik bir süreçtir. Gastrulasyonun sonunda [farede, embriyonik gün (E) 8.0 civarında], nöromezodermal progenitörler (NMP'ler) olarak bilinen bir grup epiblast progenitör hücre, boyun, gövde ve kuyruk oluşumu sırasında nöral tüp ve paraksiyal mezodermal dokuları üreterek baştan kuyruğa sekansta eksenel genişlemenin önemli bir itici gücü haline gelir 1,2,3,4 . İlginçtir ki, bu NMP'lerin kaudal epiblastta işgal ettiği pozisyon, mezoderm veya nöroekt....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvanları içeren deneyler, barınma, hayvancılık ve refah ile ilgili Portekiz (Portaria 1005/92) ve Avrupa (Direktif 2010/63/AB) mevzuatlarını takip etti. Proje, 'Instituto Gulbenkian de Ciência' Etik Komitesi ve Portekiz Ulusal Kuruluşu 'Direcção Geral de Alimentação e Veterinária' (lisans referansı: 014308) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. 3D ve 4D görüntüleme için numune hazırlama

NOT: Burada, canlı görüntüleme için fare E8.25 ila E10.5 embriyolarının (1.1), tüm mount immünofloresan mikroskobu için E7.5 ila E11.5 embriyolarının (1.2) ve optik projeksiyon tomografisi için fetüslerin nasıl diseke ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda hem canlı hem de immünofloresan görüntüleme için gösterilen temsili sonuçlar, 20 × 1.0 NA su hedefi, 960 nm'ye ayarlanmış uyarma lazeri ve GaAsP fotodetektörleri (Dias et al. (2020)43'te açıklandığı gibi) ile iki fotonlu bir sistem kullanılarak elde edilmiştir. Optik projeksiyon tomografisi, özel yapım bir OPenT tarayıcı kullanılarak yapıldı (Gualda et al. (2013)28'de açıklandığı gibi).

Canlı görüntüleme (4D analiz)
.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksenel uzama ve segmentasyon, omurgalı embriyonik gelişimi sırasında meydana gelen en karmaşık ve dinamik süreçlerden ikisidir. Tek hücreli izleme ile 3D ve 4D görüntülemenin kullanımı, erişilebilirlik ve kültür koşullarının karmaşık görüntülemeyi kolaylaştırdığı zebra balığı ve tavuk embriyolarında bu süreçleri incelemek için bir süredir uygulanmaktadır 19,44,45,46,47,48,49 .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LuVeLu muhabir suşu için Olivier Pourquié ve Alexander Aulehla'ya, RapiClear test örneği için SunJin laboratuvarına, BigStitcher'ı kullanma yardımı için Hugo Pereira'ya, canlı görüntüleme cihazının kurulmasına yardımcı oldukları için Nuno Granjeiro'ya, IGC hayvan tesisine ve Mallo laboratuvarının geçmiş ve şimdiki üyelerine bu çalışma sırasında yararlı yorumlar ve destek için teşekkür ederiz.

Portekiz Bölgesel Operasyonel Programı (Lisboa 2020) tarafından ortaklaşa finanse edilen Portekiz fonları ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 ve ref# PTDC/BII-BTI / 32375/2017 tarafından desteklenen IGC'nin Gelişmiş Görüntüleme Tesisi'nin, Portekiz 202....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agaroz düşük jelleşme sıcaklığıSigmaA9414Embriyoları monte etmek için kullanılır (örneğin OPT için)
Amira yazılımıThermofisher-Commerialyazılım aracı
Anti-Brachyury (Keçi poliklonal)R ve D SistemleriAF2085 RRID: AB_2200235İmmünofloresan için
Anti-Sox2 (Tavşan monoklonal)Abcamab92494 RRID: AB_10585428İçin immünofloresan
Anti-Tbx6 (Keçi poliklonal)R ve D SistemleriAF4744 RRID: AB_2200834İmmünofloresan için
Anti-Laminin111 (Tavşan poliklonal)SigmaL9393 RRID: AB_477163İmmünofloresan için
Anti-keçi 488 (Eşek poliklonal)Moleküler ProblarA11055 RRID: AB_2534102İmmünofloresan için
Anti-tavşan 568 (Eşek poliklonal)ThermoFisher   BilimselA10042 RRID: AB_2534017İmmünofloresan için
Benzil Alkol (% 99 +)(herhangi bir)-Embriyoları temizlemek için kullanılır (BABB bileşeni)
Benzil Benzoat (% 99 +)(herhangi biri)-Embriyoları temizlemek için kullanılır (BABB bileşeni)
Sığır serum albüminiBiowestP6154İmmünofloresan için
Kapak camı 20x20 mm # 0(herhangi biri)-100um kalınlığında
Kapak Camı 20x20 mm # 1(herhangi biri)-170um kalınlığında
Kapak Camı 20x60 mm # 1.5(herhangi biri)-" slaytlar"
DAPI (4 ',6-Diamidino-2-Fenilindol Dihidroklorür)Life TechnologiesD3571İmmünofloresan için
Drishti yazılımı(açık kaynak)-Demineralizasyon için ücretsiz yazılım aracı
EDTASigmaED2SS
Fiji/ImageJ yazılımı(açık kaynak)-Özgür yazılım aracı
GlycineNZYtechMB01401İmmünofloresan için
Huygens yazılımıScientific VolumeImaging-Commerial yazılım aracı
HyClone tanımlı fetal sığır serumuGE Healthcare#HYCLSH30070.03Canlı görüntüleme için
Hidrojen peroksit çözeltisi %30Milipore1085971000
Imaris yazılımınıBitplane / Oxford instruments-Ticari yazılım aracı
iSpacersSunJin Lab(değişir)preparatları için ara parça olarak kullanın
; 024Canlı görüntüleme ortamı için
Düşük glikozlu DMEMGibco11054020Canlı görüntüleme ortamı
M2 ortamıiçin SigmaM7167Embriyoları incelemek
MetanolVWRVWRC20847.307Dehidrasyon ve rehidrasyon adımları için
Metil salisilatSigmaM6752Embriyoları temizlemek için kullanılır
ParaformaldehitSigmaP6148Embriyoları sabitlemek için çözeltide kullanılır
Penisilin-streptomisinSigma#P0781Canlı görüntüleme ortamı için
PBS (Fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi)BiowestL0615-500-RapiClear
SunJin LaboratuvarıRapiClear 1.52Embriyoları temizlemek için kullanılır
Güvenli Deniz hibridizasyon odalarıSigmaC5474Ara parça olarak kullanın hazırlıklar
simLab yazılımıSimLabsoft-Commerial yazılım aracı
Slayt, depresyon içbükey cam - 75x25 mm(herhangi biri)-Kalın embriyoları monte etmek için.
İmmünofloresan içinTriton X-100SigmaT8787
temizlemek için L-glutamin Gibco # 25030 için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133(2009).
  2. Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biolog....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Vertebrate SomitogenesisAxial Elongation3D Visualization4D ImagingMouse EmbryosOptical Projection TomographyWhole Mount ImmunofluorescenceNeuromesodermal ProgenitorsTissue Clearing3D Reconstruction

Related Articles