Method Article

Polisome Profilleme Kullanarak Gelişen Fare Beyninde Çeviri Analizi

DOI:

10.3791/62088

⸱

May 22nd, 2021

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology; Cumming School of Medicine, University of Calgary, 2Department of Medical Genetics, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 3Alberta Children's Hospital Research Institute, University of Calgary

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli beyninin gelişimi, gen ekspresyonunun çeviri düzeyinde uygun şekilde kontrolini gerektirir. Burada, gelişmekte olan beyindeki mRNA'ların çevirisel durumunu değerlendirmek için montajı kolay bir sakkaroz gradyan ve fraksiyonasyon platformuna sahip bir polisome profilleme sistemini tarif ediyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli beyninin doğru gelişimi, nöral kök hücre çoğalması ve farklı nöral hücre tiplerine farklılaşmanın ince bir dengesine dayanır. Bu denge, transkripsiyon, transkripsiyon sonrası ve çeviri dahil olmak üzere birden fazla düzeyde ince ayarlı gen ekspresyonu ile sıkı bir şekilde kontrol edilir. Bu bağlamda, büyüyen bir kanıt kütlesi, nöral kök hücre kader kararlarının koordinasyonunda çeviri düzenlemesinin kritik bir rolünü vurgulamaktadır. Polizom fraksiyonasyonu, mRNA çeviri durumunun hem küresel hem de bireysel gen düzeylerinde değerlendirilmesi için güçlü bir araçtır. Burada, gelişmekte olan fare serebral korteksinden hücrelerde çevirisel verimliliği değerlendirmek için şirket içi bir polisome profilleme boru hattı sunuyoruz. Sükroz gradyan hazırlama, doku lizisi, ultrasantrifüjasyon ve mRNA çeviri durumunun fraksiyonasyona dayalı analizi için protokolleri açıklıyoruz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli beyninin gelişimi sırasında, sinirsel kök hücreler nöronlar oluşturmak için çoğalır ve farklılaşır ve glia1,2 . Bu sürecin pertürbasyonu, birçok nörogelişimsel bozuklukta görüldüğü gibi beyin yapısında ve işlevinde değişikliklere yol açabilir3,4. Nöral kök hücrelerin uygun davranışı, belirli genlerin düzenlenmiş ifadesini gerektirir5. Bu genlerin epigenetik ve transkripsiyonel kontrolü yoğun olarak çalışılmış olsa da, son bulgular diğer seviyelerde gen düzenlemesinin nöral kök hücre çoğalması ve farklılaşması 6 ,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan kullanımı Calgary Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından denetlendi. Deney için kullanılan CD1 fareleri ticari satıcıdan satın alındı.

1. Çözümlerin hazırlanması

NOT RNA bozulmasını önlemek için, RNase dekontaminasyon çözeltisi ile tezgahı ve tüm ekipmanları püskürtün. Deney için RNase içermeyen ipuçları kullanılır. Tüm çözümler RNase içermeyen suda hazırlanır.

  1. DMSO'da sikloeximide stok çözeltisi (100 mg/mL) hazırlayın ve -20 °C'de saklayın.
  2. RNase içermeyen suya 75,3 g sakkaroz ekleyerek ve hacmi 100 mL'ye yükselterek 2,2 M sakkaroz stok çözeltisi hazırlayın (~16 gradyan hazı....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir gösteri olarak, 75 μg RNA (8 embriyodan havuza) içeren kortikal lisat, sakkaroz gradyanı tarafından 12 fraksiyona ayrıldı. 254 nm'deki UV emicilik zirveleri, 40S alt birliğini, 60S alt birliğini, 80S monozomunu ve polizomlarını içeren fraksiyonları tanımladı (Şekil 4A). Büyük ribozomal alt bira için batı lekesi ile fraksiyonların analizi, Rpl10 60S alt birliği (fraksiyon 3), monozom (fraksiyon 4) ve polisomes (fraksiyonlar 5-12) (Şekil 4B)varlığını gösterdi........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polisome profilleme, çeviri durumunu hem tek gen hem de genom çapında değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan ve güçlü bir tekniktir14 . Bu raporda, ev yapımı bir platform ve gelişmekte olan fare korteksini analiz etmek için uygulamasını kullanarak polisome profilleme protokolü sunuyoruz. Bu uygun maliyetli platformun montajı ve yüksek hassasiyete sahip sağlam, tekrarlanabilir sakkaroz gradyanları ve polisome profilleme üretilmesi kolaydır.

Tutarlı ve kaliteli sakk.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma bir NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 to G.Y.) tarafından finanse edildi. G.Y. Kanada Araştırma Başkanı. S.K., Mitacs Globalink Lisansüstü Bursu ve ACHRI Lisansüstü Öğrenci Bursu tarafından finanse edildi.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL RNA içermeyen mikrotüplerAxygenMCT-150-C
10 cm çanakGreiner-Bio664160
1M MgCl2InvitrogenAM9530G
21-23G iğneBD305193
2M KClInvitrogenAM8640G
30 mL şırıngaBD302832
Künt uç iğneVWR20068-781
BreadboardThorlabsMB2530/M
Bromofenol mavisiSigma115-39-9
CD1 fareCharles River Laboratuvarı
Kavisli uçlu forsepsSigma#Z168785
SikloheksimidSigma66-81-9
Veri toplama yazılımı TracerDAQÖlçüm Hesaplama
Dijital dönüştürücüÖlçüm HesaplamaUSB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kitiZymoR2070
Dithiothreitol (DTT)Biyo-temel12-03-3483
DMSOBioshop67-68-5
Dumont No.5 forsepsSigma#F6521
Fraksiyon toplayıcıBio-RadModel 2110
HBSSWisent311-513-CL
Doğrusal kademeli aktüatörRattmmotorCBX1605-100A
Lusiferaz kontrolü RNAPromegaL4561
Maxima birinci iplikçik cDNA sentez kitiThemo FisherM1681
Minyatür V-kelepçeThorlabsVH1/M
Mini serisi breadboardThorlabs MSB7515/M
Mini seri optik direkThorlabsMS2R/M
Mini seri kaide direk tutucu tabanıThorlabsMBA1
NaClBio-basic7647-14-5
Nörobazal medyaGibco21103-049
Ø 12,7 mm alüminyum direkThorlabsTRA150/M
ParafilmBemisPM992
PerfeCTa SYBR yeşil fastmixQuanta BioCA101414-274
Fosfat tamponlu salin (PBS)Wisent311-010-CL
PuromisinBioshop58-58-2
Dik açılı kelepçeThorlabsRA90/M
Dik açı ve eğik çizgi; 1/2" ila ø 6 mm direk kelepçesiThorlabsRA90TR/M
Rnase AWAYMoleküler BiyoÜrünler7002
RNaz içermeyen uçlarFrogga BioFT10, FT200, FT1000
RNase ücretsiz suWisent809-115-CL
RNasinPromegaN2111
İnce dik açılı braketThorlabsAB90B/M
Küçük V-kelepçeThorlabsVC1 / M
Sodyum deoksikolatSigma302-95-4
Step motor sürücüsüSongHeTB6600
SükrozBioshop57501
SW 41 Ti rotorBeckman Coulter331362
Şırınga pompasıHarvard Aparatı70-4500
Şırınga pompasıHarvard Aparatı70-4500
Triton-X-100Biyo-temel9002-93-1
TrizolThermofisher Bilimsel15596018
Tüp deliciBrandelBR-184
UltrasantrifüjBeckman CoulterL8-70M
Ultrasantrifüj tüpleriBeckman Coulter331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5Invitrogen15567-027
UNO projesi süper başlangıç kitiElegooEL-KIT-003
UV monitörüBio-RadEM-1 Econo
Dikey braketThorlabsVB01A/M

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
  2. Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Polysome ProfilingTranslational RegulationMouse Brain DevelopmentSucrose GradientNeural Stem CellsmRNA TranslationUltracentrifugationFraction CollectionRibosomal SubunitsWestern Blot

Related Articles