Method Article

Kombine Ozon ve LPS kaynaklı Murine Akut Akciğer Hasarı Sırasında Akciğer Hücresel Adaptasyonlarının Görselleştirilmesi

DOI:

10.3791/62097

⸱

March 21st, 2021

 ,  , 
1Small Animal Clinical Sciences, Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kombine ozon ve bakteriyel endotoksin maruz fareler nötrofiller de dahil olmak üzere geniş yayılmış hücre ölümü gösterir. Sitoskeletal lamellipodia'nın bozulması, karmaşık V ATP sintaz alt β birliğinin hücresel ekspresyonunun artması ve bronko-alveoler lavajda anjiyostatin, akciğer immün yanıtının baskılanması ve nötrofil alımının gecikmesi gibi hücresel adaptasyonları gözlemledik.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akciğerler sürekli olarak steril (parçacıklar veya reaktif toksinler) ve enfeksiyöz (bakteriyel, viral veya mantar) enflamatuar durumlar şeklinde doğrudan ve dolaylı hakaretlerle karşı karşıya kalır. Ezici bir konak yanıtı, pato-mantıksal konak immün, pıhtılaştırıcı ve doku remodeling yanıtının bir sonucu olarak akciğer nötrofil alımı ile karakterize olan solunum ve akut akciğer yaralanması ile sonuçlanabilir. Bir TLR4 agonisti olan bakteriyel lipopolisakkarit ile birlikte güçlü bir çevresel kirletici olan düşük doz (0,05 ppm) ozona yanıt olarak, murine akciğer hücresel adaptasyonlarını görselleştirmek ve ölçmek için hassas mikroskobik yöntemler, konakçı enflamatuar ve onarım mekanizmalarını anlamak için çok önemlidir. Çeşitli akciğer ve sistemik vücut bölmelerinin, yani bronko-alveolar lavaj sıvısının, akciğer vasküler perfüzyonunun, sol akciğer kriyoseksiyonlarının ve sternal kemik iliğinin perfüzyonunun kapsamlı bir floresan mikroskobik analizini açıklıyoruz. Analiz edilen bölmelerde ayrık kemokin gradyanları ile işaretlenen gecikmiş (36-72 saate kadar) immün yanıt ile korelasyonda alveoler makrofajlar, nötrofiller, akciğer parenkimal dokusunun yanı sıra kemik iliği hücrelerinin hasarını gösteriyoruz. Ek olarak, akciğer hücre dışı matris ve hücresel sitoskeletal etkileşimler (aktin, tubulin), mitokondriyal ve reaktif oksijen türleri, pıhtı önleyici plazminojen, anti-anjiyojenik peptit parçası anjiyostatin, mitokondriyal ATP sintaz kompleks V alt ünlemleri, α ve β sunuyoruz. Bu taşıyıcı belirteçler, yeterli in vitro hücre bazlı tahliller ve intravital mikroskopi gibi in vivo hayvan görüntüleme teknikleri ile desteklendiğinde, yeni immünomodülatör ajanlara akciğer yanıtını anlamaya yönelik hayati bilgiler sağlayabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akut akciğer hasarı (ALI), pıhtılaştırıcı, fibrinolitik ve doğuştan gelen bağışıklık sistemlerinin eşzamanlı aktivasyonu ile işaretlenen akciğerlerin enfeksiyöz veya diğer zararlı uyaranlara verdiği önemli bir patolojik yanıttır1. Nötrofiller, Toll benzeri reseptör (TLR) ailesi2,3,4aracılığıyla mikrobiyal ve hücre içi hasar kalıplarını derhal algılar. Nötrofiller önceden biçimlendirilmiş sitokinleri ve sitotoksik granül içeriğini serbest bırakır ve bu da daha sonra kollateral doku hasarına neden olabilir. Ortaya çıkan alveolar hasar, adenozin trifosfat (ATP)5gibi moleküllerin salınmasıyla yol açan ikincil hücre ölümü ile gölgelenir, böylece bağışıklık düzensizliğinin kısır bir döngüsüne girer.

ALI'nin anlaşılmasında çözülmemiş bir sorun, yaralanmanın alveolar membran içinde nasıl başlatıldığı sorusuyla ilgilidir. Elektron taşıma kompleksi V, F1F0 ATP synthase, iltihaplanma sırasında hücre (endotel, lökosit, epitel dahil) plazma zarı üzerinde her yerde ifade edildiği bilinen bir mitokondriyal proteindir. Aktin ve tübulin içeren hücre sitoskeleton, sırasıyla mitokondriyal proteinlerin yanı sıra birçok hücre şekli ve fonksiyon modülasyonunu barındırır. Son zamanlarda atp sintaz endojen molekül tarafından abluka göstermiştir, anjiyostatin, nötrofil işe alımını susturur, aktivasyon ve lipopolisakkarit (LPS) indüklenmiş akciğer iltihabı6. Böylece, hem biyokimyasal (ATP sintaz) hem de immün (TLR4) mekanizmalar akciğer iltihabı sırasında alveoler bariyeri düzenleyebilir.

Çevresel bir kirletici olan ozona (O3)maruz kalmak akciğer fonksiyonlarını bozar, pulmoner enfeksiyonlara duyarlılığı arttırır ve kısa düşük O3 maruziyetleri alttaki kardiyorespiratuar koşulları 7 , 8 ,9 ,10,11,12, 13,14olanlarda mortalite riskini arttırır. Bu nedenle, fizyolojik olarak ilgili O3 konsantrasyonlarına maruz kalmak, temel inflamasyon mekanizmalarını incelemek için anlamlı bir ALI modeli sağlar7,8. Laboratuvarımız son zamanlarda düşük doz O3 indüklenmiş ALI15bir murine modeli kurmuştur. Düşük O3 konsantrasyonlarına bir doz ve zaman tepkisi yaptıktan sonra, 2 saat boyunca 0.05 ppm O3'e maruz kalmanın, LPS modeline benzer şekilde akciğer ATP sintaz kompleks V alt bir β liği (ATPβ) ve anjiyostatin ekspresyosu ile işaretlenen akut akciğer yaralanmasına neden olduğunu gözlemledik. İntravital akciğer görüntülemesi, akciğer hasarına işaret eden alveolar aktiin mikrofilamentlerinin dağınıklığını ortaya çıkardı, ve alveolar septal reaktif oksijen türlerinin (ROS) seviyelerinin (temel hücre sinyalinin kırılmasını gösteren) ve mitokondriyal membran potansiyelinin (akut hücre ölümünü gösteren) heterojen akciğer 18 FDG tutma16,nötrofil alımı ve sitokin salınımı ile ilişkili olan 0,05 ppm O315'e 2saat maruz kaldıktan sonra ablasyonu, özellikle IL-16 ve SDF-1α. Son çalışmalarımızdan eve götür mesajı, O3'ün insan maruziyeti için 8 saat (günde) üzerinde 0.063 ppm'lik izin verilen sınırların altındaki konsantrasyonlarda maruz kaldığında katlanarak yüksek toksisite ürettiğidir. Daha da önemlisi, bu alt klinik O3 maruziyetlerinin bakteriyel endotoksin17gibi TLR4 aracılı mekanizmaları modüle edip etmeyeceği konusunda net bir anlayış yoktur. Böylece, çift isabetli bir O3 ve LPS maruz kalma modelini inceledik ve immün ve bağışıklık dışı hücresel adaptasyonları gözlemledik.

Çeşitli akciğer ve sistemik vücut bölmelerinin, yani bronko-alveolar lavaj sıvısının (yani, BAL) lavajlı akciğer dokusunda kalan yerleşik parankimal ve yapışık lökositlere bakmak için alveolar boşlukları, akciğer damar perfüzyonlarını (yani LVP) örnekleyen akciğer damar perfüzyonu (yani, LVP) endotel bariyerinin tehlikeye girmesi durumunda alveolar septal interstisyumu, sol akciğer kriyoseksiyonlarını örnekleyen , dolaşımdaki lökositleri temsil eden periferik kan ve inflamasyon sırasında hematoetik hücre mobilizasyonunun proksimal ve distal bölgelerini örnekleyen sternal ve femur kemik iliği perfüzyonları.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma tasarımı Saskatchewan Üniversitesi Hayvan Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylandı ve insancır hayvan kullanımı için Kanada Hayvan Bakımı Konseyi yönergelerine bağlı kalındı. Altı-sekiz haftalık erkek C57BL/6J fareler temin edildi. NOT: Planlanan bitiş noktasından önce şiddetli uyuşukluk, solunum sıkıntısı veya diğer şiddetli sıkıntı belirtileri gelişen hayvanları ötenazi edin.

NOT: Aşağıdakileri hazırlayın: 27-18 G iğne körelmiş (fare trakeal çapına bağlı olacaktır), künt iğneye uyacak şekilde uygun boyutta PE boru (her fare için bir PE kanül yapın), kanül, 2 keskin makas, 2 künt forseps (küçük), 1 keskin forseps (küçük), 3 1 mL şırınga, etiketli mikroyakıt tüpleri (BAL, kan, damar ve kemik iliği perfüzyon toplama için) ve etiketli şişeler (doku fiksasyonu için), doku toplama için örnek torbalar / cryovials, kasap pamuk ipliği rulosu (yeterli büyüklükte ligatürlere kesilmiş). Deneyler için kullanılan tüm kimyasallar Malzeme Tablosunda belirtilmiştir.

1. Murine akciğer hasarının indüksiyonu için ozon ve LPS maruziyetleri

  1. Ozon maruziyeti
    1. Özel bir O3 indüksiyon kutusu hazırlayın. Fare yemi, su şişesi, zenginleştirme oyuncakları ve temiz yatak takımlarını sırayla ekleyin ve farelerin barınma ortamını taklit edin.
      NOT: Bu adımlar, farelerin özel indüksiyon kutusunda barındırıldığında yiyecek ve suya ücretsiz erişmelerini sağlayacak ve gereksiz stresi hafifletmeye yardımcı olacaktır.
    2. UV lambasını elden önce stabilize etmek için O3 kalibratörünü/jeneratörünü "ON" (giriş portuna doğru yerleştirilmiş) değiştirin (pozlamalardan yaklaşık 15 dakika önce) ve hat içi O3 monitöre bağlayın.
      NOT: O3 monitör, sabit oda hava sıcaklığında (72 ±3 °F) ve bağıl nemde (%50±15) çıkıştan örneklenerek ortalama 0±05 ppm okumalıdır.
    3. O3 pozlamaları için, fareleri özel indüksiyon kutusuna hafifçe yerleştirin ve fareleri sürekli olarak 2 saat boyunca 0,05 ppm O3'e maruz bırakın.
  2. Anestezi ve intranazal LPS yönetimi
    1. Ketamin ve kslazin için ayrı ayrı 10 mg/mL stok hazırlayın.
    2. 20 parça ketamin ve 1 parça ksilazini karıştırarak bir kokteyl hazırlayın. Fare X g ağırlığındaysa, periton boşluğuna (X/200) mL ketamin/ksilazin kokteyli enjekte edin. Bir fare için, 10 mg / mL ketamin stoğunun 1000 μL'sine ve ksilazin stoğunun 50 μL'sine oluşan 1 mL kokteyl hazırlayın. Bir mikro yakıt tüpünde yukarı ve aşağı pipetleme yaparak iyice karıştırın.
      NOT: Ketamin ve ksilazin stokları bir hafta önceden hazırlanabilir.
    3. Fareleri hafif intraperitoneal (IP) ketamin (50 mg/kg)/ksilazin (1 mg/kg) karışımı altında uyuşturun (örneğin, 25 g fare için kokteylin 0,125 mL'sini enjekte edin).
    4. Salin içinde 1 mg / mL LPS çözeltisi hazırlayın ve çözeltinin 50 μL'yi bir pipette doldurun.
    5. Fareyi avuç içinde sırt/sırt tarafıyla dik tutun, kulakları aynı elle tutun. Şimdi, LPS çözeltisinin 50 μL'si18 hafifçe burun deliklerinin dışına yerleştirin (yani, her burun delicinde 25 μL veya bir burun deliğinde 50 μL; prosedür hızlı olduğu sürece önemli değildir) ve farelerin LPS çözeltisini solumasına izin verin.
    6. Kontrol farelerini 50 μL steril salin ile aşıla.
      Dikkat: Aşılama için ölümcül olabilecek 100 μL'den fazla olmayın. Çok az hacim (yani, <50 μL) ve sadece burun birikimi riski vardır.
    7. LPS yönetimini takiben, fareleri yavaşça, midelerine veya sırtlarını başlarını hafifçe aşağı bakacak şekilde yatak yığınına yatırın.
      NOT: Bu yönelim, çözeltinin burun boşluğunda tutulmasını uzatır19.
    8. Maruziyetten sonra 0, 2, 4, 24, 36 ve 72 saat'te, fareleri tam doz ketamin (200 mg/ kg) / ksilazine (4 mg / kg) karışımı (örneğin, X'in gram olarak fare ağırlığı veya 25 g fare için 0.50 mL olduğu kokteylin X / 50 mL) ile uyuşturun.
    9. Fareyi bilincini ve doğru refleksi kaybedene kadar gözlemleyin (yani, sırtüstü pozisyonda yatırıldığında geri dönmez). Şimdi, 1-2 dakika sonra gözle görülür şekilde düşmesi gereken solunum (ritmik göğüs gezileri) ve kalp atış hızını izleyerek fareyi anestezi derinliği açısından kontrol edin.
    10. Daha sonra, pedal reflekslerini kontrol edin, yani arka uzuv basamaklarından birini kıstırın ve bir refleks olarak uzuvların geri çekilmesini gözlemleyin. Fare yanıt verirse, gerektiğinde ek 0,1 mL enjeksiyonları veya daha fazlası ile yükleme.
      NOT: Derin anestezi elde etmek için, bazı suşların veya obez farelerin genellikle daha büyük bir dağılım hacmine sahip olduğunu ve bu nedenle tam anestezi için yeterli zaman izin verilmezse (yaklaşık 10 dakika veya daha fazla olabilir) kolayca aşırı yapılabilir. Buna göre, bazı suşlar anesteziye karşı dirençli olabilir ve bu nedenle daha fazla yükleme gerektirir. Bu bilgi, farklı suşlardan ve yaştaki farelerle birçok pratik gözlem ve deneyimden sonra edinilir. O 3 ve LPS maruziyetlerinden hemen sonra (yani2 saat zaman noktasında) birkaç pilot deney de yapıldığı için, kombine O3ve LPS maruziyetinin hemen etkilerini vurgulamak için bu deneylerden bazı çok erken BAL hücre analizlerini de dahil ettik.

2. Örnek toplama

  1. Fareyi cerrahi tepsiye yerleştirin. Şimdi, sıvı kaybını önlemek ve fareyi% 70 etanol spreyi ile sterilize etmek için her iki göze de yağlama göz merhemini hafifçe koyun.
    1. Trakea ve toraksı ortaya çıkarmak için üst ve alt deri zarlarını makasla küçük kesikler yapın.
    2. Göğüs kemiğinin hemen altında bir kesik yapın ve kalbi açığa çıkarın.
  2. Kardiyak delinme
    1. Heparinize şırıngaya bağlı bir 25G iğneyi sağ ventriküle yerleştirin ve kalp delinmesi ile kan alın.
      NOT: Kalbi kalp delinmesine maruz kalma süresi bir dakikanın altındaysa, kan genellikle minimum piston çekilmesi ile çekilir. Yaklaşık 0.4-0.5 mL topladıktan sonra, kalan kanı toplamadan önce birkaç saniye duraklamanız gerekebilir. Bu, kalbin kalan herhangi bir hacmi sağ ventrikül odasına pompalamasına izin vermek için yapılır. Kan toplamanın sonunda, kalp pompalamak için durur.
    2. Kanı toplayın ve daha fazla işlem için mikroyapı tüplerinde saklayın.
  3. Trakeostomi
    1. Trakeal bölgeyi aşırı dokudan temizlemek için cımbız /künt tokmakları dikkatlice kullanın. Kanamayı önlemek için eldivenli elleri cerrahi aletlerden daha fazla kullanın. Çok fazla kan sızıyorsa, BAL örneklerini kirletme riski vardır. Tercih olmasa da gerekirse pamuklu çubuk kullanın. Kimwipes daha iyi alternatifler.
    2. Şimdi, akciğerleri açığa çıkarmak için göğüs kafesini kesin. Yine, sternumu ve interkostal arterleri veya yükselen aortu kesmemek için dikkatli olun; göğüs kafesi boyunca ilerlerken daha küçük kesikler yapmak)
    3. Nefes borusunun altına pamuklu bir bağ geçirin ve şimdilik bu şekilde bırakın.
    4. 28 G trakeal bir kolayın erişimine izin vermek için nefes borusunun distal 1/3rd kısmında akciğerlere doğru işaret ederek uygun bir yerde kırpın.
    5. Nefes borusuna 28 G PE'lik bir kolayil (minimum 3-5 mm uzunluğunda ve takma kolaylığı için kesilmiş distal uç) yerleştirin. Çatallanmadan önce nefes borusunun ucuna dikkat edin ve ardından sadece tek lob örneklemeyi önlemek için yaklaşık bir mm geri çekin.
    6. Kanülü yerinde tutmak için pamuk bağını sıkıca bağlayın. Canülleri çökertme.
  4. Bronko-alveolar lavaj (BAL)
    1. 0,5 mL PBS'yi 1 mL şırınna doldurun.
    2. Şimdi yavaş yavaş 1 mL şırınna yardımıyla 0,5 mL PBS'yi kanolaya enjekte edin.
    3. PBS enjekte ettikten sonra, emişe direnmediği sürece şırınnayı epire edin.
      NOT: BAL sıvısını çıkarırken direnç varsa, bu alveolar veya bronş dokusunun çökmesini gösterir. Bu durumda, kanolün doku duvarlarını ayırmak için bir miniscule tarafından kanolü geri çekin.
    4. Aspire sıvıyı etiketli bir mikroyakıt tüpünde toplayın ve buza yerleştirin.
    5. Aynı şişede toplamada benzer şekilde iki lavaj daha gerçekleştirin (yani, toplam 0,5 X 3 = 1,5 mL lavaj).
    6. Toplanan BAL sıvısının hacmini ölçün. Lavaj iyileşmesi % 90'a yakın olmalıdır.
  5. Akciğer vasküler perfüzyon (LVP)
    1. Sağ ventrikülden perfüzyon yaparken akciğerlerde perfüzyonun herhangi bir şekilde yedeklenmemesi için, torasik ve karın yarıları arasındaki bir yerde alçalan torasik aortu kesin.
    2. Kesilen aort ucunun yakınındaki boşluğu kansız olarak lekele.
    3. Daha sonra, akciğerleri sağ ventrikülden enjekte edilen 0,5 mL oda sıcaklığında heparinize salin ile perfuse edin.
    4. Vasküler perfüzyonu, azalan torasik aortun kesik ucundaki boşluktan, buza yerleştirilmiş bir mikrofuge tüpünde toplayın ve hacmini ölçün.
    5. Sağ bronş proksimalini trakeadan dallanmalarına kadar (pamuk ipliği ile) ligat edin.
  6. In situ sol akciğer fiksasyonu
    1. 1 mL'lik bir şırınnayı trakeal kanamaya bağlayın, bu da önceki trakeal kesiden geçecek kadar uzundur.
    2. Şırınnada 0,6 mL işaretine kadar havayı geri çekin.
    3. Daha sonra, kalan şırınnayı (sonuna kadar) oda sıcaklığında% 2 paraformaldehit ile doldurun. Pistonun kanülden herhangi bir hava emmeden çıkmaya hazır olduğundan emin olun.
    4. Şimdi, şırınnayı 20 cm yüksekliğe kadar ölçülen dik bir kaba bir viski bandı ile yapıştırın.
    5. Yavaş yavaş, sabitleyicinin nefes borusuna doğru akmasını sağlamak için pistonu dışarı çekin. Kanonda birkaç hava kabarcığı olması durumunda, pistonu şırıncığın üzerine hafifçe yerleştirin ve sıvı birkaç saniye sonra akmaya başlayacaktır.
    6. Sol akciğerin 20 cm'lik bir su sütunu oluşturan 20 cm yükseklikten 5 dakikaboyunca toplam kapasitesine in situ şişmesine izin verin.
    7. Bu işlem sırasında, sağ akciğer loblarını paraformaldehit ile temas etmesini önleyin, çünkü bu durum aşağı akış testlerini etkileyecektir.
    8. Sağ akciğer loblarıyla temas edebilecek herhangi bir paraformaldehiti emmek için katlanmış laboratuvar dokuları yerleştirin.
      DİkKAT: Paraformaldehit oldukça zehirlidir. Bu nedenle, vücudun maruz kalan herhangi bir yerine soluma veya temas etmeyin. Kullanım yaparken çok dikkatli olun.
    9. Paraformaldehit aşılaması sırasında, karnı sterilize edin.
    10. Herhangi bir ipliği çıkardığınızdan emin olarak sağ akciğer loblarını trakeadan kesin ve lobları hemen etiketli bir cryovial içine koyun ve akciğer homojenliğinin aşağı akış moleküler / biyokimyasal sitokin analizi / RT-PCR / batı blot analizi için sıvı nitrojene bırakın.
    11. Herhangi bir bağ dokusu veya plevral membran için sol akciğeri dikkatlice kesin ve 4 °C'de 24 saat boyunca% 2 paraformaldehit içine batırın.
    12. Sabit akciğeri standart gömme protokolüne göre parafin içine gömün.
      Dikkat: Akciğer örneklerini aşırı ısıtmayın.
    13. Karın kısmını kesin ve pelvik (kalça) kemikten derisini sönümleyin.
    14. Sol ve sağ uyluk kemiği kemiklerini pelvik kısımdan, buzda tutulan tuzlu su dolu bir petri kabında ayırın.
  7. Sternal ve femur kemik iliği aspirat koleksiyonu
    1. Laboratuvar dokularını kullanarak kemiklerin dokusunu ve kaslarını temizleyin.
    2. Ventral göğüs kafesi ve sternumu buzda tutulan tuzlu su dolu petri kabına toplayın.
    3. Sternal ve femur kemiklerinin distal ve proksimal uçlarını kesin.
    4. Kemikleri 1 mL şırıngaya iyi yerleştirilmiş iğneler (24 ila 28 G) kullanarak 0,5 mL salin ile 4 kez perfuse edin ve her kemikten fraksiyonları filtrelerle donatılmış ve buza yerleştirilmiş etiketli tüplere toplayın.
      NOT: İğne göstergesi hayvan boyutu arasında değişir. Kızardıktan sonra, uyluk kemiği şeffaf gösterilmelidir.
    5. Numuneler toplandıktan sonra, fareyi plastik bir torbaya koyun ve kurumsal hayvan tesisinin yönergelerine uygun şekilde uygun şekilde bertaraf edilmek üzere bir hayvan karkası dondurucusunda koyun.

3. Örnek işleme

  1. Toplam (TLC) ve diferansiyel (DLC) lökosit sayımları
    1. Santrifüj periferik kan, BAL, akciğer vasküler perfüzyon ve kemik iliği (sternal ve femur) örnekleri 10 dakika boyunca 500 g.
    2. Süpernatantları toplayın, flaşla dondurun ve bir sonraki analize kadar -80 ° C'de saklayın.
    3. Hücreleri en az 200 μL PBS içinde yeniden inşa edin.
    4. Hemositometrede BAL, kan, akciğer vasküler perfüzat ve kemik iliği hücrelerini sayarak TLC yapın.
    5. Hücre içi esteraz aktivitesi nedeniyle canlı (yeşil) hücreleri ve plazma zar bütünlüğünün kaybı nedeniyle zarar görmüş BAL hücrelerini (kırmızı) ölçmek için bal'ın 9 μL'lik bir aliquotunu 1 μL'lik bir kalsein yeşili ve kırmızı ethidium homodimer-1 karışımı ile lekelenin.
    6. Lyse RBC'lere% 2 asetik asit ekleyin, kan TLC için 1:10 oranında ve akciğer vaskülerperfüzat TLC için 1:2 oranında.
      DİkKAT: Konsantrasyon mL başına 1x106 hücreden fazlaysa (kemik iliği örnekleri için çok önemlidir) PBS'de seyrelterek hücre konsantrasyonlarını ayarlayın.
    7. DLC'ler için aşağıda açıklandığı gibi slaytlarda ve lekelerde sitospinler hazırlamak için hücreleri santrifüjleyin.
      NOT: Genellikle, bir slaytta iki sitospin hazırlanabilir. Ve 10-15 dakika hava kuruduktan sonra, lekeleme adımı ile devam edin.
    8. Toplanan BAL'ı grup başına üç pilot fareden her biri iki sitospin ve aktif oksidatif fosforilasyonlu (azaltılmış mitotracker) aktin/ tübülin ve mitokondri lekesine bölün. NK1.1/Gr1/CX3CR1 ve ATPβ/Ki-67/CD61/Angiostatin lekeli slaytlar için bal'ı üç fareden daha kullanarak her biri iki sitospin'e bölün. BAL'ı üç fareden daha atpα/Ly6G ve CX3CR1/Siglec-F için leke yapmak üzere iki sayaca bölün.
  2. Bronkoalveoler lavaj (BAL) ve Akciğer Vasküler Perfüzyon (LVP) toplam protein nicelemesi
    1. İki pulmoner bölmedeki (yani alveolar septal (interstisyel) ve akciğer vasküler perfüzyon (vasküler) bölmelerdeki vasküler bariyerin O3 ve LPS kaynaklı pertürbasyonlarını veya bağıl onkotik basıncı ölçmek için toplanan sıvılardaki toplam protein içeriğini ölçün.
    2. Çözülen süpernatant fraksiyonları, standart bir deterjana dayanıklı kolorimetrik test kullanarak toplam protein konsantrasyonları için analiz edin.
    3. Bronkoalveoler lavaj (BAL) ve akciğer vasküler perfüzyon (LVP) kemokin analizi
      1. Daha sonra, BAL ve akciğer vasküler perfüzyon (LVP) süpernatantlarındaki kemokinleri 33 yönlü manyetik boncuk bazlı bir immünoassay kullanarak analiz edin. Bu, kombine maruziyetlerden sonra kurulan hava yolu/intersitium vs vasküler kemokin gradyanlarının yönü hakkında bilgi verecektir.
      2. Analyze the following panel of chemokines : CXCL13 (B-lymphocyte chemoattractant), CCL27 (IL-11 R-alpha-locus chemokine (ILC)), CXCL5 (epithelial-derived neutrophil-activating peptide 78 (ENA-78)), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-24), CX3CL1 (fractalkine), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (interferon gamma), IL-10 (interleukin-10), IL-16 (interleukin-16), IL-1β (interleukin-1 beta), IL-2 (interleukin-2), IL-4 (interleukin-4), IL-6 (interleukin-6), CXCL-10 (interferon gamma-induced protein 10 (IP-10)), CXCL11 (Interferon-gamma-inducible protein 9 (IP-9)), KC (keratinocyte chemoattractant), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), MCP-3 (monocyte chemoattractant protein-3), MCP-5 (monocyte chemoattractant protein-5), MDC (macrophage-derived chemokine (CCL22)), MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1 alpha), MIP-1β (macrophage inflammatory protein-1 beta), MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2), MIP-3α (macrophage inflammatory protein-3 alpha), MIP-3β (macrophage inflammatory protein-3 beta), RANTES (aktivasyonda düzenlenir, normal T hücresi eksprese edilmiş ve salgılanmış (CCL5)), CXCL-16, CXCL-12/SDF-1alpha (stromal hücre türevi faktör 1), TARC (timus ve aktivasyon düzenlenmiş kemokin (TARC)), TECK (Timus Eksprese Edilmiş Kemokin (CCL25)) ve TNFα (tümör nekroz faktörü alfa).

4. Sitospin lekeleme ve akciğer histolojisi

  1. Sitospin biyokimyasal boyama
    1. İşlem sırasında inkübasyon için kimyasalları içermek için sitospinleri hidrofobik bir kalemle çevrele.
    2. Sitospinleri PBS'de 5 dakika boyunca yeniden sulayın.
    3. Sitospin örneklerini 10 dakika boyunca% 2 paraformaldehitte sabitleyin, her biri 5 dakika PBS ile üç kez yıkayın.
    4. Buz gibi % 70 aseton ile 7 dakika permeabilize edin ve tekrar PBS ile her biri 5 dakika üç kez yıkayın.
    5. Actin ve tubulin veya azaltılmış Mitotracker için leke (yeşil renkte gösterilen 2 μg/50 μL Alexa 488 konjuge phalloidin karışımı ile kuluçkaya yatır ve 2 μg/μL Alexa 555 konjuge fare anti-α tubulin veya azaltılmış Mitotracker, kırmızı ile gösterilir) 15 dakika boyunca.
      NOT: Tübulin boyama protokolünü doğrulamak için ayrı bir sitospin içinde fare IgG1 izotip kontrol antikoru kullanın. 4.1.1 ile 4.1.8 arasında açıklanan adımları uygulayın, ancak izotip kontrolleri için.
    6. Karışımı slayttan hafifçe devirerek lekeleri çıkarın. Slaytları DAPI (4′, 6-diamidino-2-fenylindole) ile 5-10 dakika boyunca nuclei lekeleyin.
    7. Sitospinleri PBS ile her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın, solmaya karşı montaj ortamı ile kapakçık yapın ve görüntülemeden önce oda sıcaklığında gece boyunca karanlıkta saklayın.
    8. Bilimsel bir kamera ile donatılmış geniş alanlı dik mikroskop altında görüntüler elde edin. Slaytları görüntülerken farklı floresan kanallar için tutarlı kamera pozlama sürelerinin ayarlandığından emin olun.
  2. Sitospin immün floresan boyama:
    1. İşlem sırasında inkübasyon için kimyasalları içermek için sitospinleri hidrofobik bir kalemle çevrele. Sitospinleri PBS'de 5 dakika boyunca yeniden sulayın.
    2. Sitospin örneklerini 10 dakika boyunca% 2 paraformaldehitte inkübe ederek sabitleyin, her biri 5 dakika PBS ile üç kez yıkayın.
    3. 2 dakika boyunca% 0.1 soğuk triton X-100 ile permeabilize edin, pbs ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
    4. Daha sonra, Fc blok antikor stoğunun 1:50 seyreltilmesi ile sitospin inkübe ederek 15 dakika boyunca Fc bloğu (birincil fare antikorunun özellikle fare Fc antikorları ile çapraz tepki vermemesini sağlamak için).
    5. Fc bloğunu çıkarmak ve 30 dakika boyunca 3 birincil ilgi antikoru (çeşitli kombinasyonlar için Tablo 1'e bakın) karışımıyla sitospin için% 1 BSA'ya değiştirmek ve kuluçkaya yatırmak için slaytlara bahşiş verin.
      NOT: Son çalışmamızda tartışıldığı gibi karşılık gelen ikincil antikorlara paralel olarak izotip kontrol antikorlarını (4.2.1 ila 4.2.9 adımlarını gerçekleştirerek ve antikorları izotip kontrolleriyle değiştirerek bir karışım fare IgG1 ve sıçanIgG2bkappa primer antikorları ile kuluçkaya yatırmayı unutmayın) çalıştırın.
    6. PBS ile her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın. Sitospinleri uygun şekilde tasarlanmış ikincil antikorların bir karışımıyla kuluçkaya yatırın (ayrıntılar için lütfen Tablo 1'e bakın).
    7. Karışımı slayttan hafifçe devirerek lekeleri çıkarın, çekirdekleri lekelendirmek için 5-10 dakika boyunca DAPI (4′, 6-diamidino-2-fenylindole) ile kuluçkaya yatırın. PBS ile her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
    8. Solmaya karşı montaj ortamına sahip kapakçık ve görüntülemeden önce gece boyunca oda sıcaklığında karanlıkta saklayın.
    9. Bilimsel bir kamera ile donatılmış geniş alanlı dik mikroskop altında görüntüler elde edin. Slaytları görüntülerken tüm florofor kanalları için tutarlı kamera pozlama sürelerinin ayarlandığından emin olun.
  3. Hematoksilin ve eozin (H&E) histolojisi
    1. Tüm gruplar için akciğer kriyo bölümlerinde değiştirilmiş H&E boyama3 gerçekleştirin.
  4. Görüntü analizi
    1. Fiji ImageJ açık yazılımındaki (https://imagej.net/Fiji/Downloads) görüntü verilerini (.tiff) işleyin ve analiz edin.
    2. Analiz sekmesi ve Ölçümleri Ayarlaaltında kaydedilecek gerekli parametreleri (Alan, Çevre, Tümleşik Yoğunluk, Şekil tanımlayıcıları, Feret çapı, Döngüsellik, Ekran etiketi) kontrol edin.
    3. Yatırım getirisi yöneticisinikullanarak, "serbest seçimler" aracını kullanarak birleştirilmiş görüntü panelinde yaklaşık 50-200 hücreyi manuel olarak özetleyin. Ctrl+T komutuyla ilgi alanlarını (ROI) kaydedin ve her hücre için kaydedilen ROI'leri tüm florofor kanallarına kopyalayın.
    4. Ardından, tüm floresan kanalların önceden ayarlanmış parametrelerini ölçmek için Ctrl+M tuşlarına basın (örn. 405 nm (mavide DAPI veya ATPβ), 488 nm (actin veya NK1.1 veya ki-67 yeşil), 568 nm (tubulin veya Gr1 veya CD61 kırmızı) ve 633 nm (macenta'da CX3CR1 veya angiostatin)).
    5. Sonuçları, çözümleminizi temsil eden uygun bir adla .csv dosyası olarak kaydedin. sonuçları .csv dosyasından bir elektronik tabloya kopyalayın ve lekeli molekülün floresan yoğunluğunu (SONUÇLAR dosyasından Ham Entegre Yoğunluk sütunu olan) boyama tasarımına göre DAPI veya CD61 FI'ye bölün. Bu oranlar "DAPI veya CD61 normalleştirilmiş FI oranları" olarak terimlendirilir.
    6. Daha sonra, kombine O3 ve LPS maruziyeti sonrasında hücre boyutundaki herhangi bir değişikliği değerlendirmek için bu normalleştirilmiş oranları, döngüselliği, hücre çevresini ve Feret çapını çizin.
    7. Toplanan verilerin normalliğini kontrol etmek ve boş hipotezi test etmek için uygun istatistiksel yazılımı kullanın (lütfen aşağıdaki istatistiksel analiz bölümüne bakın).
  5. İstatistiksel Analiz
    1. Sonuçları SEM ± ortalama olarak ifade edin. Grup başına en az üç fare kullanıldı.
    2. Kemokin veri analizi için, Benjamini ve Hoshberg düzeltmesine göre yanlış keşif oranı için tek yönlü ANOVA p değerlerini ayarlayın.
    3. Görüntü parametrelerini, hücreselliği, Feret çapı, çevreyi, DAPI veya CD61 normalleştirilmiş floresan yoğunluk oranlarını Mann-Whitney U testi (iki grubu karşılaştırmak için) veya Kruskal Wallis testi (birden fazla grubu karşılaştırmak için) ile analiz edin, çünkü bu veriler normalde dağıtılmamıştır.
    4. Görüntüleme deneylerinin geri kalanı için, sonuçları Sidak'ın çoklu karşılaştırmalarının ardından tek yönlü bir varyans analizi kullanarak analiz edin. p-değerleri <0.05 önemli kabul edildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kombine O3 ve LPS maruziyeti 72 saatte sistemik inflamasyona ve kemik iliği mobilizasyona yol açar: Farklı bölmelerdeki hücre sayıları periferik kanda önemli değişiklikler ve kombine O3 ve LPS maruziyetlerinde uyluk kemiği iliği toplam hücre sayılarında önemli değişiklikler olduğunu ortaya koydu. Kombine O3 ve LPS maruziyetleri toplam BAL (Şekil 1A) veya LVP ( Şekil1B)...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut çalışmada sunulan yöntemler, akciğer iltihabı sırasında birden fazla hücresel olayı incelemek için çoklu bölme analizinin yararlılığını vurgulamaktadır. Bulguları Özetledik Tablo 2. Biz ve birçok laboratuvar, akciğer nötrofillerinin hızlı bir şekilde işe alınmasıyla işaretlenen intranazal LPS aşılamasına verilen murine yanıtı kapsamlı bir şekilde inceledik, bu da 6-24 saat arasında zirve yaptı ve ardından çözünürlük devreye girer. Ve son zamanlarda, alt klinik O3'ün (2 saat için 0,05 pp...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların çıkar çatışması veya açıklama yapmalarına gerek yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yapılan araştırma, Başkan'ın NSERC hibesinin yanı sıra Sylvia Fedoruk Kanada Nükleer İnovasyon Merkezi'nden başlangıç fonları ile finanse ediliyor. Sylvia Fedoruk Kanada Nükleer İnovasyon Merkezi Innovation Saskatchewan tarafından finanse ediliyor. Floresan görüntüleme, NSERC tarafından finanse edilen WCVM Görüntüleme Merkezi'nde gerçekleştirildi. Jessica Brocos (MSc Student) ve Manpreet Kaur (MSc Student), Sylvia Fedoruk Kanada Nükleer İnovasyon Merkezi'nin başlangıç fonları tarafından finanse edildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
33-plex Bioplex kemokin paneliBiorad12002231
63X yağ (NA 1.4-0.6) Mikroskop objektifleriLeicaHCX PL APO CS (11506188)
Alexa 350 konjuge keçi anti-fare IgG (H + L)InvitrogenA11045
Alexa 488 konjuge keçi anti-fare IgG (H + L)InvitrogenA11002
Alexa 488 konjuge falloidinInvitrogenA12370
Alexa 555 konjuge fare anti-&alfa; tübülin klonu DM1AMillipore05-829X-555
Alexa 568 konjuge keçi anti-hamster IgG (H + L)İnvitrojenA21112
Alexa 568 konjuge keçi anti-sıçan IgG (H + L)İnvitrojenA11077
Alexa 633 konjuge keçi anti-tavşan IgG (H + L)İnvitrogenA21070
Ermeni hamster anti-CD61 (klon 2C9. G2) IgG1 kappaBD Pharmingen553343
C57BL / 6 JFareler Jackson Laboratuvarları64
Konfokal lazer tarama mikroskobuLeicaLeica TCS SP5
DAPI (4 & asal ;, 6-diamidino-2-fenilindol)invitrojenD1306alikot; l stoklar ve -20 ° C'de saklayın; C
Ters floresan geniş alan mikroskobuOlympusOlympus IX83
Ketamin (Narketan)Vetokinol100 mg/ml10 mg/ml stok yapmak için 10 kez seyreltin
Canlı (kalsein)/Ölü (Ethidium homodimer-1) sitotoksisite kitiInvitrogenL3224
Fare anti-ATP5A1 IgG2b (klon 7H10BD4F9)İnvitrogen459240
Fare anti-ATP5 ve beta; IgG2b (klon 3D5AB1)InvitrogenA-21351
Fare anti-NK1.1 IgG2a kappa (klon PK136)Invitrogen16-5941-82
Pierce 660 nm protein tahliliThermoscientific22660
Tavşan anti-anjiyostatin (fare aa 98-116) IgGAbcamab2904
Tavşan anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880)Invitrogen14-6093-81
Sıçan anti-Ki-67 (klon SolA15) IgG2a kappaCanlandırıcı14-5698-82
Sıçan anti-Ly6G IgG2a kappa (klon 1A8)Canlandırıcı16-9668-82
Sıçan anti-Ly6G / Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (klon RB6-8C5)Canlandırıcı53-5931-82
Sıçan anti-fare CD16/CD32 Fc bloğu (klon 2.4G2)BD Pharmingen553142
Azaltılmış mitotracker turuncuInvitrogenM7511
Ksilazin (Rompun)Bayer20 mg / ml10 mg / ml stok yapmak için 2 kez seyreltin
2 & mikroda

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
  2. Aulakh, G. K. Neutrophils in the lung: "the first responders". Cell Tissue Research. , (2017).
  3. Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).
  4. Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).
  5. Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).
  6. Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils. Cell Tissue Research. , (2013).
  7. Cakmak, S., et al. Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone. Environment International. 111, 200-211 (2018).
  8. Dauchet, L., et al. Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults. Environment International. 121, Pt 1 610-619 (2018).
  9. Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).
  10. Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects. Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).
  11. Rush, B., et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome. Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).
  12. Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States. Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).
  13. Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada. Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).
  14. Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone. Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).
  15. Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury. Physiological Reports. 8 (11), 14463(2020).
  16. Aulakh, G. K., et al. Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging. Scientific Reports. 10 (1), 15699(2020).
  17. Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, London, England. 24(2008).
  18. Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
  19. Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).
  20. Aulakh, G. K. Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation. Cell Tissue Research. , (2020).
  21. Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
  22. Yipp, B. G., et al. The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection. Science Immunology. 2 (10), (2017).
  23. Lee, T. Y., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
  24. Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).
  25. Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).
  26. Oosting, R. S., et al. Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells. American Journal of Physiology. 262 (1), Pt 1 63-68 (1992).
  27. Roth, S., et al. Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol. Cell Death & Discovery. 1, 15056(2015).
  28. Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development. Cells. 8 (2), (2019).
  29. Gupta, A., et al. Extrapulmonary manifestations of COVID-19. Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).
  30. Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).
  31. Aulakh, G. K., et al. Multiple image x-radiography for functional lung imaging. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Acute Lung InjuryOzone ExposureLPS Induced InjuryMurine Lung ModelFluorescent MicroscopyBronchoalveolar LavageNeutrophil RecruitmentChemokine GradientsAlveolar MacrophagesIntravital Microscopy

Related Articles