Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Solunum Virüsü Enfeksiyonu Sırasında Doğuştan İmmün Hücre Aktivasyonunun İncelenmesi için Temassız Ko-Kültür Modeli

2.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62115

⸱

28 Şubat 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 3Haartman Institute, Medicum, University of Helsinki, 4Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, National University Hospital, National University Health System, 5Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore Immunology Network (SIgN), 6NUHS Infectious Diseases Translational Research Program, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, viral olarak enfekte olmuş nazal epitel hücreleri ile doğuştan gelen hücre aktivasyonu arasındaki erken etkileşimlerin araştırılmasını detaylandırır. Bağışıklık hücrelerinin bireysel alt kümeleri, viral enfeksiyonlara yanıt olarak aktivasyonlarına göre ayırt edilebilir. Daha sonra erken antiviral yanıtlar üzerindeki etkilerini belirlemek için daha fazla araştırılabilirler.

Özet

Viral enfeksiyonlar sırasında nazal epitel tabakası ile doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasındaki erken etkileşimler henüz keşfedilmemiş bir alan olmaya devam etmektedir. Viral enfeksiyonlarda doğuştan gelen bağışıklık sinyalizasyonunun önemi, yüksek doğuştan gelen T hücresi aktivasyonu sergileyen solunum yolu enfeksiyonlu hastalar daha iyi bir hastalık sonucu gösterdiğinden önemli ölçüde artmıştır. Bu nedenle, bu erken doğuştan gelen bağışıklık etkileşimlerini parçalara ayırmak, onları yöneten süreçlerin aydınlatılmasına izin verir ve viral enfeksiyonların erken ilerlemesini azaltmak veya hatta önlemek için potansiyel terapötik hedeflerin ve stratejilerin geliştirilmesini kolaylaştırabilir. Bu protokol, viral olarak enfekte olmuş hava yolu epitel hücreleri tarafından salgılanan faktörlerden doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin erken çapraz etkileşimini, etkileşimlerini ve aktivasyonunu incelemek için kullanılabilecek çok yönlü bir modeli detaylandırır. Temsili virüs modeli olarak bir H3N2 influenza virüsü (A / Aichi / 2 / 1968) kullanılarak, viral enfeksiyona yanıt olarak epitelden salınan çözünür faktörler tarafından aktive edilen hücrelerin alt kümelerini araştırmak için ko-kültürlü periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) doğuştan gelen hücre aktivasyonu analiz edilmiştir. Sonuçlar, hücrelerin alt kümelerini ayırt etmek için geçit stratejisini göstermektedir ve PBMC'lerin aktive olmuş popülasyonları ile kontrol ve enfekte epitel ile çapraz etkileşimleri arasındaki açık farklılıkları ortaya koymaktadır. Aktive edilen alt kümeler daha sonra fonksiyonlarını ve hücrelere özgü moleküler değişiklikleri belirlemek için daha fazla analiz edilebilir. Böyle bir çapraz konuşma araştırmasından elde edilen bulgular, viral enfeksiyonun ilerlemesini kontrol etmede ve bastırmada yararlı olan hayati doğuştan gelen hücre popülasyonlarının aktivasyonu için önemli olan faktörleri ortaya çıkarabilir. Dahası, bu faktörler evrensel olarak farklı viral hastalıklara, özellikle de yeni ortaya çıkan virüslere, bu tür virüslerin naif insan popülasyonlarında ilk dolaşıma girdiklerinde etkilerini azaltmak için uygulanabilir.

Giriş

Solunum yolu virüsleri belki de ciddi sağlık ve ekonomik yüke neden olan en yaygın patojenler arasındadır. Ortaya çıkan salgın suşların (örneğin, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) periyodik küresel salgınlarından, her yıl mevsimsel grip suşlarına kadar, virüsler halk sağlığı için sürekli bir tehdittir. Her ne kadar aşılar bu küresel halk sağlığı sorunlarına verilen yanıtın ana kütlesini oluştursa da, bu karşı önlemlerin sadece 1,2'ye yanıt verdiğini belirtmek ayıltıcıdır. Ayrıca, yeni bir bulaşıcı suşun ortaya çıkması ile aşısının başarılı bir şekilde geliştirilmesi arasındaki gecikme kaçınılmazdır3 ve virüsün yayılmasını engellemek için mevcut önlemlerin oldukça sınırlı olduğu bir döneme yol açmaktadır.

Bu gecikmeler, ekonomik ve sosyal olarak topluma uygulanan maliyetlerle daha da vurgulanmaktadır. Sadece mevsimsel grip, dolaylı maliyetlerde yaklaşık 8 milyar dolardan, tıbbi maliyetlerde 3,2 milyar dolardan ve Amerika Birleşik Devletleri'nde yılda 36,3 bin ölümden sorumludur4. Bu, aşı geliştirmeyi finanse etmek için gerekli olan araştırma maliyetlerini dikkate almadan öncedir. Epidemik salgınlar, şiddetli akut solunum sendromu koronovirüs 2'nin (SARS-CoV-2) ortaya çıkması ve hızla yayılmasının neden olduğu küresel bozulmaların kanıtladığı gibi, her yıl artan küreselleşme hızıyla birleştiğinde, toplum üzerinde daha da ciddi etkilere sahiptir5,6,7.

Son zamanlarda yapılan çalışmalar, daha fazla aktive olmuş doğuştan gelen T hücresi popülasyonuna sahip enfekte hastaların daha iyi bir hastalık sonucuna sahip olma eğiliminde olduğunu göstermiştir 8,9,10. Ayrıca, doğuştan gelen T hücresi popülasyonu birden fazla alt gruba ayrılır: mukozal ilişkili değişmez T (MAIT) hücreleri, Vδ1 γδ T hücreleri, Vδ2 γδ T hücreleri ve doğal öldürücü T (NKT) hücreleri. Doğuştan gelen T hücrelerinin bu alt grupları da popülasyonlarında heterojenlik sergiler ve doğuştan gelen bağışıklık tepkisinde yer alan hücre popülasyonları arasındaki etkileşimlerin karmaşıklığını arttırır11. Bu nedenle, bu doğuştan gelen T hücrelerini aktive eden mekanizma ve doğuştan gelen T hücrelerinin spesifik alt gruplarının bilgisi, özellikle aşı geliştirme döneminde, bu virüslerin insan konakçısı üzerindeki bulaşıcı etkilerini azaltmak için farklı bir araştırma yolu sağlayabilir.

İnfluenza ile enfekte olmuş epitel hücreleri, doğuştan gelen T hücrelerini hızla aktive eden faktörler üretir12,13,14. Bu bulguya dayanarak, bu temassız Hava-Sıvı Arayüzü (ALI) ortak kültür modeli, erken enfeksiyon sırasında enfekte burun epitel tabakası ile PBMC'ler arasındaki erken kimyasal etkileşimleri (enfekte epitel tabakası tarafından salınan çözünür faktörlerin aracılık ettiği) taklit etmeyi amaçlamaktadır. Nazal epitel tabakası (membran eklerinde kültürlenmiş) ve PBMC'ler (altındaki odada) arasındaki fiziksel ayrım ve epitel bütünlüğü, PBMC'lerin virüs tarafından doğrudan enfeksiyonunu önler ve epitel kaynaklı çözünür faktörlerin PBMC'ler üzerindeki etkilerinin ayrıntılı bir şekilde incelenmesini sağlar. Bu nedenle, tanımlanan faktörler, influenza enfeksiyonuna karşı koruyabilecek uygun doğuştan gelen T hücresi popülasyonunu indüklemede terapötik potansiyelleri açısından daha fazla araştırılabilir. Bu nedenle bu yazıda, epitel kaynaklı çözünür faktörlerden doğuştan gelen T-hücresi aktivasyonunun incelenmesi için bir ko-kültür oluşturma yöntemleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Bu protokolde kullanılan ortam tarifleri için Tablo 1'e bakın.
NOT: 12 kuyucuklu transwell'de yetiştirilen hNECS'in, Influenza virüsü ile enfekte olduğunda çözünür faktörlerin bazal odaya kolayca ulaşması için daha optimal kalınlığa dönüştüğü bulunmuştur. Bu nedenle, ko-kültür için 12 iyi boyutlu transwell kullanılması önerilir.

1. 3T3 besleyici katmanının kurulması

  1. Dondurulmuş stoklardan kuruluş
    1. Dondurulmuş stoklardan bir kriyov / 3T3 fibroblastı çözün. Kriyovalin içeriğini 2 mL'lik tam Dulbecco'nun Minimal Esansiyel Ortamına (DMEM) ekleyin ve hücreleri yeniden askıya alın.
    2. 300 × g ve oda sıcaklığı/basıncında (rtp) 5 dakika santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Hücreleri tam DMEM'de yeniden askıya alın.
    3. Tripan mavisi boyama kullanarak hücreleri sayın. Yeniden askıya alınmış hücre süspansiyonunun 10 μL'sine 10 μL tripan mavisi ekleyin. İyice karıştırın ve hücreleri saymak için süspansiyonun 10 μL'sini bir hemositometreye ekleyin.
    4. 1 × 104 hücre/cm2 yoğunluktaki tohum hücreleri, uygun bir kültür kabında (örneğin, T75 şişesi). Elde edilen kültür şişesini% 5 CO 2 atmosferinde 37 ° C'de 3 gün boyuncainkübe edin.
  2. Mitomisin C tedavisi
    1. 3 günde, akıcılığın% 60 -% 80 olduğundan emin olun, ortamı çıkarın ve hücreleri 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
      NOT: 3T3 besleyici katmanının tam akıcılığa ulaşmaması önemlidir; aksi takdirde, mitomisin C tedavisi etkili olmayacaktır.
    2. Mitomisin C takviyeli tam DMEM'i şişeye ekleyin ve% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de 3.5 saat boyunca inkübe edin. Mitomisin C içeren ortamı çıkarın ve hücreleri 2x 1x PBS ile yıkayın.
  3. 3T3 hücrelerinin 6 delikli plakalara ekilmesi
    1. Hücreleri ayırmak için şişeye 3-5 dakika boyunca 3 mL 1x tripsin-EDTA ekleyin. İlişkisiz hücreleri taze bir 15 mL tüpte toplayın. 15 mL tüpü 300 × g, rtp'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın; süpernatantı atın. Hücreleri tam DMEM'de yeniden askıya alın.
    2. Tripan mavisi boyama kullanarak hücreleri sayın. Hücreleri 7.5 × 10 5-2.5 × 10 6 hücre / kuyuda 6 delikli birplakaya tohumlayın. Plakayı gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO 2 atmosferindeinkübe edin.
      NOT: 3T3 besleyici katmanı, hücreler sağlıklıysa hazır olarak kabul edilir. Bu noktada, insan burun epitel kök / progenitör hücrelerini (hNESPC'ler) genişleme için besleyici tabakaya tohumlayın.
    3. Şişeye Tam DMEM ekleyin ve mitomisin C tedavisinden iyileşmek için 3T3 hücreleri için gece boyunca% 5 CO2 olan 37 ° C'de inkübe edin.

2. İnsan nazal epitel hücresi (hNEC) kültürünün oluşturulması

NOT: Üst solunum yolu enfeksiyonu semptomları olmayan hastalardan klinik örnekler alınmalıdır.

  1. Burun dokusunun tek hücreli süspansiyona işlenmesi
    1. Burun dokusunu, 100 μL / mL antibiyotik-antimikotik karışım içeren 1x Dulbecco PBS (dPBS) (Mg 2+ ve Ca2 + olmadan PBS) içinde yıkayın. Dokuyu küçük parçalar halinde kesin ve numuneyi 4 ° C'de gece boyunca sallayarak 10 mg / mL'lik nötr bir proteaz içinde tedavi edin.
    2. 200 × g'da 5 dakika santrifüj yapın ve santrifüjlemeden sonra süpernatantı çıkarın. Peleti 1-2 mL 1x tripsin-EDTA (37 ° C, 15 dakika) içinde inkübe edin ve tüpteki hacmin% 10'una eşit bir fetal sığır serumu hacmi ekleyerek söndürün.
    3. Sindirilen dokuyu pipetleme yoluyla mekanik olarak tek hücreli agregalara ayırın ve ardından elde edilen süspansiyonu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Hücreleri tam DMEM'de yeniden askıya alın.
      NOT: Bu adımdan sonra, hücre süspansiyonu, insan burun epitel kök / progenitör hücreleri (hNESPC'ler) olarak adlandırılan terminal olarak farklılaşmış hücrelerin ve kök hücrelerin bir karışımıdır. Sonraki adımların amacı, farklı hücre popülasyonlarının karışımından hNESPC popülasyonunu seçmek ve zenginleştirmektir.
  2. hNESPC'lerin seçimi için 3T3 besleyici katmanına tek hücreli bir süspansiyonun tohumlanması
    1. Hücre süspansiyonunu adım 2.1.3'ten (300 × g, 5 dakika, rtp) santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Hücreleri 3-5 mL'lik orta 3'te yeniden askıya alın.
      NOT: Orta 3, hNESPC'lerin seçici büyümesini teşvik etmek için formüle edilmiştir.
    2. Tripan mavisi boyama yoluyla hücreleri sayın. 6 kuyucuklu plakadaki ortamı çıkardıktan sonra hazırlanmış 3T3 besleyici tabakayı içeren 6 delikli plaka üzerine kuyucuk başına 2mL'lik orta3 hücrede 1 x 10 6 hücreyi tohumlayın. Elde edilen ko-kültürü %5 CO 2 atmosferinde 37 °C'deinkübe edin.
      NOT: Tohumlamadan sonra, hNESPC'lerin bağlanmasını etkileyeceğinden plakayı çalkalamamaya dikkat edin.
    3. Eski ortamı tamamen çıkarıp taze ortam 3 ile değiştirerek her 2-4 günde bir ortam 3'ü (2 mL) değiştirin.
      NOT: Besin maddelerini yenilemek ve aşırı asidik koşulların hNESPC'lerin büyümesini olumsuz yönde etkilemesini önlemek için ortam değiştirilir. Her ortam değişimi arasındaki aralık, ortamın ne kadar asidik (sarı) hale geldiğine bağlıdır. Ortam hızlı bir şekilde asidik hale gelirse aralıklar kısaltılmalıdır.
    4. 7-10 gün sonra, hNESPC'lerin membran eklerine aktarılması için uygun bir akıcılıkta olduğunu gözlemleyin. hNESPC'lerin 3 farklı zaman noktasında (2 gün, 5 gün ve 10 gün) temsili morfolojisi için Şekil 1'e bakın.
  3. hNESPC'lerin membran kesici uçlara aktarılması
    NOT: Mitomisin C işlemi nedeniyle, 3T3 besleyici tabakası hNESPC genişleme periyodu boyunca yavaşça bozulacaktır. Bu, kuyunun yüzeyine zayıf bir yapışma ile sonuçlanacak ve bir pipetle kızararak yerinden çıkmalarına izin verecek ve sadece sağlıklı hNESPC'leri geride bırakacaktır.
    1. Ortamı çıkarın ve her bir kuyucuğa 500 μL 1x dPBS ekleyin. 3T3 hücrelerini yerinden çıkarmak için hücreleri 3 kat mikropipetle yıkayın ve 1x dPBS'yi atın. Mikroskop altında, iğ şeklindeki 3T3 besleyici tabakası yerinden çıkarken yuvarlak hNESPC'lerin kaldığını gözlemleyin.
    2. Kuyu başına 500 μL hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve 37 ° C'de % 5 CO2 atmosferinde 5-10 dakika boyunca veya hNESPC'ler kuyu yüzeyinden ayrılana kadar inkübe edin.
    3. hNESPC süspansiyonunu, santrifüjü (300 × g, 5 dakika, rtp) toplayın ve süpernatanı çıkarın.
    4. Peleti orta 3'te yeniden askıya alın. Tripan mavisi boyama yoluyla hücreleri sayın. Tohum 3×, membran eki başına 150 μL orta 3 (24 delikli plaka) içinde 10 4 hücre veya membran eki başına 300 μL orta 3 (12 delikli plaka) içinde 1 × 105 hücre (Şekil 2). Hücreleri% 5'lik bir CO 2 atmosferinde 37 ° C'deinkübe edin.
    5. Her 2 günde bir apikal ve bazal odaların ortamını (orta 3) değiştirin. Bazal hazneye erişmek için membran ucunun destek kolları arasında bir pipet ucunda gezinin, eski ortamı çıkarın ve ardından aynı yöntemle taze ortamı yeniden takın. Apikal odaya kolayca erişilebilmesine rağmen, büyüyen hNESPC tabakasını rahatsız etmemeye dikkat edin.
      NOT: Hücrelerin membrana yapışması için zamana ihtiyaç duyduğundan, tohumlamadan sonra apikal odadaki ortamı en az 2 gün boyunca rahatsız etmeyin.
  4. hNESPC'lerin hNEC'lere farklılaşması
    1. hNESPC'ler %100 akıcılığa ulaştığında (membran ekinde tohumlamadan yaklaşık 3-7 gün sonra), ALI kültürünü başlatın. Bazal ortamı farklılaşma ortamına değiştirin ve ortamı apikal odadan çıkarın. Ortam her 2-3 günde bir değiştirirken, Şekil 3 ve adım 2.3.5'te belirtildiği gibi, apikal odaya eklemeden sadece bazal odaya orta ekleyin.
      NOT: Ortam, hNESPC'lerin ALI'deki hNEC'lere farklılaşmasını teşvik etmek için farklılaştırma ortamına dönüştürülür. hNESPC'lerin ALI'de hNEC olmak için tam olgunluğa ulaşması yaklaşık 3-4 hafta sürer, bu noktada hücreler her katmanda farklı hücre popülasyonları ile çok katmanlı bir şekilde büyümüş olur. Kirpikler ayrıca 400x'lik bir büyütmede de gözlenmelidir (kirpikler, mikroskop alanının titreşiyormuş gibi görünmesine neden olan dayak hareketleriyle tanımlanabilir). Bu noktada, hücreler ko-kültür deneyleri için kullanılmaya hazırdır. Tamamen farklılaştırılmış bir hNEC katmanının kesiti için Şekil 4'e bakın.
    2. Olgun hNEC'ler elde ettikten sonra, ko-kültür deneyinden önce 1 hafta boyunca 2-3 günlük aralıklarla apikal oda 3x'teki hücreleri 1x dPBS ile yıkayın. Yıkama adımını bazal ortam değişiklikleri ile sinerjik hale getirin ve yıkamaları aşağıdaki gibi yapın.
      1. Membran ekinin apikal odasına 50 μL (24 kuyulu)/150 μL (12 kuyulu) 1x dPBS ekleyin ve hücreleri 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Farklılaşma sırasında biriken mukus ve ölü hücreleri çıkarmak için 10 dakikalık inkübasyondan sonra dPBS'yi çıkarın.
        NOT: Deneyin niteliğine bağlı olarak, mukus tabakasını tamamen yıkamak için sodyum bikarbonat çözeltisi kullanılabilir. Bununla birlikte, ko-kültür deneylerinde viral enfeksiyon için, mukus tabakası korunur ve dPBS yıkama ile sadece fazla mukus çıkarılır. Bu retansiyon, gelen viral enfeksiyonla etkileşime girecek olan nazal epitelde bulunan fizyolojik mukus tabakasını taklit etmektir.

3. Transepitelyal elektrik direnci (TEER) ölçümü

NOT: Epitel bütünlüğünün doğrulanması, sağlam ve sağlıklı bir epitel tabakasının elde edilmesini sağlamak için önemlidir. Sağlam bir epitel tabakası, bir voltohmmetre kullanılarak 4 rastgele kuyu üzerinde gerçekleştirilen TEER ölçümü ile belirlenir.

  1. Elektrotu% 70 etanol ile durulayın ve steriliteyi sağlamak için kullanmadan önce 15 dakika boyunca ultraviyole ışıkla sterilize edin. Sterilizasyondan sonra 1x dPBS ile durulayın.
  2. Membran ekinin apikal odasına 100 μL (24 kuyucuk için) veya 300 μL (12 delikli için) 1x dPBS ekleyin. Plakayı 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin; ardından dPBS'yi kaldırın.
  3. Ölçülecek her kuyu için, önceden ısıtılmış (37 ° C'ye kadar) farklılaşma ortamının 1 mL (24 kuyucuk için) veya 3 mL (12 kuyucuk için) ile kullanılmayan bir kuyu hazırlayın. Membran ekini hazırlanan kuyuya yerleştirin ve apikal odaya 200 μL (24 kuyucuk için) veya 600 μL (12 kuyucuk için) önceden ısıtılmış farklılaşma ortamı ekleyin. 15 dakika boyunca 37 ° C'de denge (eklenen virüs türünün kuluçka sıcaklığına bağlı olarak, örneğin, İnfluenza için 35 ° C).
    NOT: TEER'in hesaplanması için aynı şekilde boş (boş membran girişi) hazırlayın.
  4. Önceden ısıtılmış farklılaşma ortamının 15 mL'lik bir tüpünü de aynı sıcaklıkta 15 dakika boyunca dengeleyin. Elektrotları 15 mL tüpe yerleştirin ve voltohmmetreyi açın.
    NOT: Bu noktada, elektrotlar aynı ortamda olduğu için okuma 0 direnç olmalıdır. Başka bir okuma elde edilirse, okuma 0 olana kadar 15 mL tüpteki elektrodu dengeleyin.
  5. Boşluktan başlayarak, elektrotları her bir kuyucuğa, bir elektrot apikal oda ortamına, diğeri bazal oda ortamına batırılacak şekilde konumlandırın. Okumayı yalnızca en az 5 dakikalık bir süre boyunca sürekli bir okuma elde edildiğinde kaydedin.
  6. Her ölçümden sonra, bir sonraki ölçümden önce elektrodu PBS ile yıkayın. İyi test edilen her bir numune için, membranın farklı konumlarında üç numune için ölçümler yapın. Her numunenin net TEER'sini hesaplamak için, boş membran eki tarafından verilen arka plan direncini her ölçümden çıkarın.
  7. Aşağıdaki denklemi kullanarak bir kuyu için toplam TEER okumasını hesaplayın:
    Epitel Bütünlüğü (Ωcm2) = Net TEER (ohm) × Membran Alanı (cm2)
    NOT: Viral enfeksiyon deneyleri için hNEC'lerin TEER değerleri >1000 Ωcm213,15,16 olmalıdır. 

4. Periferik kan monositlerinin ve NK hücrelerinin izolasyonu

NOT: Kan örnekleri sağlıklı gönüllülerden alınmalı ve izolasyonun aynı gününde kullanılmalıdır.

  1. 10 mL kan alma tüplerinde her donörden 30-40 mL tam kan toplayın.
  2. PBMC'leri yoğunluk gradyanı santrifüjleme kullanarak izole edin ve aşağıdaki adımlardan sonra PBMC'leri buffy kattan elde edin (ayrıca Malzeme Tablosu'na bakın).
    1. Eşit hacimli dengeli tuz çözeltisi (PBS) ile seyreltmeden önce kan toplama tüpünden ~ 10 mL kanı bir vakumlayıcıda iyice karıştırın.
    2. 50 mL'lik bir tüpün tabanına 15 mL yoğunluk gradyanı ortamı ekleyin.
      NOT: Yoğunluk gradyanı ortamının seyreltilmiş kana oranı 2:3-3.5 olmalıdır.
    3. Tüpü 45° eğerek ve seyreltilmiş kanın tüpün iç duvarına damla damla düşmesine izin vererek bir pipet tabancası ile yoğunluk gradyanı ortamında (dağıtım ayarı mümkün olan en düşük seviyeye ayarlanmış) 35 mL seyreltilmiş kan tabakası, böylece yoğunluk gradyan ortamının tabakası bozulmaz.
    4. Santrifüj lizatı 500 × g, 18-20 °C'de 30 dakika boyunca (fren: kapalı). Alt tabakayı rahatsız etmeden üst plazma tabakasını dikkatlice çıkarın ve atın.
    5. Buffy ceketi, kırmızı kan hücresi tabakasını, gradyan yoğunluğu orta tabakasını veya buffy ceketini karıştırmadan yeni bir tüpe aktarın. Buffy ceket yeni bir 50 mL tüpte toplandıktan sonra, hacmi 1x PBS ile 50 mL'ye yükseltin.
    6. Santrifüj, 800 × g, 18-20 °C, 8 dakika (fren: kapalı) hızında lizat yapın ve süpernatantı bir pipet tabancasıyla çıkarın. Hücre peletini 50 mL 1x PBS ile yeniden askıya alın ve trombositleri çıkarmak için 120 × g, 18-20 ° C, 10 dakika santrifüj yapın.
    7. Süpernatantı pipetleyerek, hücre peletini rahatsız etmeden atın.
      NOT: Hücre peleti gevşek olabileceğinden, süpernatantın dökülerek atılması tavsiye edilmez.
    8. Hücre peletini tam RPMI (Roswell Park Memorial Institute) ortamı ile yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan hücre süspansiyonunun 10 μL'sine metilen mavisi ile% 3 asetik asitten 10 μL ekleyerek bir hücre sayımı yapın. İyice karıştırın ve hücreleri saymak için karışımın 10 μL'sini bir hemositometreye ekleyin.
  3. Tam RPMI ortamına sahip PBMC'leri 2 × 10 6/mL (24 kuyucuk için) veya 4 × 106/mL (12 kuyucuk için) yoğunluğa kadar seyreltin.

5. hNEC Viral enfeksiyon ve hNEC'ye geçiş: PBMC ko-kültürü

NOT: H3N2 (A/Aichi/2/1968) bu protokolde enfeksiyonun temsili suşu olarak kullanılmıştır. Bu protokolde temsili MOI olarak 0.1 enfeksiyon çokluğu (MOI) kullanılmıştır.

  1. 0. Gün (hNEC'lerin enfeksiyonu)
    NOT: Aynı donörden yetiştirilen hNEC'lerden bir kuyu, deneyde kullanılan her kuyu için temsili bir hücre sayısı elde etmek için kullanılır.
    1. Temsili kuyuda, membran ekinin apikal odasına 150 μL 1x tripsin-EDTA ve bazal odaya 350 μL 1x tripsin-EDTA ekleyin ve 10 dakika boyunca veya hücreler zardan ayrılana kadar 37 ° C'de inkübe edin.
    2. Membran üzerindeki hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyerek yıkayın ve süspansiyonu 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın. Tripsin aktivitesini söndürmek için 200 μL tam DMEM ekleyin. Kuyucuk başına hücre sayısını elde etmek için tripan mavisi boyama yoluyla hücreleri sayın.
    3. Kuyucuk başına hücre sayısına göre virüsün gerekli MOI'sini hesaplayın ve virüs stokunu buz üzerinde tam RPMI ile buna göre seyreltin.
      NOT: MOI 0.1 × 10 kuyu başına6 hNEC = 1.26 × 30 μL'de kuyu başına 105 H3N2 viral partikül (24 kuyucuk için)/100 μL (12 kuyucuk için)
    4. Enfeksiyon deneyi için kalan kuyucuklar için, membran eklerinin apikal odalarına 50 μL (24 kuyucuk için) / 150 μL (12 kuyucuk için) 1x dPBS ekleyin, 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin ve 1x dPBS'yi çıkarın.
    5. Membran uçlarındaki bazal ortamı, uçları kuyucuklara tam RPMI eklenmiş yeni bir plakaya aktararak RPMI ortamını tamamlamak için değiştirin (350 μL (24 delikli için)/700 μL (12 delikli için)).
      NOT: hNESPC'ler hNEC'lere tamamen farklılaştığında, ortam RPMI 12'ye geçirildiğinde morfolojide veya organizasyonda herhangi bir değişiklik olmadan,72 saate kadar farklı ortamlara toleranslıdır / izin verir. RPMI, PBMC popülasyonunun büyümesini ve bakımını desteklemek için kullanılır.
    6. Virüs inokulunun hazırlanan 30 μL (24 kuyucuklu) / 100 μL (12 kuyucuklu için) membran ekinin apikal odasına ekleyin, 35 ° C'de% 5 CO2 atmosferinde 1 saat boyunca inkübe edin ve viral inokulu apikal odadan çıkarın.
    7. Membran kesici ucun bazal ortamını taze tam RPMI ortamına değiştirin ve 24 saat boyunca %5 CO 2 atmosferinde 35 °C'de inkübe edin.
  2. 1. Gün (hNEC'lerin + PBMC'lerin ortak kültürünün kurulması)
    1. PBMC süspansiyonunu 0. Gün'den itibaren enfekte olmamış veya enfekte olmuş hNEC'lerin her bir kuyucuğunun bazal odasına doğrudan ekleyerek (24 kuyucuklu plakalar için 150 μL (24 kuyucuklu) / 300 μL (12 kuyucuklu için) tam RPMI ortamının 150 μL'sinde (24 kuyucuklu plakalar için 10 6 ve 12 delikli plakalar için 3 ×× 106) gerekli PBMC sayısını tohumlayın. 24/48 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin.
      NOT: Ko-kültürün kurulmasından sonra bazal odadaki son hacim 500 μL (24 kuyu için)/1000 μL'dir (12 kuyucuk için).
  3. 2-3. Gün (PBMC'lerin 48/72 saat viral enfeksiyon sonrası toplanması)
    1. Apikal süpernatantların toplanması (48/72 saat post-viral enfeksiyon)
      1. Her apikal odaya 50 μL (24 kuyucuk için)/150 μL (12 kuyucuk için) 1x dPBS ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin. 1x dPBS'yi 1,5 mL tüplerde toplayın. Yeni bir 1.5 mL tüpte plak testi için süpernatantın Aliquot 25 μL (24 kuyucuk için) / 50 μL (12 kuyucuk için) ve hemen hem stoğu hem de alikotları -80 ° C'de dondurun.
    2. hNEC'lerden hücresel RNA toplanması (48/72 h post-viral enfeksiyon)
      1. Membran ekini temiz bir kuyucuğa aktarın, apikal odaya 300 μL (24 kuyucuk için)/600 μL (12 kuyucuk için) RNA lizis tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca rtp'de inkübe edin. Süpernatantı 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın ve moleküler analiz için RNA ekstraksiyonuna kadar -80 ° C'de saklayın.
    3. PBMC'lerin toplanması (48/72 saat post-viral enfeksiyon)
      1. Steril pipet ucunun geniş tabanıyla, kuyu yüzeyine yapışmış olabilecek aktif PBMC'leri yerinden çıkarmak için kuyunun yüzeyini yavaşça kazıyın. PBMC'leri içeren bazal ortamı 2 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın.
      2. Kuyucukları 300 μL 1x dPBS ile 2 kat yıkayın ve yıkamayı aynı 2 mL tüpte toplayın. 2 mL tüpü (500 × g, 5 dakika, rtp) santrifüj edin ve süpernatantı hücre peletini rahatsız etmeden taze bir 2 mL tüpte toplayın. Sitokin ve kemokin analizi için süpernatantı -80 ° C'de saklayın; hücre peletini 200 μL 1x dPBS'de yeniden askıya alın.

6. Akış sitometrisi

NOT: Protokolün bu bölümü, adım 5.3.3.2'deki PBMC hücre askıya alma işlemi kullanılarak doğrudan önceki bölümden devam ettirilir. Bu bölümdeki aşağıdaki adımlarda ışığa en az düzeyde maruz kaldığınızdan emin olun. Yüzey boyama işaretleyicilerinden oluşan örnek bir panel Tablo 2'de bulunabilir.

  1. Yüzey boyama
    1. Yeniden askıya alınmış PBMC hücre peletini 96 V'luk bir alt kuyu plakasına aktarın. Santrifüj, 3 dakika boyunca 800 × g'da lizat yapın ve süpernatanı çıkarın.
    2. Tüm PBMC'leri ("lekesiz" hariç) rtp'de 15 dakika boyunca 100 μL canlılık lekesi ile inkübe edin. 150 μL Manyetik-Aktif Hücre Sıralama (MACS) tamponu ile 200 μL'ye kadar doldurun. Santrifüj, 3 dakika boyunca 800 × g'da lizat yapar ve süpernatanı atın.
    3. Uygun seyreltme oranlarına ve reaksiyon başına 50 μL'lik bir son hacme sahip ilgili yüzey boyama antikorlarından oluşan bir panel hazırlayın (son hacmi elde etmek için MACS tamponu ile doldurun). Çok kanallı pipet kullanarak hazırlanan antikor karışımının 50 μL'sini hücrelere ekleyerek yüzey boyama işlemini gerçekleştirin. Karanlıkta 15 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    4. 150 μL MACS tamponu ekleyerek yıkayın. Santrifüj, 3 dakika boyunca 800 × g'da lizat yapın ve süpernatanı atın. Hücre içi boyama gerekli değilse, adım 6.3'te doğrudan 15 dakikalık inkübasyona geçin.
  2. Hücre içi boyama (Gerekirse)
    1. Her bir oyuğa 100 μL sabitleme ve geçirgenlik çözeltisi ekleyin. Karanlıkta 20 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Kuyucukları 100 μL 1x MACS tamponuyla doldurun.
    2. Santrifüj (800 × g, 3 dk, 25 °C) ve süpernatanı çıkarın. 200 μL 1x Permeabilizasyon Yıkama tamponu ekleyerek yıkamayı tekrarlayın. Santrifüj (500 × g, 3 dk, 25 °C) ve süpernatanı çıkarın.
    3. 1x Permeabilizasyon Yıkama tamponu kullanarak 50 μL'lik son bir hacim elde etmek için ilgili antikor panelinin seyreltmelerini hazırlayın. Karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın. 200 μL 1x Geçirgenleştirme Yıkama tamponu ekleyin.
    4. Hücreleri santrifüj edin (800 × g, 3 dakika, 4 ° C) ve süpernatanı çıkarın. Hücreleri 100 μL floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama tamponunda yeniden askıya alın.
  3. Pipet, her bir kuyucuğun içine 200 μL'lik bir lizör çözeltisi yerleştirin. RTP'de 15 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Santrifüj, 3 dakika boyunca 800 × g'da lizat eder ve süpernatanı atar.
  4. Hücre peletlerini 200 μL MACS tamponunda yeniden askıya alın. Daha önce13 olarak belirtilen ayarlara uygun olarak akış sitometrisi yapın veya karanlıkta 4 ° C'de saklayın.

7. Sitokin ve kemokin düzeylerinin belirlenmesi

  1. Üreticinin protokolü18'e göre bir immünoloji multipleks testi kullanarak bazal oda süpernatanının 25 μL'sini işleyin.
  2. Standart eğri için eğriye uyan bir algoritma (5 parametre) kullanan multipleks yönetici yazılımını kullanarak her analitin konsantrasyonunu hesaplayın.

8. Viral kontaminasyonun değerlendirilmesi

  1. 4 set çözelti üzerinde bir ekstraksiyon kiti kullanarak viral RNA'yı ekstrakte edin: stok H3N2 çözeltisi, enfeksiyon için MOI 0.1 seyreltme, MOI 0.1'in 10x seri seyreltilmesi ve örneklerden bazal ortam (hem 48 hem de 72 saat viral enfeksiyon sonrası)12.
  2. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için hedef olarak yapısal olmayan gen (NS1) ve matrisi (M1) seçin (temsili deneyde kullanılan primerler için Malzeme Tablosuna bakınız).
  3. NS1 ve M1 seviyelerini viral mevcudiyet için bir vekil olarak ölçmek üzere kantitatif PCR (qPCR) gerçekleştirmeden önce viral RNA'yı cDNA'ya dönüştürmek için ters transkripsiyon-PCR (RT-PCR) (42 ° C, 60 dakika) gerçekleştirin ve seviyeleri MOI 0.1 aliquot'un 10x seri seyreltilmesinde gerçekleştirilen RT-qPCR'den elde edilen standart eğri ile ilişkilendirin. Reaksiyon karışımlarının bileşimi için Tablo 3'e bakın ve aşağıdaki koşulları kullanın: 10 dakika boyunca 95 ° C'de ön inkübasyon, ardından 40 döngü için 3 adımlı bir amplifikasyon: 10 s için 95 ° C, 10 s için 60 ° C, 30 s için 72 ° C; erime eğrisi: 10 s için 95 °C, 60 s için 65 °C ve 1 s için 97 °C.

9. Plak tahlili

  1. 0. Gün: MDCK'nin (Madin Darby Canine Böbrek) 24 kuyucuklu plakalara ekilmesi
    1. Ortamı, birleşik MDCK hücrelerinin T75 Flask'ından çıkarın. Tüm serum izlerini gidermek için 2x'i 1x PBS ile yıkayın. MDCK hücrelerini, 10 mL tripsin ekleyerek ve hücreler ayrılana kadar 20-30 dakika boyunca% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C'de inkübe ederek tripsinize edin.
      NOT: Şişeye dokunmayın, çünkü bu durum kümelenmeye neden olabilir.
    2. Hücre süspansiyonunu, 2 mL'lik tam Eagle's Minimal Essential Medium (EMEM) içeren 15 mL'lik bir tüpe pipetleyin. Santrifüj (300 × g, 5 dakika, rtp) ve süpernatanı çıkarın.
    3. Hücreleri 6 mL'lik tam EMEM'de yeniden askıya alın. Tripan mavisi boyama ile hücreleri sayın.
    4. MDCK hücre süspansiyonunu 1 × 105 hücre / mL konsantrasyona kadar seyreltin ve steril 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğunda seyreltilmiş süspansiyonun 1 mL'sini tohumlayın. Her bir kuyucukta birleştirilmiş bir tek katmanlı MDCK hücresi elde etmek için24 saat boyunca% 5'lik bir CO 2 atmosferinde 37 ° C'de inkübe edin.
  2. 1. Gün: MDCK hücrelerinin enfeksiyonu
    1. Enfeksiyon ortamını hazırlayın. Ortamı 24 delikli plakadaki MDCK tek katmanından çıkarın ve 2x'i 1x dPBS ile yıkayın. İkinci yıkama için, virüsün seri seyreltmelerini hazırlarken PBS'yi kuyucuklarda bırakın.
    2. Virüs örneklerini buz üzerinde çözün ve 10-1'den 10-6'ya kadar seri seyreltmeler elde etmek için 24 delikli bir plakada seri olarak seyreltin.
      NOT: Örnek olarak, her bir oyuğun 270 μL enfeksiyon ortamı içeren 24 delikli bir plakaya doldurun.
    3. Sıradaki ilk kuyucuğa 30 μL virüs örneği ekleyin. Yeni bir pipet ucu ile iyice karıştırın ve numuneyi 10 kat seyreltmek için sıradaki bir sonraki kuyucuğa aktarın. 10-6 seyreltme elde edilene kadar devam edin; Tüm virüs örnekleri için 9.2.1-9.2.3 adımlarını uygulayın.
    4. PBS'yi MDCK plakasından çıkarın ve hazırlanan viral seyreltmelerin 100 μL'si ile çift olarak enfekte edin. Kontrol kuyuları için, enfeksiyon ortamının 100 μL'sini ekleyin (viral numune olmadan). 35 °C'de %5 CO2 atmosferinde 1 saat boyunca inkübe edin ve her 15 dakikada bir kuru lekeleri ortadan kaldırmak için plakayı sallayın.
    5. Viral inokulumu çıkarın ve her kuyucuk için 1 mL sıvı kaplama ekleyin. 35 °C'de %5 CO2 atmosferinde 72 saat boyunca inkübe edin.
  3. 4. Gün (enfeksiyon sonrası 72 saat): plak görselleştirme
    1. Sıvı kaplamayı çıkarın ve hücreleri% 4 formaldehit ile 1 saat boyunca 1x PBS'de sabitleyin. Formaldehit çözeltisini çıkarın ve 1x PBS veya damıtılmış su ile bir kez yıkayın.
    2. 15 dakika boyunca% 1 kristal menekşe çözeltisi ekleyerek sabit hücreleri lekeleyin. Kristal menekşe boyasını çıkarın ve hücreleri akan suyla yıkayın. Plakayı rtp'de kurulayın.
    3. Kuruduktan sonra, plakları sayın ve viral titreyi aşağıdaki formüle göre hesaplayın:
      Seyreltme faktörü × plak sayısı = 100 μL'de plak - şekillendirme ünitelerinin sayısı

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Konvansiyonel T hücreleri, viral klirensi kolaylaştırmak için viral enfeksiyona karşı adaptif immün yanıtın ana repertuarını oluştursa da, doğuştan gelen T hücresi popülasyonu, daha sonraki bir aşamada etkili klirens için viral yükü bastırmak için daha geniş bir spektrumda çalışır. Bu nedenle, bu protokol özellikle doğuştan gelen T hücrelerini, aktivasyonlarını ve influenza enfeksiyonunu takiben fonksiyonel popülasyonlarını, aynı donörden epitel ve bağışıklık hücresi örneklerine ihtiyaç d...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Virüslere karşı doğuştan gelen immün yanıtlar, antiviral yönetimde az araştırılan bir çalışma alanıdır. Hava yolu epitel hücreleri ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, bir enfeksiyon sırasında viral replikasyonu baskılamak için uyum içinde çalışır, ayrıca viral yük kontrol altında tutulmazsa aşırı aktif adaptif yanıtın belirleyicisi olarak hizmet eder12,13,17. Bununla birlikte, uygun bir antiviral yanıt vermek için doğuştan g...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

NUS Kulak Burun Boğaz Anabilim Dalı ve Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Anabilim Dalı'ndaki araştırma personeline, hNEC kültürü ve viral kültür ile ilgili çalışmalardaki yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca, Ulusal Üniversite Hastanesi, Kulak Burun Boğaz Anabilim Dalı'ndaki cerrahlara ve cerrahi ekibe, çalışma için gerekli hücre ve kan örneklerinin sağlanmasındaki yardımları için teşekkür ederiz.
Bu çalışma Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi, Singapur No tarafından finanse edilmiştir. NMRC / CIRG / 1458/2016 (De Yun Wang için) ve MOH-OFYIRG19may-0007 (Kai Sen Tan'a). Kai Sen Tan, Avrupa Alerji ve Klinik İmmünoloji (EAACI) Araştırma Bursu 2019'dan burs desteği almaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.5 Tripsin-EDTAGibco15400-054
0.5 M Etilendiamintetraasetik asit (EDTA), pH 8.0, RNaz içermeyenThermofisherAM9260G0.5M EDTA
1.5 mL SafeLock TüpleriEppendorf00301200861.5 mL Santrifüj Tüpü
10 mL K3EDTA Vacutainer TüpleriBD36664310mL Kan Alma Tüpleri
10x dPBSGibco14200-075
10x PBSVivantisPC0711
12 kuyulu PlakaCorning 3513
12 kuyulu Transwell Kesici UçCorning 3460membran eki
1x FACS Lizasyon ÇözeltisiBD349202
2.0 mL SafeLock TüpleriEppendorf00301200942 mL santrifüj tüpü
24 kuyulu PlakaCorning 3524
24 kuyulu Transwell Kesici UçCorning 3470
Metilen Mavisi ile %3 Asetik AsitSTEMCELL Teknolojileri07060
3,3',5-triiyodo-l-tironinSigmaT-074
37 Formaldehit Çözeltisi w H2OSigma533998
5810R SantrifüjEppendorf5811000320
5 mL polipropilen tüpler (akış tüpleri)BD352058
70 &mikro; m Hücre SüzgeciCorning 
A-4-62 RotorEppendorf5810709008
AccutaseGibcoA1110501Hücre Ayrışma Reaktifi
Antibiyotik-AntimikotikGibco15240-062
Avicel CL-611FMCBiyopolimer NASıvı Kaplama
Bio-Plex Manager 6.2 Standart YazılımBio-Rad Laboratories, Inc171STND01Multipleks Yönetici Yazılımı
Kelebek İğne 21 GBD367287
Kolera ToksinSigmaC8052
Kristal Menekşe MerckC6158
Cytofix/Cytoperm SolüsyonuBD554722Fiksasyon ve Geçirgenleştirme Solüsyonu
Dispase IISigmaD4693Nötr Proteaz
DMEM/Yüksek GlikozGE Healthcare Yaşam BilimleriSH30243.01
DMEM/Besin Karışımı F-12Gibko-İnvitrojen11320033
dNTP KarışımıPromegaU1515dNTP Mix
EMEM (w L-Glutamin)ATCC30-2003
EVOM voltohmmetre cihazıWPI, Sarasota, FL, ABD300523
FACS Lizasyon SolüsyonuBD3492021x Lysing Solüsyonu
Falcon tüpü 15 mLCellStar18827115 mL tüp
Falcon tüp 50 mLCellStar22726150 mL Tüp
Hızlı Başlatma Temel DNA Probları MasterRoche6402682001qPCR Master Mix
Ficoll Paque PremiumAraştırma Cihazları17544203Yoğunluk Gradyan Ortamı
H3N2 (A/Aichi/2/1968) ATCCVR547
H3N2 M1 İleri Primer DizisiSigma5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'H3N2
M1 Ters Primer DizisiSigma5'- ATCTGCACCCATTCGTTT-3'H3N2
NS1 İleri Primer DizisiSigma5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'H3N2
NS1 Ters Primer DizisiSigma5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'Isı
ile İnaktive Fetal Sığır SerumuGibco10500-064
hNESPCsİnsan DonörleriNA
İnsan Epitelyal Büyüme FaktörüGibko-İnvitrojenPHG0314
HidrokortizonKÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ7925Septum deviasyonu ameliyatları
sırasında yapılan nazal biyopsilerden toplanmıştırİnsülinSigmaI3536
Lightcycler 96Roche5815916001qPCR Cihazı
Canlı/ÖLÜ Mavi Hücre Leke Kiti * UV Uyarmaiçin ThermofisherL23105Canlılık Lekesi
MILLIPLEX MAP İnsan Sitokin / Kemokin Manyetik Boncuk Paneli II - Önceden Karıştırılmış 23 PlexMerck Pte LtdHCP2MAG-62K-PX23İmmünoloji Multipleks Testi
Mitomisin CSigmaM4287
M-MLV 5x TamponPromegaM1705RT-PCR 5x Tampon
M-MLV Ters TranskriptazPromegaM1706Ters Transkriptaz
N-2 takviyesiGibco-Invitrogen17502-048
NIH/3T3ATCCCRL1658
Perma / Yıkama TamponuBD554723Geçirgenlik Yıkama Tamponu
PneumaCult-ALI 10x Takviye Edici GıdaKÖK HÜCRE TEKNOLOJİLERİ5001
PneumaCult-ALI Bazal BesiyeriSTEMCELL TEKNOLOJİLERİ5001
PneumaCult-ALI Bakım Takviyesi (100x)STEMCELL Teknolojileri5001
Rastgele PrimerlerPromegaC1181Rastgele Primerler
Rekombinant Rnasin Rnaz İnhibitörüPromegaN2511RNaz İnhibitörü
RNA Lizis TamponuQiagen52904
RPMI 1640 (w L-Glutamin)ATCC30-2001
STX2 elektrotlarınınWPI, Sarasota, FL, ABDSTX2
Elektrot T25 ŞişesiCorning430639
T75 ŞişesiCorning430641U
TPCK TripsinSigmaT1426
Tripan Mavi HycloneSV30084.01
Viral RNA Ekstraksiyon KitiQiagen52904Viral RNA Ekstraksiyon Kiti
V-Şekilli 96 oyuklu PlakaCorning3894
%431751 bir parçası

Kaynaklar

  1. Monto, A. S. Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness. Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).
  2. Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. Preparing for the next pandemic. The British Medical Journal. 346, 364(2013).
  3. Gerdil, C. The annual production cycle for influenza vaccine. Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).
  4. Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. Economic burden of seasonal influenza in the United States. Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).
  5. Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M. COVID-19 and globalization. One Health. 9, 100132(2020).
  6. Guo, Y. R., et al. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status. Military Medical Research. 7 (1), 11(2020).
  7. Guan, W. J., et al. Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).
  8. van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells are activated during human viral infections. Nature Communications. 7, 11653(2016).
  9. Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. Gammadelta T cells: first line of defense and beyond. Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).
  10. van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo. Nature Communications. 9 (1), 4706(2018).
  11. Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).
  12. Yan, Y., et al. Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).
  13. Luukkainen, A., et al. A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium. Frontiers in Immunology. 9, 2514(2018).
  14. Tan, K. S., et al. RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications. Cells. 8 (9), 986(2019).
  15. Kim, N., et al. Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells. Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).
  16. Tan, K., et al. In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses. Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).
  17. Tan, K. S., et al. Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures. Frontiers in Microbiology. 9, 2685(2018).
  18. Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay,MM_NF-HCP2MAG-62K-PX23?#documentation (2020).
  19. Gamage, A. M., et al. Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130(2020).
  20. Zhao, X. N., et al. The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro. American Journal of Rhinology & Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Doğuştan Gelen Bağışıklık AktivasyonuNazal Epitel HücreleriDoğuştan Gelen T HücreleriPeriferik Kan Mononükleer HücreleriAkış Sitometrisiİnfluenza Virüsü EnfeksiyonuEpitelial İmmün Çapraz EtkileşimSitokin Analizi
Solunum Virüsü Enfeksiyonu Sırasında Doğuştan İmmün Hücre Aktivasyonunun İncelenmesi için Temassız Ko-Kültür Modeli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.