Bu fraksiyonasyon protokolü, araştırmacıların sitoplazmik, nükleer, mitokondriyal ve membran proteinlerini memeli hücrelerinden izole etmelerini sağlayacaktır. Son iki hücre altı fraksiyon, izopiknik yoğunluk gradyanı ile daha da saflaştırılır.
Yöntem makalesi
Bu fraksiyonasyon protokolü, araştırmacıların sitoplazmik, nükleer, mitokondriyal ve membran proteinlerini memeli hücrelerinden izole etmelerini sağlayacaktır. Son iki hücre altı fraksiyon, izopiknik yoğunluk gradyanı ile daha da saflaştırılır.
Bu protokol, deterjanlar, mekanik lizis ve izopiknik yoğunluk gradyanı santrifüjleme kombinasyonunu kullanarak memeli hücrelerinden hücre altı protein fraksiyonları elde etmek için bir yöntemi açıklar. Bu prosedürün en büyük avantajı, hücre altı fraksiyonları elde etmek için çözünürleştirici deterjanların tek kullanımına dayanmamasıdır. Bu, plazma zarını hücrenin diğer zara bağlı organellerinden ayırmayı mümkün kılar. Bu prosedür, tekrarlanabilir, ölçeklenebilir ve seçici bir yöntemle hücrelerde protein lokalizasyonunun belirlenmesini kolaylaştıracaktır. Bu yöntem, sitozolik, nükleer, mitokondriyal ve plazma membran proteinlerini insan monosit hücre hattı U937'den izole etmek için başarıyla kullanılmıştır. Bu hücre hattı için optimize edilmiş olmasına rağmen, bu prosedür diğer hücre hatlarının hücre altı fraksiyonasyonu için uygun bir başlangıç noktası olarak hizmet edebilir. Prosedürün potansiyel tuzakları ve bunlardan nasıl kaçınılacağı, diğer hücre hatları için dikkate alınması gereken değişiklikler gibi tartışılmaktadır.
Subselüler fraksiyonasyon, hücrelerin lize edildiği ve çeşitli yöntemlerle kurucu bileşenlerine ayrıldığı bir prosedürdür. Bu teknik, araştırmacılar tarafından memeli hücrelerinde protein lokalizasyonunu belirlemek veya aksi takdirde tespit edilemeyecek düşük bolluktaki proteinlerin zenginleştirilmesi için kullanılabilir. Hücre altı fraksiyonasyon yöntemleri şu anda mevcut olsa da, satın alınabilecek ticari kitler gibi, bu prosedürün üstesinden gelmeye çalıştığı çeşitli sınırlamalardan muzdariptirler. Çoğu hücre fraksiyonasyon yöntemi, farklı hücresel bileşenleri çözündürmek için artan miktarda deterjan içeren tamponların kullanımına dayanan sadece deterjan bazlı
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
1. Tamponları ve reaktifleri hazırlayın
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu prosedürün şematik bir akış şeması (Şekil 1), süspansiyonda yetiştirilen U9375 hücrelerini başarılı bir şekilde fraksiyone etmek için atılan adımları görsel olarak özetlemektedir. İzopiknik yoğunluk gradyanının tepesinden eşit hacimlerde (1 mL) toplanan fraksiyonlar, mitokondriyal ve membran fraksiyonlarının saflaştırılmasını göstermektedir (Şekil 2). Dış mitokondriyal membran6'ya lokalize bir protein olan VDAC'.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu yöntem, yüksek hızlı santrifüjleme11 kullanılmadan hücre altı fraksiyonasyona yönelik daha önce yayınlanmış bir yaklaşımın değiştirilmiş bir versiyonudur. Bu modifiye yöntem, en iyi sonuçları elde etmek için daha özel ekipman gerektirir, ancak daha kapsamlı ve tutarlı bir şekilde tekrarlanabilir.
İlk protokolün geliştirilmesi, nekroptoz12 sırasında protein lokalizasyonunun analizi için mitokondriyal ve membran örneklerinin ayrılamaması nedeniy.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Bu çalışma NIH R15-HL135675-01 ve NIH 2 R15-HL135675-02 tarafından T.J.L.'ye desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Benzonaz | Nükleaz Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bullet Blender Doku Homojenizatör | Sonraki İlerleme | 61-BB50-DX | |
| digitonin | Sigma | D141 | |
| uçtan uca döndürücü | ThermoFisher | ||
| Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) | Sigma | E9884 | |
| etilen glikol-bis (β -aminoetil eter) -N, N, N ', N'-tetraasetik asit (EGTA) | Sigma | E3889 | |
| GAPDH (14C10) | Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri | 2118 | |
| HEPES | VWR | 97064-360 | |
| Heksilen glikol | Sigma | 68340 | |
| Igepal | Sigma | I7771 | İyonik olmayan, denatüre olmayan deterjan |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Mannitol | Sigma | M9647 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri | 23565 | |
| Üstü Açık Polyclear Tüpler, 16 x 52 mm | Seton Scientific | 7048 | |
| OptiPrep (Iodixanol) Yoğunluk Gradyanı Orta | Sigma | D1556-250ML | |
| fenilmetansülfonil florür (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Proteaz İnhibitörü Kokteyli, Genel Kullanım | VWR | M221-1ML | |
| soğutmalı santrifüj | ThermoFisher | ||
| S50-ST Sallanan Kova Rotoru | Eppendorf | ||
| Sodyum dodesil sülfat (SDS) | Sigma | 436143 | |
| Sodyum deoksikolat | Sigma | D6750 | |
| sodyum ortovanadat (SOV) | Sigma | 567540 | |
| sonikatör | ThermoFisher | ||
| Sorvall MX120 Plus Mikro-Ultrasantrifüj | ThermoFisher | ||
| Paslanmaz Çelik Boncuklar 3,2 mm | Sonraki İlerleme | SSB32 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Tris-tamponlu Salin (TBS) | VWR | 97062-370 | |
| Tween 20 | batı lekeleme tamponlarında iyonik olmayan deterjan | ||
| VDAC (D73D12) | Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri | 4661 |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin isteAn erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
William McCaig1
Timothy LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences