Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

EcoHIV Beyin Enfeksiyonunun Bir Sıçan Modeli

3.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62137

⸱

21 Ocak 2021

 ,  ,  , 
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

Bu makalede

Özet

Burada, beyindeki HIV-1 viral rezervuarlarını anlamamızı geliştirmek ve HIV ile ilişkili nöroknaktif bozuklukları ve ilişkili komorbiditeleri (yani uyuşturucu bağımlılığı) incelemek için bir sistem sunmak için kritik öneme sahip olan kimerik HIV (EcoHIV) kullanarak aktif HIV enfeksiyonunun yeni bir sıçan modelini oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Özet

EcoHIV enfekte fare modelinin HIV ile ilişkili nörolojik komplikasyonların araştırılmasında önemli bir yararı olduğu iyi incelenmiştir. İlaç kötüye kullanımı ve nöroknasitif bozukluklar çalışmaları için EcoHIV enfekte sıçan modelinin kurulması, nöroHIV ve HIV-1 ilişkili nörokinetif bozuklukların (EL) çalışmasında faydalı olacaktır. Bu çalışmada, kimerik HIV (EcoHIV) kullanılarak aktif HIV enfeksiyonunun sıçan modelinin başarılı bir şekilde oluşturulduğunu göstermektedir. İlk olarak, EcoHIV'in lentiviral yapısı 48 saat boyunca kültürlü 293 FT hücrelerde paketlendi. Daha sonra, koşullu ortam yoğunlaştı ve titretildi. Daha sonra, EcoHIV-EGFP'nin F344/N sıçan beyin dokusuna bilateral stereotaksik enjeksiyonlarını gerçekleştirdik. Enfeksiyondan bir hafta sonra, enfekte beyin dokusunda EGFP floresan sinyalleri tespit edildi ve bu da EcoHIV'in sıçanlarda aktif bir HIV enfeksiyonunu başarıyla teşvik ettiğini gösterdi. Ayrıca Iba1 mikroglial hücre belirteci için immünostaining yapıldı. Sonuçlar, mikroglianın EcoHIV'i barındıran baskın hücre tipi olduğunu gösterdi. Ayrıca, EcoHIV sıçanları, HAND'in potansiyel bir nörobehavioral mekanizması olan zamansal işlemde ve enfeksiyondan sekiz hafta sonra sinaptik disfonksiyonda değişiklikler gösterdi. Toplu olarak, bu çalışma HIV-1 enfeksiyonunun EcoHIV modelini, beyindeki HIV-1 viral rezervuarlarını ve EL'i ve uyuşturucu kullanımı gibi ilişkili komorbiditeleri incelemek için değerli bir biyolojik sistem sunan sıçana genişletmektedir.

Giriş

Biyolojik sistemler HIV-1 ilişkili nöroklasitif bozukluklar (EL) ve bunların altında kalan sinirsel mekanizmalar hakkındaki anlayışımızı geliştirmiştir2. Herhangi bir çalışma için hangi biyolojik sistemin en uygun olduğunu belirlemek genellikle ilgi sorusuna bağlıdır2. Konak hayvan modellerinin çeşitliliğinin sınırlandırılması HIV-1 hastalığı gelişimi çalışmalarına meydan okuyor. HIV-1 viral replikasyonu ve patogenezini araştırmak için Potash ve ark.3, HIV yüzey zarfı glikoprotein kodlama bölgesi gp120'yi farelerde başarılı viral replikasyona yol açan ekotropik MLV gp80 ile değiştirerek aktifHIV-1enfeksiyonunun bir fare modelini oluşturdu 4 . Kimerik HIV (EcoHIV) farelerinde kuyruk damarı enjeksiyonlarından sonra, HIV-1 seropositive bireylerinkine benzeyen birçok özellik gözlenmiştir (örneğin, antiviral immün yanıtlar için hedeflenen enfekte lenfositler ve makrofajlar ve iltihap3,5,6).

Fareler ve sıçanlar Muridae'nin her ikisi de üyesi olmasına rağmen, temel tür farklılıkları belirli deneysel sorulara uygunluklarını etkileyebilir7. Bu nedenle, EcoHIV enfeksiyon modelinin sıçanlara uzatılması (yaygın olarak ilaç kötüye kullanımı ve nöroknatif bozukluk çalışmalarında kullanılır) nöroHIV çalışmasında avantajlı olacaktır. Örneğin, daha büyük boyutları, ilaç kendi kendine uygulama prosedürleri için juguler kateter implantasyonunu daha pratik hale getirir8. HIV-19'da motivasyonun değerlendirilmesi için sıçanlarda ilaçkendi kendine uygulama teknikleri kullanılmıştır. Ayrıca, birçok nöroknatif / davranışsal görev başlangıçta sıçanlar için tasarlanmıştır10. Burada, EcoHIV enfeksiyon modelini genişletmek ve neuroHIV ve HAND ile ilgili yeni soruları ele almak için önemli bir fırsat sağlamak için sıçanlarda EcoHIV'in stereotaksik enjeksiyonlarının kullanımını rapor ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan protokolleri Güney Carolina Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı (federal güvence numarası: D16-00028). Altı yetişkin erkek F344/N sıçanı, 12/12 ışık altında kontrollü bir ortamda barındırıldı: yiyecek ve suya ad libitum erişimi olan karanlık döngü. Tüm hayvanlara, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'nde Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından oluşturulan yönergeler kullanılarak bakıldı.

1. 293 FT hücrelerde virüs paketleme

  1. Kültür 293 FT hücreleri (5×105/mL) jelatin kaplı 75 cm2 şişeler ile DMEM artı% 10 FBS11. 37 °C'de hücreleri transfeksiyonda %50 birikecek şekilde büyütün.
  2. 22,5 μL transfeksiyon reaktifini (örneğin Lipofectamine 3000) 750 μL orta (örneğin, Opti-MEM) 1,5 mL mikro santrifüj tüpünde ve girdapta 3 sn seyreltin.
  3. 20 μg EcoHIV plazmid DNA'yı 1,5 mL mikro santrifüj tüpünde 750 μL orta derecede seyreltin ve iyice karıştırın.
  4. Seyreltilmiş transfeksiyon reaktifinin tüpüne seyreltilmiş DNA ekleyin ve hafifçe karıştırın. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatır.
  5. Karışımı 75 cm2 şişede 10 mL önceden ısıtilmiş DMEM ortamına ekleyin. Hücreleri 37 °C'de 2 gün kuluçkaya yatır.
  6. Paketlenmiş lentivirüs içeren iki şişeden 24 mL koşullu ortamı hasat edin ve birleştirin.
  7. 24 mL'lik koşullu ortamın tamamını 500 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Netleştirilmiş süpernatantı steril 50 mL tüpe aktarın.
  8. 8 mL Lenti-x konsantratörü 24 mL netleştirilmiş süpernatant (1:3 oran) ile birleştirin. Nazik bir ters çevirme ile karıştırın. Karışımı iki gün boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatır.
  9. 4 °C'de 45 dakika boyunca 1.500 x g'da santrifüj karışımı. Üst saltanayı dikkatlice çıkarın.
  10. Peleti 100 μL 100 mM PBS ile hafifçe yeniden askıya alın.
  11. P24 ELISA kiti ile titer virüs konsantrasyonu.

2. EcoHIV-EGFP virüs stereotaksik ameliyatları

  1. % 3 sevoflurane kullanarak sıçanları uyuşturmak. Sıçanlar zararlı uyaranlara yanıt vermediğinde ve refleksler olmadığında 2.2 adımına geçin.
  2. Beyin bölgesindeki kılları tıraş edin ve cildi% 70 etanol ve klorheksidin bazlı bir ovma ile iki kez sterilize edin. Sıçanı stereotaksik aparatta eğilimli bir pozisyonda sabitleyin.
  3. Kafa derisi orta çizgisi boyunca ciltten bir kesi (5-6 cm) yapın.
  4. 0,8 mm yanal, 1,2 mm rostral ve bregma olmak üzere iki delme pozisyonunu işaretleyin. Her kafatası pozisyonunda bir delik (çap 0,4 mm) delin.
  5. Titrek EcoHIV lentivirüs çözeltisini (1,04 ×10 6 TU/mL) 10 μL enjeksiyon şırındında doldurun. Şırınnayı stereotaksik aparatlara sabitleyin.
  6. İğneyi delme deliğinin yüzeyine yakın bir yere taşıyın. 2,5 mm derinlikte ölçün ve hareket ettinin.
  7. 1 μL virüs çözeltisinin 0,2 μL/dak hızında demleyin. İğneyi enjeksiyon bölgesinin içinde 5 dakika tutun. İğneyi fare kafatasının dışına gelene kadar yavaşça yukarı hareket ettirin.
  8. Cildi 4-0 ipek iplikle dikin.
  9. Kesiği bir kez% 70 etanol ile sterilize edin. Deri altı enjekte butorfenol (Dorolex, 0.1 mg/kg vücut ağırlığı).
  10. Sıçanı uyanana kadar bir ısıtma yastığı ile bir kurtarma odasına aktarın.

3. Beyin bölümlerinin görselleştirilmesi

NOT: EcoHIV viral infüzyondan sonra bir ila sekiz hafta bekleyin.

  1. Sıçanı% 5 sevoflurane ile uyuşturun. Sıçanlar zararlı uyaranlara duyarlı olmadığında ve refleksler olmadığında 3.2 adımına devam edin.
  2. Sıçanı duman kaputunun içinde bir supine pozisyonunda sabitle.
  3. Cildi torasik orta hat boyunca inzivaya çeker. Diyaframı kesin ve torasik boşluğu açın.
  4. Sol ventrikül içine 20 G × 25 mm iğne yerleştirin.
  5. Hemen sağ atriyumu makasla açın.
  6. 5 mL/dk hızında 50 mL ön yokuşlu 100 mM PBS'ye nüfuz edin.
  7. 5 mL/ dk hızında 100 mL soğuk% 4 paraformaldehit perfuse.
  8. Farenin kafasını kopar, kafa derisini aç ve beyni çıkar.
  9. %4 paraformaldehit ile bir gecede postfix.
  10. Beyin dibe (yaklaşık 3 gün) inene kadar beyni 50 mL tüpte 100 mM PBS'de% 30 sakkarozun 40 mL'sine aktarın.
  11. Snap, beyni metilbutanolde 2 dakika - 80 ° C'de dondurun.
  12. Beyin dokusunu -20 °C kriyostat içindeki metal bir platformda sabitleyin.
  13. Kriyostat kullanarak 50 μm kalınlığında koronal bölümleri kesin.
  14. Beyin dilimlerini ince bir fırça ile cam slaytlara aktarın.
  15. Bölümleri 0,3 mL antifad orta ve kapak 22 mm 50 mm kapaklı monte edin.
  16. Cam kaydıraları kuruyana kadar oda sıcaklığında karanlıkta tutun.
  17. Hedeflenen nöronları, beyin bölgesi sınırlarına ve nöronların morfolojik özelliklerine göre Z yığını kullanarak konfokal mikroskopla görüntüleyin.
    NOT: Kullanılan konfokal mikroskop ayarları: 60 X (A/1.4, yağ) büyütme ve 488 nm dalga boyu kullanılarak 0.15 μm Z düzlemi aralığı (iğne deliği boyutu 30 μm; geri yansıtılmış iğne deliği yarıçapı 167 nm).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şartlandırılmış ortam, EcoHIV-EGFP enfekte 293FT hücrelerinin lentivirüslerinden toplanmıştır. Daha sonra konsantre edildi ve titretildi, daha sonra stereotaksik olarak F344/N sıçanlarının beynine (kortikal bölge) enjekte edildi. Enjeksiyondan yedi gün sonra sıçanlar kurban edildi ve bregma 5.64 mm'den bregma -4.68 mm'ye kadar değişen koronal beyin dilimlerinden görüntüler alındı. Şekil 1A'da, beyinde, özellikle korteks ve hipokampal dentat girusunda önemli EcoHIV-EGFP sinyalleri vardır. Ayr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokolde sıçanlarda EcoHIV kaynaklı HIV enfeksiyon modeli oluşturduk. Özellikle, enjeksiyondan 7 gün sonra sıçan beyninde aktif HIV enfeksiyonunu başarıyla indükleyen kortekse bilateral stereotaksik ecohiv enjeksiyonu tanımladık. Ayrıca, sıçanlarda EcoHIV enfeksiyonunun HAND'in temel yönlerini incelemek için iyi bir biyolojik sistem olabileceğini gösteriyoruz. Sekiz hafta sonra- EcoHIV enfeksiyonu, sıçanlar NAc MSN'lerinde zamansal işleme ve sinaptik disfonksiyondaki değişiklikleri içeren önemli nöroknaknitif bozukl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların hiçbirinin beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH tarafından HD043680, MH106392, DA013137 ve NS100624 hibeleri tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
293FT hücreleriThermoFisher ScientificR70007
Antibiyotik-Antimikotik çözeltiCellgro30004CI100X
Corning BioCoatJelatin 75cm² Havalandırmalı Kapaklı Dikdörtgen Eğimli Boyun Hücre Kültürü ŞişesiLife Technologies354488
Corning DMEM, L-Glutamin, 4.5 g/L Glikoz ve Sodyum Piruvatile Yaşam Teknolojileri10013CV
Kapak camıVWR637-137
matkap
Dumont #5 ForsepsDünyası Hassas Aletler14095
Dumont #7 Forseps DünyasıHassas Aletler14097
Eppendorf Snap-Cap Mikrosantrifüj Biopur Güvenli Kilit TüpleriLife Technologies22600028
Ethicon Vicryl Plus Antibakteriyel, 4-0 Polyglactin 910 Sütür, 27in. FS-2Med Vet InternationalVCP422H
Hamilton şırıngaHamilton1701
Invitrogen Lipofektamin 3000 Transfeksiyon ReaktifiYaşam TeknolojileriL3000015
İris ForsepsDünyası Hassas Aletler15914
İris MakasDünyası Hassas Aletler500216
Lentivirus ile İlişkili p24 ELISA KitiCell Biolabs, inc.VPK-107-5
Lenti-X KonsantratörTakaraPT4421-2
Opti-MEM I Azaltılmış Serum Orta ÖmürlüTeknolojiler11058021
ParaformaldehitSigma-Aldrich158127-500G
ParaformaldehitSigmaP6148
ProLong GoldFisher ScientificP36930
SevofluraneMerritt Veteriner Malzemeleri347075
stereotaksik cihazKopf InstrumentsModel 900
SuperFrost Plus SlaytlarFisher Scientific12-550-154%
Vannas MakasDünyası Hassas Aletler500086

Kaynaklar

  1. Illenberger, J. M., et al. HIV Infection and Neurocognitive Disorders in the Context of Chronic Drug Abuse: Evidence for Divergent Findings Dependent upon Prior Drug History. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (4), 715-728 (2020).
  2. Joseph, S. B., Swanstrom, R. The evolution of HIV-1 entry phenotypes as a guide to changing target cells. Journal of Leukocyte Biology. 103 (3), 421-431 (2018).
  3. Potash, M. J., et al. A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (10), 3760-3765 (2005).
  4. Albritton, L. M., Tseng, L., Scadden, D., Cunningham, J. M. A putative murine ecotropic retrovirus receptor gene encodes a multiple membrane-spanning protein and confers susceptibility to virus infection. Cell. 57, 659-666 (1989).
  5. Geraghty, P., Hadas, E., Kim, B. H., Dabo, A. J., Volsky, D. J., Foronjy, R. HIV infection model of chronic obstructive pulmonary disease in mice. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (4), 500-509 (2017).
  6. Gu, C. J., et al. EcoHIV infection of mice establishes latent viral reservoirs in T cells and active viral reservoirs in macrophages that are sufficient for induction of neurocognitive impairment. PLoS Pathogens. 14 (6), 1007061(2018).
  7. Ellenbroek, B., Youn, J. Rodent models in neuroscience research: is it a rat race. Disease Models, Mechanisms. 9 (10), 1079-1087 (2016).
  8. Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. Novel apparatus and method for drug reinforcement. Journal of Visualized Experiments. (42), e1998(2010).
  9. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry. Scientific Reports. 8 (1), 7869(2018).
  10. McGaughy, J., Sarter, M. Behavioral vigilance in rats: task validation and effects of age, amphetamine, and benzodiazepine receptor ligands. Psychopharmacology. 117 (3), Berl. 340-357 (1995).
  11. Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), (2016).
  12. McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Scientific Reports. 9 (1), 827(2019).
  13. McLaurin, K. A., Moran, L. M., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (146), e58659(2019).
  14. Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (158), (2020).
  15. Ko, A., et al. Macrophages but not Astrocytes Harbor HIV DNA in the Brains of HIV-1-Infected Aviremic Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 110-119 (2019).
  16. Sopper, S., et al. The effect of simian immunodeficiency virus infection in vitro and in vivo on the cytokine production of isolated microglia and peripheral macrophages from rhesus monkey. Virology. 220 (2), 320-329 (1996).
  17. Llewellyn, G. N., Alvarez-Carbonell, D., Chateau, M., Karn, J., Cannon, P. M. HIV-1 infection of microglial cells in a reconstituted humanized mouse model and identification of compounds that selectively reverse HIV latency. Journal of NeuroVirology. 24 (2), 192-203 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

EcoHIV Sıçan ModeliHIV Beyin EnfeksiyonuStereotaksik EnjeksiyonNörokognitif BozukluklarMikroglial EnfeksiyonTemporal İşlemeDendritik Diken MorfolojisiKonfokal MikroskopiLentiviral PaketlemeHIV Viral Rezervuarları
EcoHIV Beyin Enfeksiyonunun Bir Sıçan Modeli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.