Yöntem makalesi

Bağırsakları "NETLİK" ile Görüntülemek

DOI:

10.3791/62143

⸱

11 Haziran 2021

 , 
1Department of Pathology & Laboratory Medicine, Emory University, Atlanta, GA

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doku kesiti olmadan nöronlar, glia ve enteroendokrin hücreler (EEC) dahil olmak üzere subepitelyal dokuların görselleştirilmesini sağlamak için fare bağırsağının pasif CLARITY (PACT) boyama protokolünü açıklıyoruz. Protokol, formaldehitle sabitlenmiş dokunun hidrojel gömülmesini ve ardından dokuyu "temizlemek" için anyonik bir deterjan kullanılarak delipidasyonu içerir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CLARITY (Şeffaf Lipid Değişimli Akrilamid Hibritleştirilmiş Rijit Görüntüleme uyumlu Doku hYdrogel), son zamanlarda dokuyu delipide etmek (kesit almadan) ve immün boyama için 3 boyutlu doku yapısını korumak için akrilamid gömmeyi içeren değerli bir teknik olarak gelişmiştir. Teknik, homeostaz ve hastalık durumları sırasında farklı hücre tiplerinin etkileşime girdiği dinamik bağırsak ortamının görüntülenmesinde oldukça önemlidir. Fare bağırsağı için optimize edilmiş bu yöntem, epitel, enteroendokrin, nöronlar, glia gibi hücre tiplerinin ve sırasıyla mikrobiyal algılama veya besin kemoterapisine aracılık eden epitel veya enteroendokrin hücrelere nöronal projeksiyonların izlenmesine yardımcı olan burada açıklanmaktadır. Bağırsak dokusu (1-1,5 cm), 1. gün gece boyunca 4 ° C'de fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitlenir. 2. günde, PFA atılır ve doku PBS ile üç kez yıkanır. Doku, gece boyunca 4 °C'de PBS (% 30 ProtoGel'den seyreltilmiş)% 4 hidrojel (akrilamid) çözeltisi içinde inkübe edilerek bütünlüğünü korumak için hidrojel gömülüdür. 3. günde, doku hidrojel çözeltisi, hidrojel polimerizasyonuna izin vermek için 37  ° C'de 1 saat inkübe edilir. Doku daha sonra fazla hidrojeli çıkarmak için PBS ile üç kez nazikçe yıkanır. Delipidasyonun (temizleme) bir sonraki adımı, oda sıcaklığında (RT) bir çalkalayıcı üzerinde 2 gün (4. ve 5. günler) boyunca 37 ° C'de sodyum dodesil sülfat (PBS'de% 8 SDS) içinde doku inkübasyonunu içerir. 6. günde, temizlenen doku, SDS'yi çıkarmak için PBS ile iyice yıkanır. Doku, primer antikorlarda inkübasyon (% 0.3 Triton X-100 içeren PBS'de% 0.5 normal eşek serumu içinde seyreltilmiş), gece boyunca 4 ° C'de ve daha sonra RT'de 1.5 saat boyunca uygun ikincil Alexa Fluor antikorlarında inkübasyon ve DAPI (1: 10000) ile nükleer boyama ile immün boyanabilir. Doku temiz bir cam lam üzerine aktarılır ve konfokal görüntüleme için VectaShield kullanılarak monte edilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CLARITY (Şeffaf Lipid Değişimli Akrilamid Hibritleştirilmiş Rijit Görüntüleme uyumlu Doku hYdrogel), son zamanlarda immün boyama (kesit almadan) için 3 boyutlu doku yapısını korumak için akrilamid (hidrojel) gömme ve doku delipidasyonunu içeren değerli bir teknik olarak gelişmiştir1,2. Hidrojel gömülü doku optik olarak şeffaf ve makromolekül geçirgendir, lipitlerin deterjanla uzaklaştırılmasından sonra proteinler ve nükleik asitler korunur. CLARITY, Science3 tarafından 2013 yılında kayda değer on buluştan biri olarak kabul edildi. Başlangıçta lipitlerin ışık saçılımını ve görüntüleme kalitesini etkilediği lipid açısından zengin beyin dokularını görüntülemek için geliştirilmiş olsa da, teknik şu anda bağırsak, karaciğer, böbrek ve kalp gibi diğer dokuları görüntülemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Teknik, kesitleme ihtiyacını ortadan kaldırarak bir dokuyu boyama ve görüntüleme yeteneği sunar, aksi takdirde hücre tiplerinin düzensiz dağılımı nedeniyle hücre-hücre etkileşimlerinin önyargılı bir değerlendirmesine neden olabilir. Bu teknik aynı zamanda konfokal z-yığınları gerçekleştirme ve dokunun 3 boyutlu görüntüsünü yeniden oluşturma fırsatı sağlar, bu da çeşitli hücre tipleri arasındaki yoğunlukları, mikro mimariyi ve hücre-hücre etkileşimini bir doku kesitinden daha gerçekçi bir şekilde belirlemeye yardımcı olabilir. Ayrıca, teknik, kemik gibi yoğun dokuların immün boyamasına ve ayrıca in situ hibridizasyon çalışmalarına izin verecek şekilde modifiye edilmiştir. Hidrojel gömülü 3D doku, son zamanlarda Parkinson Hastalığı, Alzheimer, Otizm Spektrum Bozuklukları gibi hastalıkların patofizyolojisinin anlaşılması için çok önemli olduğu belirtilen epitelyal, enteroendokrin, glial ve nöronal hücreler arasındaki etkileşimleri aydınlatmak için çekici bir platform sunar4.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan tüm hayvan deneyleri, Emory Üniversitesi Hayvanların Kullanımı ve Bakımı Komitesi tarafından onaylandı. 8-12 haftalık C57BL / 6 farelere (hem erkek hem de dişi kullanılabilir) ötenaziden önce yiyecek ve suya ücretsiz erişim izni verildi.

1. Bağırsağın çıkarılması (1. Gün)

  1. Fareyi karbondioksit boğulma yöntemiyle, 2 dakika boyunca solunumun durması gözlenene kadar 1.6 mL karbondioksit gazı akış hızında ötenazi yapın).
  2. Fareyi, uzuvları sabitlenmiş bir diseksiyon tahtasına sırtüstü yerleştirin. Karnı% 70 etanol ile sterilize edin. Forseps kullanarak cildi makasla kesin.
  3. Karaciğeri nazikçe kaldırın ve mideyi tanımlayın. Daha sonra mideyi forseps ile tutarak, midenin hemen üzerindeki yemek borusunu kesin. Mideyi forseps ile tutarak, mezenterleri nazikçe kesin ve bağırsağı karın boşluğundan rektuma kadar çıkarın. Ayrılan bağırsağı rektumdan kesin.
  4. Ayrılan bağırsağı bir Petri kabında buz gibi soğuk bir PBS çözeltisine aktarın. Şimdi ileal segmentler arasındaki mezenteri nazikçe kesin ve bağırsağı düzeltin, böylece mideden başlayarak tüm mezenterler kolona kadar kesilir.
  5. CLARITY boyama için istenen bağırsak bölgesinden 1-1,5 cm'lik bir kısmı buz gibi soğuk PBS içeren yeni bir Petri kabına kesin.
  6. 20 G'lik bir iğnenin künt ucuna bağlı 5 mL'lik bir şırınga kullanarak, dışkı içeriğini buz gibi soğuk PBS ile yıkayın.
    NOT: Bağırsağın herhangi bir bölgesi aynı teknik kullanılarak CLARITY boyama için kullanılabilir. Bağırsak segmenti mezenter boyunca kesilerek açılabilir veya sonraki adımlar için sağlam olarak kullanılabilir.

2. Bağırsak dokusunun sabitlenmesi (1. Gün)

  1. Dokuyu PBS'de% 4 paraformaldehit (PFA) çözeltisine sabitleyin.
  2. Fiksasyon için 1-1.5 cm'lik ilgili bağırsak segmentini gece boyunca 4 ° C'de% 4 PFA ile doldurulmuş 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.

3. Hidrojel gömme (2. Gün)

  1. Bağırsak segmentini forseps ile% 4 PFA çözeltisinden PBS çözeltisi içeren yeni bir 15 mL konik tüpe aktarın ve kalan PFA'yı çıkarmak için üç kez (her biri 5 dakika, 150-200 rpm'de bir çalkalayıcıda) yıkayın.
  2. % 4 hidrojel hazırlanması
    1. Hidrojeli hazırlamak için% 30 jel solüsyonunu (ProtoGel) kullanın. % 4 hidrojel çözeltisi hazırlamak için,% 30'luk stok çözeltisini seyreltin, PBS içinde seyreltilir. 12 mL %4 hidrojel hazırlamak için 1.6 mL %30 jel solüsyonu alın ve 10.4 mL PBS ekleyin.
  3. Sabit dokuyu adım 3.1'den aktarın. 15 ml'lik bir konik tüpte PBS içindeki% 4'lük hidrojel çözeltisine ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edilir.
    NOT: Gece boyunca inkübasyondan sonra dokunun PBS kullanılarak PFA'dan arındırılmış olarak yıkanması şiddetle tavsiye edilir. PFA'da daha uzun süre saklanan doku, sonraki adımlar ve boyama ile iyi sonuçlar vermez. PBS yıkamalarından sonra sabitlenen doku bir hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.

4. Hidrojel polimerizasyonu ve delipidasyon (temizleme) aşaması (3. Gün)

  1. Hidrojel solüsyonu içindeki dokuyu içeren konik tüpü 4 °C'den çıkarın. 37 °C su banyosuna aktarın ve 1 saat inkübe edin. Bu adım hidrojel polimerizasyonuna izin verir.
  2. 1 saat sonra, su banyosunun hidrojel gömülü dokusunu içeren konik tüpü çıkarın ve akrilamid çözeltisini dökün. Şimdi fazla hidrojeli çıkarmak için dokuyu oda sıcaklığında tek bir PBS yıkama ile nazikçe durulayın.
  3. Delipidasyon aşaması
    1. Dokuyu PBS'de sodyum dodesil sülfat (% 8 SDS) içinde inkübe ederek delipidat. Hidrojel gömülü dokuyu adım 4.2'den 50 mL'lik konik bir tüpte% 8'lik bir SDS çözeltisine aktarın. Dokunun SDS solüsyonuna tamamen daldırıldığından ve tüpün kapaklı olduğundan emin olun.
    2. Dokuyu SDS'de içeren kapaklı 50 mL'lik tüpü, delipidasyona izin vermek için 2 gün (4. ve 5. günler) oda sıcaklığında 37 ° C'lik bir çalkalayıcıya (200 rpm) aktarın.
      NOT: 2 günlük inkübasyon sırasında 37 °C'de meydana gelebilecek herhangi bir buharlaşmayı telafi etmek için SDS çözeltisinin 50 mL konik tüpte en az 20-25 mL'ye kadar doldurulduğundan emin olun.
  4. 4. ve 5. günlerde, dokuyu oda sıcaklığında 37 ° C çalkalayıcıda (200 rpm) SDS'de inkübe edin.

5. Temizlenmiş dokudan deterjanın yıkanması (6. Gün)

  1. Dokuyu SDS solüsyonundan alın. Doku 'berrak' veya şeffaf görünecektir.
  2. Dokuyu PBS solüsyonu ile 50 mL'lik yeni bir komik tüpe aktarın ve tüm SDS izlerinin giderilmesini sağlamak için gün boyunca oda sıcaklığında bir çalkalayıcıda (150-200 rpm) birkaç PBS değişikliği ile yıkayın. PBS solüsyonunda en az 10 değişiklik, dokunun SDS'den arınmasını sağlayacaktır ve iyi bir kural, son PBS yıkamasında SDS'den köpük/köpük izi olup olmadığını kontrol etmektir. SDS sonraki boyama adımlarına müdahale edebileceğinden bu kritik bir adımdır.
    NOT: Günün sonunda, PBS'de birkaç yıkamadan sonra temizlenen doku artık immün boyama için hazırdır veya belki de 3 haftaya kadar 4 ° C'de saklanabilir.
  3. Temizlenmiş bağırsak dokularının PBS solüsyonunda bir aydan fazla saklanması, doku bütünlüğünü ve lekelenme kalitesini etkileyecektir. En iyi sonuçlar için temizlenmiş bağırsak dokusunu hemen veya temizlendikten sonraki 1-2 hafta içinde kullanın.

6. Nöronlar, glia ve enteroendokrin hücreler için immünofloresan boyama

  1. Temizlenmiş dokuyu 1.5 veya 2 mL'lik bir tüpe aktarın ve gece boyunca 4 ° C'de% 0.3 Triton X-100 içeren PBS'de% 0.5 normal eşek serumu içinde seyreltilmiş 500 μL hacminde ilgili primer antikorları inkübe edin. Kullanılan antikorlar (Ab): Tuj1 veya β-3-tubulin (Pan nöronal belirteç, 1: 1000), Glial Fibriler Asit Proteini (GFAP, 1: 500), Kromogranin A (1: 250).
  2. Gece boyunca inkübasyondan sonra, bağlanmamış primer Ab'yi çıkarmak için dokuyu 3 PBS yıkamasına (her biri 1-1.5 mL PBS kullanarak 5 dakika) maruz bırakın.
  3. Dokuyu yeni bir tüpe aktarın ve ardından karanlıkta oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca 500 μL uygun ikincil Alexa Fluor Ab (AF) ile inkübe edin. Kullanılan ikincil Ab, Tuj1 (1: 1000) için AF 488, GFAP (1: 500) için AF-555 ve Kromogranin A için AF 555'tir (1: 250).
  4. İnkübasyondan sonra, dokuyu Adım 6.2'deki gibi PBS ile üç kez yıkayın.
  5. Çekirdekleri boyamak için, dokuyu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DAPI'de (1: 10000 seyreltme veya 2 mL PBS'de 0.2 μL) inkübe edin.
  6. Son olarak, lekeli dokuyu temiz bir cam lam üzerine aktarın, dokunun üzerine lamel ekleyin ve konfokal görüntüleme için 100 μL VectaShield kullanarak monte edin.
  7. Slaytları karanlıkta, oda sıcaklığında, kuruması için 30 dakika boyunca bir sürgü tutucuya yerleştirin, ardından -20 °C'de görüntülenebilir veya saklanabilir. Fare bağırsağı duvarı oldukça incedir ve mezenter boyunca bir kez açıldıktan sonra, lamel ile doğrudan cam kızaklara monte edilebilir. Dalak, böbrekler gibi daha büyük dokularla çalışılıyorsa, odacık (boşluk) slaytları veya ara parçalar kullanılabilir. Gibi daha büyük dokular için, montaj için bir boşluk sürgüsü kullanılabilir.
    NOT: Bağırsak segmenti başlangıç adımında kesilmediyse (Adım 1'deki Not'a bakın), montaj adımlarını kolaylaştıracak bağırsak tüpünün mikro makasla kesilmesi tavsiye edilir.

7. Konfokal Görüntüleme

NOT: Temizlenmiş, lekelenmiş ve monte edilmiş doku hemen görüntülenebilir veya -20 ° C'de sürgülü kutularda saklanabilir.

  1. Konfokal mikroskop kullanarak görüntü (örneğin, Olympus FV1000).
  2. Bağırsak lümeninden serozal tabakaya doğru olan bölgeleri görselleştirmek için bağırsak dokusunun 50 μm kalınlığı boyunca z-yığınları alın.
  3. Z yığını görüntülerini görüntü dosyaları olarak saklayın, film dosyalarını .avi veya yazılım yardımıyla 3D görüntüye dönüştürün5.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CLARITY ile temizlenmiş fare bağırsak dokusundan alınan görüntüler Şekil 1'de temsil edilmektedir. Protokolün başarılı bir şekilde tamamlanması, tüm hücresel ayrıntıların net bir şekilde görselleştirilebildiği yüksek kaliteli, net görüntüler sağlar. Çekirdekler için DAPI boyama, doku bütünlüğünü gösterebildiği için CLARITY protokolünün kalitesini ve müteakip immün boyamayı değerlendirmek için çok iyi bir indekstir. Ayrıca, hücre şekli, özellikle farklı bir hücresel morfolojiye sahip nöronal,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CLARITY yöntemi, epitel, nöronlar ve glial hücreler dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerini, özellikle bağırsak duvarı boyunca lümen5'e uzanan nöronal projeksiyonlar ağını ve bunların glial ve EEC hücrelerine innervasyonunu 3D olarak görselleştirmek için fare bağırsağını boyamak için oldukça kullanışlıdır. Burada sunulan yöntem, Yang ve ark. 20141 tarafından yapılan orijinal çalışmaya göre değiştirilmiştir.

Pro...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Amerikan Gastroenteroloji Derneği (AGA) AGA-Roma Fonksiyonel GI motilite Bozuklukları Pilot Araştırma Ödülü (BC'ye), ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe AI64462 (ASN) ve Emory Üniversitesi Entegre Hücresel Görüntüleme Mikroskobu Çekirdeği'nden destek almak istemektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
PBS'de %4 paraformaldehit (PFA) ThermoFischer ScientificJ19943Doku fiksasyonu için kullanılır
4 ', 6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür (DAPI)ThermoFischer ScientificD13061/10.000 seyreltme
Alexa Fluor-488ThermoFischer ScientificA-110341/1000 seyreltme
Alexa Fluor-555ThermoFischer ScientificA-214281/500 seyreltme
Anti-GFAP (Glial Fibriler Asit Proteini)Abcamab72601/500 seyreltme
Anti-beta III Tubulin (veya Tuj1)Abcamab182071/1000 seyreltme
Kromogranin AAbcamab151601/250 seyreltme
ProtoGel % 30Ulusal TeşhisEC-890Toksik, tehlikeli, dikkatli kullanın-
Sodyum dodesil sülfatThermoFischer Scientific28364%8 kullanım için PBS'de% 4'lük
Vektör LaboratuvarlarıH-1000
PBS Vectashield montaj ortamında çözelti yapın

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
  2. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  3. 2013 Runners-Up. CLARITY makes it perfectly clear. Science. 342, 1434-1435 (2013).
  4. Fung, T. C. The microbiota-immune axis as a central mediator of gut-brain communication. Neurobiology of Disease. 136, 104714(2020).
  5. Chandrasekharan, B., et al. Interactions Between Commensal Bacteria and Enteric Neurons, via FPR1 Induction of ROS, Increase Gastrointestinal Motility in Mice. Gastroenterology. , (2019).
  6. Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164, 792-804 (2016).
  7. Muntifering, M., et al. Clearing for Deep Tissue Imaging. Current Protocols in Cytometry. 86, 38(2018).
  8. Cronan, M. R., et al. CLARITY and PACT-based imaging of adult zebrafish and mouse for whole-animal analysis of infections. Disease Models & Mechanisms. 8, 1643-1650 (2015).
  9. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
  10. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355(2019).
  11. Milgroom, A., Ralston, E. Clearing skeletal muscle with CLARITY for light microscopy imaging. Cell Biology International. 40, 478-483 (2016).
  12. Hu, W., Tamadon, A., Hsueh, A. J. W., Feng, Y. Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  13. Chen, Y., et al. Three-dimensional imaging and quantitative analysis in CLARITY processed breast cancer tissues. Scientific Reports. 9, 5624(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

CLARITY G r nt lemeBa rsak G r nt lemeAkrilamid G mmeDoku Delipidasyonu3D Doku Yap smm nboyamaFare Ba rsaKonfokal G r nt lemeEnteroendokrin H crelerN ronal Projeksiyonlar
Video yakında

İlgili makaleler