Mandibular Murine Modelinde Ortodontik Diş Hareketi Sırasında PDL Kollajen Liflerinin 3D Görüntülenmesi

Ortodontik diş hareketinde (OTM) altta kalan temel biyolojik süreç kemik tadilatıdır. Bu tadilat işleminin tetikleyicisi, periodontal ligamentin (PDL) yapısındaki hücreler arası matris (ECM) stresi, nekroz, kan damarı yıkımı ve oluşumu 1 ,^2,3gibi^{değişikliklere}atfedilir. Alveolar kemik tadilatı için diğer olası tetikleyiciler, kemikteki osteositler tarafından zorla algılamanın yanı sıra alveolar kemiğin kendisinin mekanik deformasyonu ile ilgilidir; ancak OTM'deki rolleri hala tam olarak aydınlatılmamıştır^4,5.

OTM sırasında PDL'nin yapı-işlev ilişkilerini ortaya çıkarmayı amaçlayan birçok çalışmaya rağmen, net bir fonksiyonel mekanizma henüz tanımlanmamıştır^6,7. Bunun başlıca nedeni, iki sert doku (çimento ve alveolar kemik) arasında bulunan yumuşak bir dokunun (PDL) verilerinin alınarak ele geçirildir. Yapısal bilgi toplamak için kabul edilen yöntemler genellikle PDL yapısını bozan ve değiştiren sabitleme ve bölümleme gerektirir. Ayrıca, bu yöntemlerin çoğu, bozulmamış olsa bile, yalnızca kısmi ve yerelleştirilmiş bilgiler veren 2D veriler sağlar. PDL yapısında ve işlevinde tekdüze olmadığından, tüm diş-PDL-kemik kompleksinin sağlam 3D yapısını ele alan bir yaklaşım garanti edilir.

Bu makalede, farelerde bir OTM oluşturmak için bir yöntem ve pdl'deki kollajen liflerinin numunenin herhangi bir bölümü olmadan 3D görselleştirilmesini sağlayan iki yöntem açıklanmaktadır.

Murine modelleri tıp, gelişim biyolojisi, ilaç teslimi ve yapısal çalışmalarda in-vivo deneyler için yaygın olarak kullanılmaktadır. Belirli proteinleri ve fonksiyonları ortadan kaldırmak veya geliştirmek için genetik olarak değiştirilebilirler; hızlı, tekrarlanabilir ve öngörülebilir gelişimsel kontrol sağlarlar; ayrıca küçük boyutları nedeniyle görüntüleri kolaydır⁸. Birçok avantajlarına rağmen, diş araştırmalarındaki fare modelleri, özellikle klinik manipülasyonlar garanti edildiğinde, çoğunlukla küçük boyutlu dişler nedeniyle sık kullanılmaz. Sıçanlar⁹,^10,11,köpekler¹²,^13,domuzlar^{14 , 15,16}ve maymunlar¹⁷ gibi hayvan modelleri farelerden daha sık kullanılır. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme tekniklerinin son zamanlarda gelişmesiyle, OTM'deki dolambaçlı süreçleri çözmek için bir fare modeli kullanmanın avantajları çoktur. Bu makale, kemik tadilatını tetikleyen sabit kuvvet seviyelerine sahip mandibuladaki azı dişinin mesial hareketini oluşturmak için bir yöntem sunun. Kemirgenlerdeki OTM deneylerinin çoğu maksillada yapılır, çünkü mandibulanın hareketliliği ve dilin varlığı başka bir karmaşıklık seviyesi ekler. Bununla birlikte, 3D yapısal bütünlük istendiğinde mandibula birçok avantaja sahiptir. Bütün bir kemik olarak kolayca parçalanabilir; bazı türlerde lifli senfonik yoluyla iki hemi-mandibulaya ayrılabilir; kompakt, düzdür ve herhangi bir sinüs alanı olmayan sadece dişleri içerir. Buna karşılık, maksilla kafatasının bir parçasıdır ve diğer organlar ve yapılarla yakından ilgilidir, bu nedenle alveolar kemiği ilişkili dişlerle parçalamak için kapsamlı bir bölümleme gerekir.

Faz geliştirme sağlayan yüksek çözünürlüklü bir mikro BT içindeki bir yükleme sistemine bağlı bir ev içi nem odası kullanarak, daha önce açıklandığı gibi^3Dtaze lifli dokuları görselleştirmek için bir yöntem geliştirdik 9 , 18^,19,20,21,^22,23. Taze dokular, hayvan herhangi bir lekelenme veya fiksasyon olmadan kurban edildikten hemen sonra taranır, bu da doku eserlerini ve biyomekanik özelliklerin değişikliklerini azaltır. Bu 3D veriler, başka bir yerde açıklandığı gibi liflerin dağıtım ve yön analizleri için kullanılabilir¹⁹.

Burada sunulan ikinci 3D tüm doku görüntüleme yöntemi, PDL liflerinin herhangi bir kesit olmadan kemik yoluyla görüntülenmesini sağlayan mandibulanın optik olarak temizlenmesine dayanmaktadır. İlginçtir ki, kemiğin kollajen liflerinin görselleştirilmesini de sağlar, ancak bu burada tartışılmaz. Genel olarak, doku temizleme için iki yöntem vardır. Birincisi, numunenin basit bir daldırma, hiperhidrasyon veya hidrojel gömme yoluyla 1,4'ten büyük bir kırılma indeksine sahip sulu bir çözeltiye batırıldığı sulu bazlı temizlemedir. Bununla birlikte, bu yöntem şeffaflık düzeyinde olduğu kadar dokunun yapısal korunmasında da sınırlıdır ve bu nedenle dokunun sabitlenerek yapılmasını gerektirir. Son derece şeffaf numuneler veren ve fiksasyon gerektirmeyen ikinci yöntem solvent bazlı temizleme yöntemi^24,25. Mandibular numuneler için etil-3-fenilprop-2-enoate (etil cinnamat, ECi) bazlı modifiye solvent bazlı bir temizleme yöntemi oluşturduk. Bu yöntem toksik olmayan gıda sınıfı temizleme maddesi, minimum doku büzülmesi ve floresan proteinlerin korunması avantajlarına sahiptir.

Tüm hayvan deneyleri, NIH'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımına ilişkin Yönergeleri ve Harvard Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak gerçek gerçekleştirildi (Protokol no. 01840).

1. Ortodontik Diş Hareketi

1. Bir fare yatağı oluşturmak için, kama şeklinde, 45 ° açılı bir başlık ile düz bir plastik platform kullanın. Başlık plastik bir kutu kesilerek oluşturulabilir.
   1. Başlık ve masa düzlemi arasında yaklaşık 30° açı oluşturmak için platformun baş ucunu yükseltin. Üst kesici dişleri tutmak için baş yan uca bükülmüş kalın bir ataş (0,036" çapında) takın.
   2. Kuyruk ucunda, alt kesici dişleri tutmak için ortodontik bir güç zincirinin takılabileceği yükseltilmiş bir yüzey oluşturun. Örnek bir platform için Şekil 1'e bakın.
2. 10 mg/ kg'da intraperitoneal ksilazin enjeksiyonu ve 1 mL şırınga ve 27 Gauge iğne kullanarak ketamin 100mg / kg ile fareyi uyuşturun.
3. Uyuşturuldu fareyi özel yapım platforma yerleştirin ve üst kesici dişleri ataç halkasına bağlayarak üst çeneyi hareketsiz hale getirin. Alt kesici dişlere bağlı ortodontik güç zinciri ile fare alt çenesini açın. Mini-colibri ağız retraktörü ile yanakları geri çekin.
4. Platformu cerrahi bir mikroskop veya 5-6x büyütmeye ulaşabilen başka bir stereoskop altına yerleştirin.
5. Kornea dehidrasyonunu önlemek için fare gözlerine 50 μL salin (kabaca 1 damla) uygulayın. Her 20 dakikada bir salin doldur.
6. 1 cm uzunluğunda alüminyum telin bir parçasını (0,08 mm çapında) kesin. Mikrocerrahi iğne tutucu kullanarak birinci ve ikinci azı dişleri arasındaki temas noktasını lingual olarak bukkal taraftan kaydırın. yay ucuna geçirilmek üzere ilk azı dişinin önüne 2 mm serbest kenar bırakın.
7. Yaklaşık 7 ila 9 iplik uzunluğunda bir nikel titanyum (NiTi) bobini kesin.
   NOT: Bobinin elastik özellikleri ortodontik hareket için sabit kuvvet sağlayacaktır. Bobinin toplam sınırsız uzunluğu kesici diş ile azı dişi arasındaki boşluktan daha kısa olmalıdır. Dişin bobinini tutturmak için her iki ucunda fazladan 2 dişe ihtiyaç olduğunu unutmayın. Mikro CT taraması sırasında ışın sertleştirme gibi tarama yapıtlarını azaltmak için alüminyum tel seçilir.
8. NiTi bobin yayı (0,15 mm tel çapı, 0,9 mm iç bobin çapı; alt ilk azı dişi ve alt kesici diş arasına 10 g kuvvet sağlar) yerleştirin. 1.6. adımda ilk azı dişinin etrafına yerleştirilen tel bağını kullanın, bobini azı dişi tarafındaki sabitlemek için kabloyu bobin yayı etrafında sıkıca bükün.
9. Düzgün kuvvet seviyesi sağlamak için, ilk azı dişi ve kesici diş arasında tam olarak 3 aktif diş kullanın. Güç zincirini kesici dişten geçici olarak çıkarın ve bobini tutturmak için kesici diş üzerinde 2 ila 3 sınırlanmamış diş döngüsü. diş parçacıklarını kesici diş serbest dişeti kenar boşluğuna kaydırın.
10. Bobinin insidans sınırına bir akışlı kompozit reçine tabakası yerleştirin ve diş kürleme ışığı ile kürleyin. Reçineyi iyileştirdikten sonra güç zincirini değiştirin.
11. Aynı kür ışığını kullanarak, NiTi bobini 20 sn ısıtın. Bu, NiTi bobini sıkır. Bitmiş yerleşim Şekil 1Cgösterilir.
12. Kontralteral tarafı sağlam bırakın veya birinci ve ikinci azı dişleri arasına tel gibi bir düzmece yerleştirin.
13. Fareyi iyileşene kadar sıcak tutmak için anestezi edilmiş fareyi ısıtılmış bir ışığın altına yerleştirin.
14. Fareyi tekrar tek bir kafese yerleştirin ve günlük olarak izleyin. Ortodontik hareket sırasında diyet değişikliğine gerek yoktur.
    NOT: Bir tarafta OTM cihazı bazı rahatsızlıklara neden olur, ancak beslenmeyi bozmaz. Bununla birlikte, her iki tarafa da cihaz takmak, ilave rahatsızlık miktarı nedeniyle tavsiye edilir. Dışa doğru ağrı belirtileri görülmediği sürece ağrı kesiciye gerek yoktur.

2. Taze hemi-mandibulalarda PDL liflerinin mikro-CT taraması

1. Hemi-mandibula montajı (Şekil 2)
   1. İstenilen ortodontik hareket süresinden sonra, fareyi servikal çıkık yoluyla feda edin. Mandibulayı çıkarın ve hemi-mandibulalara ayırın.
      NOT: Numune düzeltilmeyeceğinden, çenenin diseksiyonunun ve montajının en kısa sürede, ideal olarak 30 dakika içinde yapılması önemlidir.
   2. Temiz tüy bırakmayan bir mendille çevredeki yumuşak dokuyu nazikçe çıkarın.
   3. Ortodontik cihazı, stereo mikroskop altında mikrocerrahi makas ve cımbız kullanarak en az 4 kat büyütme ile çıkarın.
   4. Numuneyi 1,5 mL hacimde, mikro santrifüj tüpünde ve suyla nemlendirilmiş tüy bırakmayan bir silme parçasında saklayın.
   5. Paketlenebilir diş kompozit reçinesini sahnedeki numune yuvasına yerleştirin, ardından taze hemi-mandibulayı kompozit içine yerleştirin. Montajdan önce, diş kompoziti ile temas eden kemik yüzeyinin yumuşak dokulardan arındırılmış ve kuru olduğundan emin olun, aksi takdirde diş kompoziti düzgün bir şekilde tedavi etmeyecektir.
   6. İlk azı dişi sahnenin orta çizgisi oluğuna ortalanana kadar hemi-mandibulanın konumunu ayarlayın. Oklüzal yüzeyin yatay olduğundan emin olun. Konumlandırmadan memnun kaldığında kompoziti iyileştirin.
      NOT: Numunenin stabilize edilmesine yardımcı olmak için hemmi mandibulanın yanlarına ve/veya kesici ucun üzerine ek az miktarda diş kompoziti yerlenebilir.
   7. Örnek aşamasındaki nem havuzlarının içine sönümlenmiş tüy bırakmayan mendil yerleştirin. Diş kompozitini ilk azı dişinin oklüzal yüzeyine yerleştirin. Odayı kapatmadan önce, numune seviyesinde x-ray yolunu hiçbir şeyin engellemediş olduğundan emin olun.
   8. Odayı mikro-CT'ye yapıştırın. Hazneyi mikro-CT numune aşamasına vidalayarak görüntüleme sırasındaki hareketin en aza indirilmesini sağla.
   9. X ışınlarını açın ve örs dikey olarak indirilirken, örs ucu kompozitle çevrilinceye kadar 2D görüntüler çekin, ancak kuvvette bir artış tespit edilir.
   10. Örs kompozit içine gömüldükten sonra x-ray kaynağını kapatın. Ardından, mikro CT odasını açın ve kompoziti açık Pleksiglas pencereden iyileştirin.
2. Mikro BT ayarları
   1. Kaynak voltajı 40 kV ve akımı 200 μA olarak ayarlayın. Yakalanan görüntüler için 2 binning kullanın.
      NOT: PDL kemik ve dişten önemli ölçüde daha az yoğun olduğundan, PDL'yi görselleştirmek daha yüksek güç ve pozlama süresi gerektirir. Bu protokol PDL'yi görselleştirmek için ayarlar sağlar.
   2. Tek görüntü pozlama süresini 25 s olarak ayarlayın. Örnek aşamanın dönüşünü 183 derece veya daha fazla bir aralığa ayarlayın. 2500 projeksiyon için taramayı ayarlayın. Herhangi bir x-ışını kaynak filtresi kullanmayın, elde eden taramaların her iki tarafında 0,76 μm voksel boyutu vardır.
   3. Mikro BT yönergelerine göre uygun rekonstrüksiyon için bir referans taraması toplayın. Toplam projeksiyon olarak 1/3 sayıda referans görüntü kullanın. Geri projeksiyon filtreli bir algoritma kullanarak, ek binning olmadan birimi yeniden oluşturun.

3. Temizleme yöntemi (Şekil 3)

1. Beş 1,5 mL mikro santrifüj tüpü hazırlayın.
2. 1,5 mL mikro santrifüj tüplerde aşağıdaki çözeltilerden 1,4 mL hazırlayın: Fosfat tamponlu salinde (PBS) %4 paraformaldehit (PFA), deiyonize (DI) suda %50 etanol (EtOH), DI suyunda %70 EtOH ve %100 EtOH iki tüp.
   NOT: PFA, numunenin sabitlenmesi için kullanılır. ECi temizleme, düzeltilmemiş numuneler üzerinde de çalışır. Düzeltilmemiş örnekleri temizlemek için PFA adımını atlamanız yeterlidir.
3. %4 PFA'da parçalanmış hemi-mandibula yerleştirin. Alüminyum folyo ile örtün ve 6 saat boyunca oda sıcaklığında yumuşak ayarda sallayıcıya yerleştirin.
4. Hemi-mandibulayı % 50 EtOH'a taşıyın. 16 saat boyunca ışıktan kaplanmış rocker üzerine yerleştirin.
5. Hemi-mandible'ı % 70 EtOH'a taşıyın. 16 saat boyunca ışıktan kaplanmış rocker üzerine yerleştirin.
6. Hemi-mandible'ı % 100 EtOH'a taşıyın. 16 saat boyunca ışıktan kaplanmış rocker üzerine yerleştirin.
7. 3.6'ı tekrarlayın. ikinci %100 EtOH tüpünde.
8. Bir cam veya polipropilen tüpte 5 mL ECi hazırlayın.
   NOT: ECi polistireni çözrür, ancak polipropilen çözmez. Ayrıca, floresan proteinli bir doku kullanmazsa, numune temizleme işlemi sırasında ışığa maruz kalabilir.
9. Hemi-mandibulayı ECi tüpüne taşıyın. Tüpü alüminyum folyo ile örtün ve en az 12 saat boyunca hafif bir ayarda rocker üzerine yerleştirin.
   NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Susuz numune oda sıcaklığında ECi'de saklanabilir. ECi'nin donma veya erime noktası 6,5 ila 8,0 °C'dir. 4 °C'de saklamayın.
10. Hemi-mandibula floresan mikroskop ile görüntüleme için hazırdır.
    NOT: Görüntüleme sırasında, optik olarak saydam kalabilmesi için numunenin ECi'ye batırılması gerekir.

Bu makale, OTM üretmek için bir yöntemin yanı sıra PDL içindeki kollajen liflerinin herhangi bir bölümleme olmadan 3D görüntülenmesi için iki yöntem sürmektedir. Hayvansal araştırma amacıyla, dişlerin hizalanması gerekli olmadığında, alveolar kemiğin tüm kök seviyelerinde yeniden şekillendirilmesini sağlarsa, bir diş hareketi ortodontik olarak kabul edilir. Güvenilir bir OTM oluşturmak için dişlere uygulanan sabit kuvvet seviyesi gereklidir. Burada, etkinleştirilmiş bir şekil-bellek NiTi bobini, garanti edilirse 7 gün ve sonrasındaki deneysel süre boyunca 10 g tutarlı bir kuvvet oluşturmak için kullanılır. Burada açıklanan bobin aktivasyonu (Şekil 1) martensitik faz içinde NiTi bobininde suş oluşturur ve bobini dişe sürekli stres sağlayan histegenez durumuna getirir. Bobin yerleştirildikten sonra bobini kürleme ışığı ile ısıtmak da alaşımların austenitik formuna kaymasını ve şekil bellek etkisinin gerçekleşmesini sağlayacaktır.

Burada 9 haftalık erkek farelerden temsili sonuçlar gösteriyoruz. 7 günlük OTM'den sonra birinci ve ikinci azı dişlerinin kronları arasındaki ortalama mesiodistal boşluk, mikro-CT'deki azı dişlerinin 1X büyütmeli interproksimal yüzeyleri arasında ölçüldüğü gibi 40 μm'dir (n=12, st.dev. = 15 μm) (Şekil 1E). PDL'nin mesiodistal yönde ortalama alanı 7 günlük OTM öncesi ve sonrası 80 μm'dir(Şekil 4B). Bu, ilk azı dişinin mesially ve 7 gün, doğada kemik erimesi ve apseleme işlemleri oluştururken bir fare modelinde OTM üretmek için yeterli bir zaman olduğunu doğrular (Şekil 4). Fareler standart bir sert palet diyeti ile beslendi. Cihaz takılması sonrası diyet değişikliği yapılmadı.

OTM sırasında diş-PDL-kemik kompleksindeki değişiklikleri görselleştirmek için sunulan ilk yöntem, daha önce 9 , 18 ,19, 20 ,22,23olarak açıklanan taze dokuların faz-geliştirilmiş mikro-CT görüntülemesine dayanmaktadır (Şekil 4). Kısacası, bir mikro-CT veya senkrotron faz geliştirme yeteneği, lifli dokunun mekanik stabilizasyonu ve nemlendirilmiş ortam sağlanan, taze kollajenöz lifler herhangi bir fiksasyon veya zıt ajanlar olmadan görselleştirilebilir. PDL'de görülen lifler hem dişe hem de kemiğe bağlı olanlardır, özellikle tip I kollajen19. 3D'de sağlam bir PDL'yi görselleştirmek için bu eşsiz fırsat, daha önce açıklandığı gibi 3D lif yoğunluğunun, liflerin yönünün ve dişin 3D hareketinin analizini sağlar9,19. Özellikle, burada PDL'deki lifli ağın görselleştirilmesini sunuyoruz. Zaman 0'da hem kemikte hem de PDL'de fizyolojik tadilat gözlenebilir. Remodeling hücresel çimentoda da meydana gelir; ancak, bu sunulan yöntemle doğrudan ilişkili değildir ve bu nedenle ayrıntılı olarak detaylandırılmayacaktır. Kemik-PDL arayüzü, herhangi bir kuvvet uygulamasından önce hem enine (Şekil 4A) hem de sagittal (Şekil 4B) düzlemlerde çoğunlukla pürüzsüzdür. Koronal düzlemde (Şekil 4C), kemik-PDL arayüzü özellikle yeniden şekillendirme dengesinin resorpsiyona doğru yöneldiğini gösteren apikal bölgeye doğru daha serttir. İlk azı dişinin mesially olarak taşındığı 3 günlük OTM'de(Şekil 4D-F),PDL'deki lif yoğunluğu azalır (beyaz ok kafaları). Kemik-PDL arayüzü, kemik yüzeyinde osteoklastik aktivitenin göstergesi olan kraterlerin gelişimi ve PDL26'dakiesas olarak sıkıştırma kuvvetleriyle ilişkili kemik erimesi işlemleri nedeniyle 0 günden daha pürüzlüdür , ancak burada 3 günde gerginlik bölgelerinde görülür. PDL içindeki gerginlik bölgelerinde doku yıkımı27,28 önerildi ve bu yöntem kullanılarak açıkça görülebilir. Pürüzlü sınır köklerin farklı seviyelerinde (beyaz oklar) görülür ve bu nedenle diş hareketinin sadece tacın devrilmesi değil, doğada çevirisel olduğunu gösterir. 7 günlük OTM'de (Şekil 4G-I), kemik içindeki kraterler, pürüzlü sınırlar ve PDL alanının genişlemesi gibi kemik resorpsiyon işaretleri tüm düzlemlerde görülür, ancak ortalama PDL alanı 3 günlük OTM'den daha dardır(Şekil 4D-F). Bununla birlikte, bazı bölgelerde, kemik-PDL sınırı 7 günlük OTM'den sonra daha pürüzsüz hale gelmiştir, bu alanlar köklerin distal yüzeylerinde bulunur, bu da otm'de beklendiği gibi kemik apsasyonu için bir göstergedir.

Uzun mikro-CT görüntüleme süresi (~19 h) ve aşamanın dönüşü nedeniyle, numunenin yerinde kalması için numunenin montajı esastır. Kararsız numune bulanık taramalara neden olur. Şekil 5, numune tarama sırasında hareket ettiğinde mikro BT taramasının nasıl göründüğünü sunar. Diş ve kemik bulanık. Ne PDL lifleri ne de osteositler gözlenmez. Bu tür olaylarda, bir nesnenin kenar boşluğunun etrafında bir siluet bulunur. Şekil 5'tediş tacında birden fazla anahat (ok) görülebilir.

Araştırma hedefine bağlı olarak, PDL liflerinin çözünürlüğü ve görselleştirilmesi, sadece sert dokular hakkında bilgi istendiğinde daha kısa tarama süresi için ticarette feda edilebilir.

PDL fiberlerinin herhangi bir kesit olmadan 3D görselleştirilmesi için tamamlayıcı bir yöntem, ECi kullanılarak optik olarak temizlenen numunelerde optik mikroskopi ile yapılır (Şekil 3). Bu yöntem sabitlenmeden bir numunede kullanılabilir ve temizlemeden önce dokuda bulunan floresan sinyallerini korur. ECi temizlemeden önce ve sonra hemi-mandibulalar Şekil 3B ve 3C'de gösterilmiştir. Bir ızgara kağıdı mandibulanın ramus'u boyunca görülebildiğinde PDL'nin yeterli numune temizlenmesi doğrulanabilir. Temizleme miktarı, dehidrasyon işleminin uzaması ile ayarlanabilir. Şekil 6, hem alveolar kemikte hem de PDL'de temizlenmiş bir mandibuladaki kollajen liflerinden gelen ikinci harmonik nesil (SHG) sinyalini göstermektedir. Kemiğin kollajen liflerinin 3D olarak görüntülenmesi, genellikle FIB/SEM gibi elektron mikroskopi yöntemlerini kullanan karmaşık bir süreçtir. Bununla birlikte, ECi tabanlı temizleme yöntemi ve SHG kullanılarak, alveolar kemik lifleri özellikle yatay yönde açıkça görülmektedir. Örnek kemik yüzeyinden PDL'nin derinliklerine çevrilirken, lifler aniden dikey bir seviyeye yönelimlerini değiştirdiğinden PDL lif seviyesine geçiş çok açıktır.

Işık çizelgesi mikroskopisi, floresan proteinlerin kemik yoluyla görüntülenmesi için de kullanılabilir. Transgenik flk1-cre'dentemizlenmiş bir örnek durumunda; Tdtomato fare19,29,30, kan damarlarını kaplayan floresan endotel hücreleri açıkça gözlenir ( Şekil7A,B, C, E). Uygun temizleme, ışık sayfası mikroskopisi ile anlaşılabilir görüntüler oluşturmanın anahtarıdır. Kemik tamamen temizlenmediğinde, PDL içindeki kan damarları gözlenmedi(Şekil 7D, F).

Şekil 1: Ortodontik cihaz yerleştirme kurulumu. A. Hayvanı desteklemek ve ağzı açık tutmak için laboratuvar malzemelerinden yapılmış fare yatağı. Gövde için plastik platform (PP) 30° eğimde ve başlık (HR) PP yüzeyinden 45° açıyla. PP'nin uç kafasını yükseltmek için 2 katmanlı bir boru standı (TS) kullanılır. Ataş döngüsü (siyah ok) üst kesici dişleri tutturur ve alt ortodontik güç zinciri (beyaz ok) alt kesici dişlere bağlanır. Azı dişlerinin görsel muayenesi için 5 mm çapında muayene aynası kullanılmıştır. B. Fare yatağının yan görünümü. Yüzeyler arasındaki açılar işaretlenir (yeşil ve macenta). C. Düzgün yerleştirilmiş cihazın temsili görüntüsü. D. Cihaz implantasyonundan önce muayene aynası ile görülen azı dişleri. E. Ortodontik hareket sonrası azı dişlerinin temsili görüntüsü. Kesik çizgiler birinci ve ikinci azı dişlerinin ana hatlarını izler. F. Cihazın şeması ve yerleşimi. Kırmızı çizgi, ilk azı dişi etrafındaki tel bağını temsil eder. Turuncu çizgi, bobini tutturmak için kullanılan akışlı kompozit reçineyi temsil eder. NiTi bobin mavi renkte gösterilir ve etiketlenmiştir. G. 7 günlük ortodontik hareket sonrası takılan cihazla parçalanmış hemi-mandibula. Bobinin 7 gün sonra hala aktif olduğunu gösteren 3 bobin ipliğinin hala nasıl açık olduğunu unutmayın. Ölçek çubuğu = E ve G'de 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Mikro BT görüntüleme için özel yapım bir odaya monte edilmiş hemi-mandibula. X-ray kaynağı solda ve dedektör sağda görülür. Kırmızı dikdörtgen, örnek aşamasındaki (SS) odaya monte edilen hemmi mandibulayı özetler. Burada gösterilen örnek oda, motor (M), örs (A, beyaz kesik çizgilerle özetlenmiştir) ve haznenin üstündeki örs mili (AS) dahil olmak üzere mekanik bir test kurulumunun bir parçasıdır. Tam kurulum CT sahnesine vidalanmış. İç görüntü, içinde numune bulunan nem odasını içeren kırmızı anahatlı bölgenin yakın çekimini gösterir. B. Örnek aşamasına monte edilen numunenin üst görünümü. Nem havuzları (gri ok), görüntüleme sırasında nemi korumak için çevreye yerleştirilmiştir. Ortadaki dairesel sahnede, hemi-mandibula eğimli derin oluğa (siyah ok) monte edilebilir. İnce bir oluk (beyaz ok), numunenin yönlendirilirken yardımcı olmak için sahnenin orta çizgisini işaretler. C. Örnek oluklu dairesel aşamanın diyagramı. Oluğun eğimi mandibulayı destekler ve azı dişlerinin köklerin dikey ekseni boyunca monte edilmesine izin verir. D. Temsili mikro-CT 2D dilim, hemmi mandibula örneğinin 3D hacimli görüntüsüyle birleştirildi. Buradaki galaksiler arası boşluk 52 μm. Örnek aşağıdaki örnek aşamasına monte edilir (gösterilmez) ve örs (A) diş kompoziti (DC) ile üsttedir. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. Parçalanmış fare hemi-mandibulaları için ECi tabanlı temizleme yöntemi. A. Parçalanmış hemi-mandibula ardışık olarak % 4 PFA, % 50 EtOH, % 70 EtOH ve% 100 EtOH'a daldırılır. Dehidrasyondan sonra, hemi-mandibula görüntülemeye kadar en az 12 saat boyunca ECi'de saklanır. B. Diseksiyondan hemen sonra hemi-mandible. C. Temizleme tamamlandıktan sonra hemi-mandible. Ölçek çubukları = 5 mm Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Ortodontik hareketin farklı aşamalarında yeni bir numunenin PDL'sinde temsili yerinde mikro-CT taramaları. A-C, Ortodontik hareket yok. A. Alveolar kemiğin B-Buccal, L-Lingual taraflarındaki mesial (M) ve distal (D) kökleri gösteren hemmi-mandibulanın enine düzleminde mikro-CT 2D görüntü. Diş kökleri ve alveolar kemik arasında PDL alanı ve içindeki lifler açıkça gözlenir. B. Sagittal düzlemde 2D görüntü. C. Koronal düzlemde 2D görüntü. D-E, 3 günlük OTM'den sonra 2D görüntüler, ok başları KOLLAJEN lif yoğunluğunda azalma ile PDL'deki alanları, beyaz oklar kemik erimesi alanlarını işaret eder. G-I, 7 günlük OTM'den sonra 2D görüntüler, siyah oklar kemik appozisyon bölgelerini işaret eder. Ölçek çubukları = 150 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Sagittal düzlemde 2D mikro-CT görüntüsü, tarama sırasında dişin hareketine bağlı olarak hem dişin hem de kemiğin bulanık yapılarını gösterir. Oklar dişin birden fazla tahta çizgisini işaret eder ve hareketini gösterir. Ölçek çubuğu 150 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: ECi, ikinci harmonik nesil (SHG) ile görüntülenmiş ilk azı dişini gösteren temizlenmiş mandibula. Pdl'nin kolajen liflerinin görüldüğü bir bölgede beyaz ok noktaları, dikey yönelime dikkat edin, siyah oklar PDL'nin hem dikey liflerinin hem de alveolar kemiğin yatay liflerinin görüldüğü bir bölgeyi işaret eder. T-tooth, F-furcation, AB-alveolar kemik, MR-mesial kök, DR-Distal kök, ölçek çubuğu 150 μm. Görüntüler, 1.33-1.56 RI'ya sahip çözümler için 20X çoklu daldırma lensi kullanılarak elde edildi. Excitation lazer 860nm güçte ayarlandı. Piksel konut süresi: 0.51μs; Tarama modu: çerçeve; Ortalama: 16; Dedektör Türü: sıradan fotomultiplier tüp dedektörü; Dedektör Kazancı 800V. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7. ECi temizlenmiş Flk1-Cre;tdTomato faresinin lightsheet mikroskop görüntüleri. A. En iyi şekilde temizlenmiş kontrol hemi-mandibula. Kemik (ok kafası) ve PDL alanı (ok) içindeki kan damarları ağı görülebilir. B. ilk azı dişinin mesiolingual bölgesinin başlangıcı (A'da özetlenen kırmızı) kan damarlarını gösterir. C. en iyi şekilde temizlenmiş 7 günlük OTM hemi-mandibula ve D. alt-en uygun şekilde temizlenmiş hemi-mandibula. E. Sagittal düzlemde C panelinin 2D görüntüsü, görüntü kemik (gri ok) ve PDL uzayında (beyaz oklar) iyi tanımlanmış kan damarlarını gösterir. F. Panel D'nin iki boyutlu dilim görüntüsü, E'deki görüntülerle aynı bölge, bulanık bir görüntüyle sonuçlanır. Ölçek çubukları A, C, D = 500 μm, B, E, F = 100 μm Kamera dedektör olarak kullanılarak 5X plan hedefiyle çekilmiştir. Excitation lazer %4 güçte 561 nm idi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.