Farelerde ortodontik diş hareketi oluşturmak için bir protokol ve periodontal ligamentin kollajen liflerinin ve kan damarlarının bölümlenmeden 3D görselleştirilmesi için yöntemler sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Farelerde ortodontik diş hareketi oluşturmak için bir protokol ve periodontal ligamentin kollajen liflerinin ve kan damarlarının bölümlenmeden 3D görselleştirilmesi için yöntemler sunuyoruz.
Ortodontik diş hareketi, dış kuvvetlerin bir sonucu olarak değiştirilmiş yumuşak ve sert doku tadilatının karmaşık bir biyolojik sürecidir. Bu karmaşık tadilat süreçlerini anlamak için diş ve periodontal dokuların 3D bağlamlarında incelenmesi ve bu nedenle herhangi bir kesit ve doku yapıtının en aza indirilmesi kritik öneme sahiptir. Fare modelleri genellikle gelişimsel ve yapısal biyolojinin yanı sıra küçük boyutları, yüksek metabolizma hızları, genetikleri ve kullanım kolaylığı nedeniyle biyomekanikte de kullanılır. Prensip olarak bu aynı zamanda onları dişle ilgili çalışmalar için mükemmel modeller yapar. Bununla birlikte, büyük bir engel, küçük diş boyutları, özellikle azı dişleridir. Bu makale, ortodontik diş hareketinin oluşturulması için adım adım bir protokol ve bir fare mandibular azı dişinin periodontal ligament fibrus bileşeninin 3D görüntülenmesi için iki yöntem sağlamayı amaçlamaktadır. Sunulan ilk yöntem, taze kollajen dokuların faz geliştirme görüntülemesini sağlayan bir mikro-BT kurulumuna dayanmaktadır. İkinci yöntem, kesit olmadan kemikten görüntülemeyi sağlayan ve endojen floresanları koruyan etil cinnamat kullanan bir kemik temizleme yöntemidir. Bu temizleme yöntemini Flk1-Cregibi muhabir farelerle birleştirmek; TdTomato, PDL ve alveolar kemikteki 3D vaskülatları görüntüleme fırsatı sağladı.
Ortodontik diş hareketinde (OTM) altta kalan temel biyolojik süreç kemik tadilatıdır. Bu tadilat işleminin tetikleyicisi, periodontal ligamentin (PDL) yapısındaki hücreler arası matris (ECM) stresi, nekroz, kan damarı yıkımı ve oluşumu 1 ,2,3gibideğişikliklereatfedilir. Alveolar kemik tadilatı için diğer olası tetikleyiciler, kemikteki osteositler tarafından zorla algılamanın yanı sıra alveolar kemiğin kendisinin mekanik deformasyonu ile ilgilidir; ancak OTM'deki rolleri hala tam olarak aydınlatılmamıştır4,5.
OTM sırasında PDL'nin yapı-işlev ilişkilerini ortaya çıkarmayı amaçlayan birçok çalışmaya rağmen, net bir fonksiyonel mekanizma henüz tanımlanmamıştır6,7. Bunun başlıca nedeni, iki sert doku (çimento ve alveolar kemik) arasında bulunan yumuşak bir dokunun (PDL) verilerinin alınarak ele geçirildir. Yapısal bilgi toplamak için kabul edilen yöntemler genellikle PDL yapısını bozan ve değiştiren sabitleme ve bölümleme gerektirir. Ayrıca, bu yöntemlerin çoğu, bozulmamış olsa bile, yalnızca kısmi ve yerelleştirilmiş bilgiler veren 2D veriler sağlar. PDL yapısında ve işlevinde tekdüze olmadığından, tüm diş-PDL-kemik kompleksinin sağlam 3D yapısını ele alan bir yaklaşım garanti edilir.
Bu makalede, farelerde bir OTM oluşturmak için bir yöntem ve pdl'deki kollajen liflerinin numunenin herhangi bir bölümü olmadan 3D görselleştirilmesini sağlayan iki yöntem açıklanmaktadır.
Murine modelleri tıp, gelişim biyolojisi, ilaç teslimi ve yapısal çalışmalarda in-vivo deneyler için yaygın olarak kullanılmaktadır. Belirli proteinleri ve fonksiyonları ortadan kaldırmak veya geliştirmek için genetik olarak değiştirilebilirler; hızlı, tekrarlanabilir ve öngörülebilir gelişimsel kontrol sağlarlar; ayrıca küçük boyutları nedeniyle görüntüleri kolaydır8. Birçok avantajlarına rağmen, diş araştırmalarındaki fare modelleri, özellikle klinik manipülasyonlar garanti edildiğinde, çoğunlukla küçük boyutlu dişler nedeniyle sık kullanılmaz. Sıçanlar9,10,11,köpekler12,13,domuzlar14 , 15,16ve maymunlar17 gibi hayvan modelleri farelerden daha sık kullanılır. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme tekniklerinin son zamanlarda gelişmesiyle, OTM'deki dolambaçlı süreçleri çözmek için bir fare modeli kullanmanın avantajları çoktur. Bu makale, kemik tadilatını tetikleyen sabit kuvvet seviyelerine sahip mandibuladaki azı dişinin mesial hareketini oluşturmak için bir yöntem sunun. Kemirgenlerdeki OTM deneylerinin çoğu maksillada yapılır, çünkü mandibulanın hareketliliği ve dilin varlığı başka bir karmaşıklık seviyesi ekler. Bununla birlikte, 3D yapısal bütünlük istendiğinde mandibula birçok avantaja sahiptir. Bütün bir kemik olarak kolayca parçalanabilir; bazı türlerde lifli senfonik yoluyla iki hemi-mandibulaya ayrılabilir; kompakt, düzdür ve herhangi bir sinüs alanı olmayan sadece dişleri içerir. Buna karşılık, maksilla kafatasının bir parçasıdır ve diğer organlar ve yapılarla yakından ilgilidir, bu nedenle alveolar kemiği ilişkili dişlerle parçalamak için kapsamlı bir bölümleme gerekir.
Faz geliştirme sağlayan yüksek çözünürlüklü bir mikro BT içindeki bir yükleme sistemine bağlı bir ev içi nem odası kullanarak, daha önce açıklandığı gibi3Dtaze lifli dokuları görselleştirmek için bir yöntem geliştirdik 9 , 18,19,20,21,22,23. Taze dokular, hayvan herhangi bir lekelenme veya fiksasyon olmadan kurban edildikten hemen sonra taranır, bu da doku eserlerini ve biyomekanik özelliklerin değişikliklerini azaltır. Bu 3D veriler, başka bir yerde açıklandığı gibi liflerin dağıtım ve yön analizleri için kullanılabilir19.
Burada sunulan ikinci 3D tüm doku görüntüleme yöntemi, PDL liflerinin herhangi bir kesit olmadan kemik yoluyla görüntülenmesini sağlayan mandibulanın optik olarak temizlenmesine dayanmaktadır. İlginçtir ki, kemiğin kollajen liflerinin görselleştirilmesini de sağlar, ancak bu burada tartışılmaz. Genel olarak, doku temizleme için iki yöntem vardır. Birincisi, numunenin basit bir daldırma, hiperhidrasyon veya hidrojel gömme yoluyla 1,4'ten büyük bir kırılma indeksine sahip sulu bir çözeltiye batırıldığı sulu bazlı temizlemedir. Bununla birlikte, bu yöntem şeffaflık düzeyinde olduğu kadar dokunun yapısal korunmasında da sınırlıdır ve bu nedenle dokunun sabitlenerek yapılmasını gerektirir. Son derece şeffaf numuneler veren ve fiksasyon gerektirmeyen ikinci yöntem solvent bazlı temizleme yöntemi24,25. Mandibular numuneler için etil-3-fenilprop-2-enoate (etil cinnamat, ECi) bazlı modifiye solvent bazlı bir temizleme yöntemi oluşturduk. Bu yöntem toksik olmayan gıda sınıfı temizleme maddesi, minimum doku büzülmesi ve floresan proteinlerin korunması avantajlarına sahiptir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tüm hayvan deneyleri, NIH'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımına ilişkin Yönergeleri ve Harvard Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak gerçek gerçekleştirildi (Protokol no. 01840).
1. Ortodontik Diş Hareketi
2. Taze hemi-mandibulalarda PDL liflerinin mikro-CT taraması
3. Temizleme yöntemi (Şekil 3)
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu makale, OTM üretmek için bir yöntemin yanı sıra PDL içindeki kollajen liflerinin herhangi bir bölümleme olmadan 3D görüntülenmesi için iki yöntem sürmektedir. Hayvansal araştırma amacıyla, dişlerin hizalanması gerekli olmadığında, alveolar kemiğin tüm kök seviyelerinde yeniden şekillendirilmesini sağlarsa, bir diş hareketi ortodontik olarak kabul edilir. Güvenilir bir OTM oluşturmak için dişlere uygulanan sabit kuvvet seviyesi gereklidir. Burada, etkinleştirilmiş bir şekil-bellek NiTi bobini, garanti edilirse 7 gün ve...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Farelerde OTM üretmek, boyut, genetik ve elleçleme avantajları nedeniyle çok arzu edilir. Mandibulanın kullanılması hem doku diseksiyonu hem de numune hazırlama ve görüntüleme açısından kolay bir kullanım sağlar. Burada OTM'den sonraki 7 gün içinde dişin kemik içindeki çevirisel hareketi ile OTM üretmek için bir yöntem sunduk. Bu protokol kullanılarak, diş hareketinin genel süresi uzatılabilir, çünkü aktif bobin yaklaşık 1 mm'ye kadar hareket için sabit bir kuvvet seviyesi sağlar. Bununla birlikte, bobinin mesial tarafı ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Bu çalışma NIH (NIDCR R00- DE025053, PI:Naveh) tarafından desteklenmiştir. Harvard Biyolojik Görüntüleme Merkezi'ne altyapı ve destek için teşekkür ederiz. Tüm rakamlar biorender.com ile oluşturulur.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1 mL BD Luer-Lok şırınga | BD | 309628 | |
| 1X fosfat tamponlu salin | VWR Yaşam Bilimleri | 0780-10L | |
| 200 geçirmez etanol | VWR Yaşam Bilimleri | V1016 | |
| Alüminyum alaşımı 5019 tel | Sigma-aldrich | GF15828813 | 0,08 mm çapında tel, uzunluk 100., sert temper. Azı dişi etrafında tel bağ olarak kullanılır. |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific N | /A | MikroCT taramalarını analiz etmek için kullanılır |
| Castroviejo Mikro İğne Tutucular | Güzel Bilim Araçları | 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | İkinci harmonik nesil görüntüleme için kullanılır |
| Koni soket sapı, tek uçlu, el formu | G.Hartzell ve oğlu | 126-CSH3 | Kolu muayene aynası |
| EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | Işık sayfası görüntüleme için kullanılır |
| Elipar DeepCure-S LED kürleme ışığı | 3M ESPE | 76985 | |
| Eppendorf güvenli kilitli tüpler, 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Etil sinnamat, >= %98 | Sigma-aldrich | W243000-1KG-K | |
| Hipodermik İğne, 27G x 1/2'' | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100mg/ml | Henry Schein Hayvan Sağlığı | NDC:11695-0702-1 | |
| KIMWIPES hassas görev silecekleri | Kimberly-Clark | 21905-026 (VWR Katalog numarası) | satın alındı |
| çift aydınlatmalı mikroskop sistemi | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | Işık tabakası görüntüleme için kullanılır |
| LSM 880 NLO çoklu foton mikroskop | Zeiss | LSM 880 NLO | İki fotonlu görüntüleme için kullanılır |
| MEGAmicro, düzlem, 5mm çap, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | Ön yüzey inspectrio ayna |
| MicroCT makinesi, MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Güzel Bilim Araçları | 17000-01 | |
| PermaFlo Akışkan Kompozit | Ultradent | 948 | |
| Prosedür platformu | N/A | N/A | Laboratuvar malzemelerinden özel yapım |
| Rutin stereo mikroskop M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi açık helezon yay | TOMY Inc. | İç bobin çapı 0,9 mm olan 0,15 mm çapında kapalı NiTi bobini, 10 g'lık bir kuvvet sağlar. Benzer ürünler Dentsply Sirona'dan satın alınabilir. | |
| T-304 paslanmaz çelik ligatür teli, 0.009 '' çap | Ortodonti | SBLW109 | 0.009 '' (.23mm) çap, Yumuşak temper |
| X-Ject E (Ksilazin) 100mg / ml | Henry Schein Hayvan Sağlığı | NDC: 11695-7085-1 | |
| Z100 Restoratif, A2 gölge | 3M ESPE | 5904A2 |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.