Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Aktive Edilmiş Fare Koku Alma Duyu Nöronlarının Kombine İmmün Boyama ve İn Situ Hibridizasyon ile İncelenmesi

989 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62150

⸱

11 Nisan 2021

 ,  , 
1Department of Genetics, Evolution, Microbiology and Immunology, Institute of Biology, University of Campinas, 2Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, Institute of Biology, University of Campinas

Bu makalede

Özet

Bu protokol, farede kimyasal uyaranlarla aktivasyondan sonra koku alma duyu nöronlarında eksprese edilen koku alma ve vomeronazal reseptör genlerini tanımlamak için in situ hibridizasyonu, immünofloresan ile birleştirir.

Özet

Hayvanlar, gıda kalitesinin değerlendirilmesinden mevcut çiftleşme ortaklarının veya tehditlerin tespitine kadar ilgili çevresel bilgileri iletmek ve algılamak için kimyasal iletişime güvenir. Farelerde, bu görev öncelikle koku alma sistemi ve ana ve aksesuar koku alma sistemleri de dahil olmak üzere temel alt sistemleri tarafından yürütülür. Her ikisi de, burun boşluğuna ulaşan kimyasal ipuçlarını bağlayabilen G-proteinine bağlı reseptörleri eksprese eden duyusal nöronlar tarafından doldurulan periferik organlara sahiptir. Bu reseptörlerin moleküler özellikleri iyi anlaşılmış olsa da, akraba spesifik ligandları hakkında çok az şey bilinmektedir. Burada tarif edilen yöntem, koku alma veya vomeronazal reseptörlerin in situ hibridizasyon tespitini, nöronal aktivasyonun bir belirteci olan fosforile ribozomal protein S6'nın (pS6) immüno-tespiti ile birleştirir. Bu protokol, koku alma organları tarafından tespit edilen saflaştırılmış veya karmaşık kimyasal uyaranlara maruz kalma olayından sonra aktive olan nöronları tanımlamak için tasarlanmıştır. Daha da önemlisi, bu teknik biyolojik olarak ilgili bağlamlarda tetiklenen nöronların araştırılmasına izin verir. İdeal olarak, bu yöntem koku alma sisteminin moleküler biyolojisini araştırmak ve koku alma davranışlarını incelemek için kullanılmalıdır.

Giriş

Kemosinyalizasyon, hayvanlarda en yaygın iletişim şeklidir. Memelilerde, kimyasal ipuçlarının tespitine esas olarak koku alma aracılık eder ve yiyecek bulmak, olası çiftleşme ortaklarını bulmak ve potansiyel yırtıcılardan kaçınmak için çok önemlidir 1,2,3. Fare koku alma sistemi ayrıca her biri kendi anatomik, fizyolojik ve moleküler özelliklerine sahip farklı alt sistemlere ayrılmıştır4. Bunlar arasında, ana koku alma sistemi (MOS) ve aksesuar koku alma sistemi (AOS) en yaygın olarak çalışılan ve daha iyi karakterize edilenlerdir.

MOS çoğunlukla burun boşluğuna ulaşan uçucu kimyasal moleküllerin tespitinden sorumludur. Bu, sistemin duyusal arayüzünü - ana koku alma epiteli (MOE) - dolduran koku alma duyusal nöronları (OSN'ler) tarafından gerçekleştirilir. Her OSN, binlerce koku alma reseptöründen (OR) birini monogenik ve monoalelik bir şekilde ifade eder5. Ayrıca, ameliyathaneler geniş çapta ayarlanma eğilimindedir6 ve tek bir koku verici birden fazla ameliyathaneye bağlanabilir ve kokular7 için bir kombinatoryal kod oluşturabilir.

Buna karşılık, AOS esas olarak feromon ve kairomon tespitinden sorumludur. Bu ligandlar, vomeronazal organda (VNO) vomeronazal duyusal nöroları (VSN'ler) aktive eder. VNO'nun apikal bölgesindeki VSN'ler, vomeronazal reseptör 1 ailesinden (V1Rs)8 reseptörleri eksprese ederken, bazal bölgedeki nöronlar vomeronazal reseptör 2 ailesini (V2R'ler)9 eksprese eder. Önemli olarak, bazı VSN'lerin birden fazla vomeronazal reseptörü birlikte eksprese ettiği gösterilmiştir 10,11,12.

OR'lerin ve VR'lerin moleküler özellikleri hakkında mevcut tüm bilgilere rağmen, akraba ligandları hakkındaki bilgiler hala çok sınırlıdır. Bir molekülün veya karmaşık uyaranın saptanmasından sorumlu spesifik koku alma nöronlarının tanımlanması, koku alma, koku alma güdümlü davranışlar ve fizyolojik tepkileri araştıranlar için önemli bir görevdir. Kalsiyum görüntüleme7, tek hücreli RNA dizilimi13,14, heterolog reseptör ekspresyonu15 ve anında erken genlere (IEG'ler)16 dayalı stratejiler dahil olmak üzere koku alma reseptörlerini deorphanize etmek için çeşitli stratejiler denenmiştir. Daha yakın zamanlarda, in vivo kalsiyum görüntüleme17,18 ve floresan protein etiketli tek hücreli RNA dizileme stratejileri19 kullanılarak duyusal nöronlardaki koku maddelerinin modülatör etkilerini değerlendirmek için bazı teknikler kullanılmıştır. Bu tekniklerin çoğu yapay bir kurulum gerektirir veya ayrışmış nöronlar üzerinde gerçekleştirilir, bu da kullanılan kokuların tetiklediği davranışları aynı anda değerlendirmeyi imkansız hale getirir.

Burada açıklanan protokol, belirli OR'leri veya VR'leri tespit eden riboprobları, nöronal aktivasyon için bir vekil olan fosforile S6 ribozomal proteininin (pS6) immüno-tespiti ile birleştirerek, tek bir kokuya maruz kalma olayından sonra aktive edilen duyusal nöronların tanımlanmasına izin verir. Bu yöntem, biyolojik olarak ilgili bir bağlamda farklı kemosinyaller tarafından aktive edilen duyusal nöronların kimliğini araştırmanın güvenilir bir yoludur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan prosedürleri, Campinas Üniversitesi (Biyoloji Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi - Araştırmada Hayvan Kullanımında Etik Komitesi) tarafından onaylanan ve federal Ulusal Hayvan Deneyleri Kontrol Konseyi (CONCEA) tarafından belirlenen yönergeleri izleyen Hayvan Protokolü #1883-1'e uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Malzeme hazırlama

  1. 1x PBS'de 1 L %3 H2O2 (h / h) hazırlayın. 100 mL, 10× PBS ve 100 mL %30H2O2'yi500 mL ultra saf suda seyreltin. Hacmi ultra saf su ile tamamlayın. Kullanmadan hemen önce bu çözeltiyi hazırlayın.
  2. 5 × SSC solüsyonu ile ıslatılmış, tüy bırakmayan laboratuvar mendili parçaları içeren nemlendirilmiş bir oda hazırlayın.
  3. Hibridizasyon yıkama çözeltileri hazırlayın: 5× SSC (55 °C'de), 2× SSC (55 °C), 0.2× SSC (55 °C) ve 0.1× SSC (55 °C ve oda sıcaklığı). Uygun hacimlerde 20× SSC stok çözeltisini RNaz içermeyen ultra saf suda çözün. Her deneye başlamadan önce seyreltilmiş çözeltileri taze olarak hazırlayın.
  4. İmmünohistokimya bloke edici çözelti hazırlayın: 1× PBS /% 1 BSA /% 0.1 Triton X-100. 100 mL için, 10 mL 10× PBS, 10 mL% 10 BSA ve 3.33 mL% 3 Triton X-100'ü 70 mL ultra saf suda seyreltin. Hacmi ultra saf su ile tamamlayın. Her deneye başlamadan önce seyreltilmiş çözeltileri taze olarak hazırlayın.
  5. PTw çözeltisi hazırlayın: 1× PBS /% 0.1 Tween-20. 100 mL için, 1 mL %10 Tween-20 ve 10 mL 10× PBS'yi 70 mL ultra saf suda seyreltin. Hacmi ultra saf su ile tamamlayın. Her deneye başlamadan önce bu çözeltiyi taze olarak hazırlayın.
  6. RNaz içermeyen 0.1 M trietanolamin çözeltisi hazırlayın. 250 mL için, 3.33 mL reaktif dereceli trietanolamini çalkalama altında 200 mL RNaz içermeyen ultra saf su içinde seyreltin (bu çözeltiyi hazırlarken RNaz içermeyen cam eşya ve manyetik karıştırıcı kullanın). HCl ile pH'ı 8.0'a ayarlayın. Hacmi RNaz içermeyen ultra saf su ile tamamlayın ve kullanana kadar ışıktan koruyarak saklayın. Her deneye başlamadan önce bu çözeltiyi taze olarak hazırlayın.
  7. 1× PBS'de RNaz içermeyen% 0.1 H2O2 (h / h) hazırlayın. 1 L için, 100 mL 10× PBS ve 3.3 mL %30H2O2'yi 500mL RNaz içermeyen ultra saf suda seyreltin. Hacmi RNaz içermeyen ultra saf su ile tamamlayın. Kullanmadan hemen önce bu çözeltiyi hazırlayın.
  8. Aşağıdakilerin RNaz içermeyen çözeltilerini hazırlayın: 0.2 M HCl; 1 m Tris-HCl pH 8.0; 10 mg/mL maya tRNA'sı; % 10 SDS; 10× PBS; ×100 Denhardt'ın çözümü; 20× SSC; % 50 dekstran sülfat; 6 milyon HCl
  9. RNaz içermeyen% 4 paraformaldehit fiksatif çözelti hazırlayın. 100 mL için, 4 g paraformaldehiti 80 mL 1× PBS'de çözün. 10 M NaOH ile pH'ı 7,4'e ayarlayın. Birimi 1× PBS ile tamamlayın. Bu çözelti, her deney başlamadan önce taze olarak hazırlanmalıdır.
    Dikkat: Paraformaldehit, solunması halinde potansiyel olarak zarar verebilecek tehlikeli bir maddedir. Çeker ocak altında solüsyon hazırlayın ve koruyucu eldiven, maske ve koruyucu gözlük takın.
  10. RNaz içermeyen diseksiyon solüsyonu hazırlayın:% 30 sükroz / 0.45 M EDTA pH 8.0 / 1× PBS. 100 mL için, 30 g sakarozu 60 mL RNaz içermeyen 0.5 M EDTA pH 8.0 içinde çözün. 10 mL 10× PBS ekleyin. Hacmi RNaz içermeyen 0,5 M EDTA pH 8.0 ile tamamlayın.
  11. RNaz içermeyen cam veya plastik dereceli silindirler ve beherler hazırlayın.
  12. RNaz içermeyen ön hibridizasyon ve hibridizasyon çözeltileri hazırlayın: %50 deiyonize formamid (h/h)/600 mM NaCl/200 μg/mL maya tRNA/%0,25 SDS (a/h)/10 mM Tris-HCl pH 8,0/1× Denhardt çözeltisi/1 mM EDTA pH 8,0/%10 dekstran sülfat (a/h). Dereceli bir silindirde 10 mL için 5 mL deiyonize formamid, 1.2 mL 5 M NaCl, 200 μL 10 mg / mL maya tRNA, 250 μL %10 SDS, 100μL 1 M Tris-HCl pH 8.0, 200 μL 50× Denhardt çözeltisi, 20μL 500 mM EDTA pH 8.0 ve 2 mL %50 dekstran sülfat (M.W. 500.000). Hacmi RNaz içermeyen ultra saf su ile tamamlayın. Her deneye başlamadan önce bu çözeltiyi taze olarak hazırlayın.
    NOT: Dekstran sülfat çok viskozdur. Pipetleme hatalarını hesaba katmak için hibridizasyon/ön hibridizasyon çözeltilerinin toplam hacminin fazladan %20'sinin hazırlanması tavsiye edilir. İstenirse maya tRNA'sı ön hibridizasyon çözeltisinden çıkarılabilir.
  13. Termoplastik laboratuvar filmi lamellerini hazırlayın. Bir mikroskop lamının uzunluğundan ve genişliğinden 1-2 mm daha kısa dikdörtgen termoplastik laboratuvar filmi parçaları kesin.
  14. TN tamponu hazırlayın: 100 mM Tris-HCl/150 mM NaCl. 100 mL için, 10 mL 1 M Tris-HCl pH 7.5 ve 3 mL 5 M NaCl'yi 70 mL ultra saf suda seyreltin. Hacmi ultra saf su ile tamamlayın. Her deneye başlamadan önce bu çözeltiyi taze olarak hazırlayın.
  15. TNB bloke edici tamponu hazırlayın: TN Tamponunda% 0.5 bloke edici reaktif A (w / v). 200 mL için, 1 g bloke edici reaktif A'yı 200 mL TN Tamponunda çözün (ticari bloke edici reaktif A kaynağı için Malzeme Tablosuna bakınız).
  16. TNT tamponu hazırlayın: TN Tamponunda% 0.05 Ara-20. 1 L için, 950 mL TN tamponunda 5 mL% 10 Tween-20 seyreltin. Köpürmeyi önlemek için hacmi TN tamponu ile yavaşça tamamlayın. Her deneye başlamadan önce bu çözeltiyi taze olarak hazırlayın.
  17. Tyramide-Alexa 488 çalışma çözümünü hazırlayın: 1× amplifikasyon tamponu A /% 0.0015 H2O2/1: 100 tiramid-Alexa 488. 100 μL için, 1 μL% 0.15 H2O2 ve 1 μL tiramide-Alexa 488'i 98 μL amplifikasyon tamponu A'da seyreltin (ticari tiramid-Alexa 488 kaynakları ve amplifikasyon tamponu A için Malzeme Tablosuna bakın). Kullanmadan hemen önce bu çözeltiyi hazırlayın.
  18. Tyramide-Alexa 555 çalışma çözümünü hazırlayın: 1× amplifikasyon tamponu A /% 0.0015 H2O2 / 1: 100 tiramid-Alexa 555. 100 μL için, 1 μL% 0.15 H2O2 ve 1 μL tiramid-Alexa 555'i 98 μL amplifikasyon tamponu A'da seyreltin (ticari tiramide-Alexa 555 kaynakları ve amplifikasyon tamponu A için Malzeme Tablosuna bakın). Kullanmadan hemen önce bu çözeltiyi hazırlayın.
  19. Tiramid-biotin çalışma solüsyonu hazırlayın: 1× amplifikasyon tamponu B /% 0.0015 H2O2 / 1: 50 tiramid-biotin. 100 μL için, 1 μL% 0.15H2O2 ve 2 μL tiramid-biyotini 97 μL amplifikasyon tamponu B'de seyreltin (ticari tiramit-biyotin kaynakları ve amplifikasyon tamponu B için Malzeme Tablosuna bakınız). Kullanmadan hemen önce bu çözeltiyi hazırlayın.
  20. Cam eşyaları 200 °C'de en az 4 saat pişirin. Tek kullanımlık olmayan plastik malzemelere (sürgülü raflar, Coplin kavanozları ve şırıngalar dahil) 15-30 dakika boyunca %3 H2O2 uygulayın, ardından RNaz içermeyen su altında iyice yıkayın. Diseksiyon aletleri, forseps ve kriyostat numune tutucuları gibi paslanmaz çelik metal aletlere 15 dakika boyunca% 3 H2O2 uygulayın ve ardından RNaz içermeyen su altında iyice yıkayın. Tezgah yüzeylerini, ısıtılmış plakayı ve kuru blokları RNase temizleme solüsyonu ile temizleyin.

2. Riboprob sentezi

NOT: İn vitro transkripsiyon yoluyla in situ hibridizasyon için 1 kb digoksigenin etiketli cRNA problarını sentezlemek için aşağıdaki prosedür, daha önce yayınlanmışprotokollere dayanmaktadır 20,21,22,23.

  1. İlgilenilen genden (örneğin, koku alma reseptörü geni) 1 kb'lık bir DNA fragmanını amplifiye etmek için uygun oligonükleotid primer çiftleri kullanın. Tespit edilecek olgun mRNA'da bulunan bir bölgeyi amplifiye eden primer çiftlerini seçin (örneğin, genin kodlama dizisi). Farklı koku alma reseptörleri için bir dizi primer, Malzeme Tablosunda verilmiştir. Diğer vomeronazal koku alma reseptörlerini tespit etmek için problarla ilgili ayrıntılar için lütfen önceki yayınlarıkontrol edin 16,21.
  2. PCR ürünlerini %0.8'lik bir agaroz jel üzerinde çalıştırın ve istenen 1 kb bandını çıkarın.
  3. Üreticinin protokolüne göre uygun bir mini sütun bazlı jel saflaştırma kiti kullanarak DNA parçasını saflaştırın.
  4. Saflaştırılmış DNA fragmanını ölçün ve üreticinin protokolüne göre uygun bir PCR klonlama vektörüne klonlayın. Klonlanmış amplikonu çevreleyen T7 ve SP6 RNA polimeraz promotörleri içeren klonlama vektörlerinin kullanılması tavsiye edilir.
  5. Rekombinant plazmidi, üreticinin protokolüne göre kimyasal dönüşüm veya elektroporasyon yoluyla yetkin rekombinasyon içermeyen bakterilere dönüştürün.
  6. Tohum, transformant bakteri kolonilerini zengin ortama izole edin ve plazmidi üreticinin protokolüne göre DNA mini hazırlığı yoluyla izole edin.
  7. Üreticinin protokolüne göre eklenen DNA parçasının kimliğini ve yönünü kontrol etmek için uygun kısıtlama enzimleri ve/veya Sanger dizilimi ile kısıtlama sindirim analizi yapın.
  8. Uygun bir kısıtlama enzimi kullanarak 10 μg plazmiti doğrusallaştırmak için kısıtlama sindirimi gerçekleştirin. İn vitro transkripsiyondan sonra bir anti-sens riboprob üretmek için, genin kodlama dizisinin aşağısında bulunan RNA polimeraz promotörüne karşı ekin uç noktasında plazmit DNA'yı sindiren bir kısıtlama enzimi kullanın. İn vitro transkripsiyondan sonra anlamlı riboproblar üretmek için, genin kodlama dizisinin yukarısında bulunan RNA polimeraz promotörüne karşı ekin ucundaki plazmit DNA'yı sindiren bir kısıtlama enzimi kullanın.
  9. Sindirimin eksiksizliğini doğrulamak için plazmid doğrusallaştırma reaksiyonu ürününün bir kısmını %0.8'lik bir agaroz jel üzerinde çalıştırın. Tam doğrusallaştırma onaylandıktan sonra, reaksiyonun geri kalanını üreticinin protokolüne göre sütun tabanlı bir PCR temizleme kiti kullanarak saflaştırın.
  10. Şablon olarak 1-2 μg doğrusallaştırılmış plazmit, uygun enzim (örneğin, T7 veya SP6 RNA polimeraz) ve uygun bir digoksigenin (DIG) etiketleme kiti kullanarak in vitro transkripsiyon yoluyla digoksigenin etiketli cRNA problarını sentezleyin.
  11. DNaz I ile 37 ° C'de 30 dakika sindirerek DNA şablonunu reaksiyondan çıkarın.
  12. cRNA problarını, mini kolon bazlı bir RNA saflaştırma kiti veya jel filtrasyon bazlı bir saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın. Elde edilen probu 50 μL RNaz içermeyen suda elute edin.
  13. Elde edilen riboprobu, tercihen florometrik yöntemler kullanarak nicelleştirin. Genellikle beklenen verim 100 ng/μL'nin üzerindedir.
  14. Prob kalitesini ve bozulmasını kontrol etmek için riboprobu otomatik bir elektroforez sisteminde veya RNaz içermeyen %0.8 agaroz jel üzerinde çalıştırın.
  15. Sentezlenen probu ihtiyaç duyulana kadar -80 °C'de saklayın.

3. Farelerin koku alma uyaranlarına maruz kalması

  1. Maruz kalmadan önce her hayvanı en az 24 saat boyunca temiz bir kafeste ayrı ayrı barındırın. Maruz kalmadan en az 2 saat önce yiyecek ızgarasını çıkarın. Bu çalışmada kullanılan tüm hayvanlar 8-12 haftalık erkek C57BL / 6 farelerdi (ortalama ağırlık: 20 g).
  2. Uygun koku alma uyaranını hazırlayın. MOE (ana koku alma epiteli) veya VNO'daki (vomeronazal organ) koku alma nöronlarını aktive etmek için farklı uyaranlar kullanılabilir. Koku uyaranlarının kapsamlı bir listesi için lütfen diğer yayınlarabakın 3, 16, 22,23,24. Kimyasal çözeltiler, idrar veya rekombinant protein çözeltisi gibi sıvı uyaranlar, tıbbi bir gazlı bez veya pamuk top üzerinde biriktirilebilir.
  3. Koku alma uyaranını kafese yerleştirin ve hayvanı 1 saat boyunca rahatsız etmeyin.
  4. Fare deneğine ötenazi yapın ve RNaz içermeyen diseksiyon araçlarını kullanarak MOE veya VNO'yu hızlı bir şekilde inceleyin.

4. Doku diseksiyonu ve dondurma

  1. MOE veya VNO'yu diseksiyon solüsyonu kullanarak stereomikroskop altında inceleyin.
    1. VNO için, organı çevreleyen daha yumuşak kıkırdak kabuklarını bırakarak kalın septal kemikleri çıkarın.
  2. Kriyo-kesit için numune hazırlayın.
    1. Numuneyi bir parça kurutma kağıdı üzerinde kurulayın ve gömme ortamı içeren histolojik plastik bir kalıba yerleştirin.
    2. VNO için, her bir organı dikey olarak düzenleyin ve 1 mL'lik bir şırınga yardımıyla plastik kalıbın dibine çekin (Şekil 1A).
    3. MOE için, cribriform plaka aşağı bakacak şekilde plastik kalıbın altına yerleştirin.
    4. Numunenin etrafındaki fazla kabarcıkları çıkarın, çünkü bunlar kesit almayı engelleyebilir.
    5. Örnekleri kuru buz üzerinde dondurun.
    6. Numune bloğunu -80 °C'de saklayın.
      NOT: Dondurulmuş numuneler, kesitlere ayrılmadan önce birkaç ay saklanabilir.
  3. Kriyo-kesit alma gerçekleştirin.
    1. Kriyostatı açın ve kullanmadan en az 23 saat önce sıcaklığı -4 °C'ye ayarlayın.
    2. Donmuş bloğu histolojik plastik kalıptan çıkarın ve bir tıraş bıçağıyla kesin.
    3. Numunenin etrafında 5 mm bırakın, çünkü bu kesit işlemeyi kolaylaştırır (Şekil 1B).
    4. Bloğu kriyostatın numune tutucusuna takmak için gömme ortamı kullanın.
    5. Pozitif yüklü mikroskop slaytları üzerine 16 μm'lik kesitler toplayın.
    6. Slaytları -80 °C'de saklayın.
      NOT: Slaytlar, yerinde hibridizasyondan önce birkaç ay boyunca -80 °C'de saklanabilir.

5. Adım adım yerinde hibridizasyon protokolü

  1. Slaytları bir saç kurutma makinesi kullanarak 10 dakika kurutun. Slaytların buzunu çözmek için ılık jeti kullanın, ardından gömme ortamı opak olana kadar oda sıcaklığındaki jete geçin.
  2. RNaz içermeyen% 4 paraformaldehit fiksatif çözelti slaytı başına 500 μL ekleyin ve histolojik bölümleri sabitlemek için 23-26 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
  3. Slaytları RNaz içermeyen 1× PBS'de her biri 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
  4. RNaz içermeyen 0.2 M HCl slayt başına 500 μL ekleyin ve 23-26 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
  5. Slaytları RNaz içermeyen 1× PBS'de her biri 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
  6. RNaz içermeyen% 0.1 H2O2 / 1 PBS slayt başına 500 μL ekleyin× ve 23-26 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Hidrojen peroksitin ışık kaynaklı bozulmasını önlemek için bu adımı karanlıkta gerçekleştirin.
  7. Slaytları RNaz içermeyen 1× PBS'de her biri 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
  8. Slaytları bir çeker ocakta 250 mL RNaz içermeyen trietanolamin 0.1 M pH 8.0 ve manyetik karıştırma çubuğu içeren bir kavanoza aktararak asetilasyon gerçekleştirin. Sürekli karıştırarak 625 μL asetik anhidrit ekleyin. Karıştırma hızını azaltın, slaytların üzerine damla damla 625 μL daha ekleyin, ardından karıştırmayı kapatın ve 10 dakika inkübe edin.
  9. Slaytları RNaz içermeyen 1× PBS'de her biri 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
  10. Slaytları RNaz içermeyen 1× PBS'de 60 ° C'de 5 dakika boyunca bir kez yıkayın.
  11. Slaytları 1× PBS'den birer birer çıkararak ve tüy bırakmayan laboratuvar kağıt mendil kullanarak her birini kurulayarak ön hibridizasyon gerçekleştirin. Her slayta 400 μL ön hibridizasyon solüsyonu pipetleyin ve bir su banyosunda veya ısıtılmış fırında 60 °C'de önceden ısıtılmış nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin. 60 °C'de 1 saat inkübe edin.
  12. Mikrofüj tüplerinde slayt başına 200 μL, 60 ° C'ye kadar yeterli hibridizasyon çözeltisini ısıtın ve 10 dakika boyunca 85 ° C'ye kadar ısıtın.
  13. Uygun cRNA probunu (probu) hibridizasyon çözeltisi tüplerine (her prob 1 μg/mL) ekleyin ve 85 ° C'de 5 dakika denatüre edin.
  14. Hibridizasyon için, nemlendirilmiş odadan her seferinde bir slayt alın, kurulayın ve 60 °C ısıtılmış bir plakaya yerleştirin. 200 μL riboprob içeren hibridizasyon çözeltisi ekleyin ve slaytı bir cam lamel ile örtün. Nemlendirilmiş odada 60 °C'de 12-16 saat inkübe edin.
    NOT: Ön hibridizasyondan sonra slaytların soğumasına izin vermeyin. Hibridizasyon sıcaklığı, her prob için ampirik olarak belirlenmelidir. Altmış santigrat derece, genellikle 1 kb problar için iyi çalıştığı için başlangıç noktası olarak önerilir.
  15. SSC yıkama solüsyonlarını ayrı kavanozlarda 55 °C'ye ısıtın ve uygun sıcaklıkta bir su banyosuna koyun.
  16. Hibridizasyon bittikten sonra, 55 ° C'de 5 × SSC çözeltisi içeren bir banyo kullanarak lamel her slayttan lameli çıkarın. Her slaytı sıcak SSC çözeltisinin içinde yatay olarak tutun. Lamel ayrıldığında, sürgüyü eğin ve lamellerin aşağıya düşmesine izin verin.
  17. Sürgülü bir kavanozda 55 ° C'de 2× SSC ile 30 dakika yıkayın.
  18. Sürgülü bir kavanozda 55 ° C'de 20 dakika boyunca ×0,2 SSC ile yıkayın.
  19. Sürgülü bir kavanozda 55 ° C'de 20 dakika boyunca 0,1 × SSC ile yıkayın.
  20. 23-26 ° C'de ×0.1 SSC'ye aktarın ve bir slayt kavanozunda 3 dakika inkübe edin.
  21. Sürgülü bir kavanozda 10 dakika boyunca PTw'de yıkayın.
  22. TN Buffer'da her biri 5 dakika boyunca iki kez sürgülü bir kavanozda yıkayın.
  23. Her slayta 600 μL TNB bloke edici tampon pipetleyin ve 23-26 ° C'de 3 saat inkübe edin.
  24. Her slayta 500 μL primer antikor solüsyonu (TNB solüsyonunda 1:400 oranında seyreltilmiş peroksidaz konjuge anti-DIG antikor) pipetleyin. Her slaytın üzerine dikkatlice bir parça termoplastik laboratuvar filmi yerleştirin ve 4 °C'de 12-16 saat inkübe edin.
  25. Slaytları TNT Tamponu ile 6 kez 5 dakika boyunca, bir sürgülü kavanozda hafifçe karıştırarak yıkayın.
  26. Her slayta 100 μL tiramid-biotin çalışma solüsyonu pipetleyin. Termoplastik laboratuvar filmi lamelleri ile örtün ve 23-26 °C'de 12 dakika inkübe edin.
    NOT: Kuluçka süreleri üzerinde iyi bir kontrol sağlamak için bu inkübasyon adımını, parti başına 2 veya 3 slayt ile kademeli bir şekilde gerçekleştirin. Tiramid inkübasyon süresinin, cRNA prob duyarlılığına ve konsantrasyonuna bağlı olarak optimize edilmesi gerekebilir.
  27. Slaytları TNT Tamponu ile 6 kez 5 dakika boyunca, bir sürgülü kavanozda hafifçe karıştırarak yıkayın.
  28. Her slayta peroksidaz konjuge streptavidin (SA-HRP, TNB tamponunda 1:100 oranında seyreltilmiş) içeren 200 μL çözelti pipetleyin ve termoplastik bir laboratuvar filmi lamel ile örtün. 23-26 °C'de 1 saat inkübe edin.
  29. Slaytları TNT Tamponu ile 6 kez 5 dakika boyunca, bir sürgülü kavanozda hafifçe karıştırarak yıkayın.
  30. Her slayta 100 μL tiramide-Alexa 488 çalışma solüsyonu pipetleyin, termoplastik laboratuvar filmi lamel ile örtün ve karanlıkta 23-26 °C'de 12 dakika inkübe edin.
  31. Slaytları TNT Tamponu ile 6 kez 5 dakika boyunca, bir sürgülü kavanozda hafifçe karıştırarak yıkayın.
  32. Önceki adımlardan peroksidazları inaktive etmek için% 3 H2O2/1 ×PBS'de 1 saat boyunca bir slayt kavanozda 1 saat inkübe edin.
  33. Slaytları TNT Tamponu ile 6 kez 5 dakika boyunca, bir sürgülü kavanozda hafifçe karıştırarak yıkayın.

6. pS6 immün boyama

  1. Her slayta 500 μL %4 paraformaldehit/1× PBS solüsyonu pipetleyin ve bölümleri sabitlemek için 23-26 °C'de 15 dakika inkübe edin.
  2. Her slayta 500 μL 1× PBS /% 0.1 Triton X-100 pipetleyin ve bölümleri geçirgenleştirmek için 5 dakika inkübe edin.
  3. Sürgülü bir kavanozda 1× PBS ile iki kez yıkayın.
  4. Piyasada bulunan tiramid sinyal amplifikasyon bloke edici solüsyon B'nin (Malzeme Tablosu) her bölümü için 2-3 damla pipetleyin ve 23-26 ° C'de 1 saat inkübe edin.
  5. Her slayta 400 μL immünohistokimya bloke edici solüsyon pipetleyin ve bölümleri bloke etmek için 23-26 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
  6. Her slayta 200 μL tavşan anti-pS6 primer antikor solüsyonu (immünohistokimya bloke etme solüsyonunda 1:200 oranında seyreltilmiş; son konsantrasyon: 1 μg/mL) pipetleyin, termoplastik laboratuvar filmi lamel ile örtün ve 4 °C'de 12-16 saat inkübe edin.
  7. 1× PBS/%0.1 Triton X-100 ile 5 dakika boyunca 3 kez sürgülü bir kavanozda yıkayın.
  8. Ticari olarak temin edilebilen peroksidaz konjuge tavşan önleyici ikincil antikor çözeltisinden (Malzeme Tablosu) slayt başına 2-3 damla pipetleyin ve 23-26 ° C'de 1.5 saat inkübe edin.
  9. 1× PBS/%0.1 Triton X-100 ile 5 dakika boyunca 3 kez sürgülü bir kavanozda yıkayın.
  10. Kurulayın, slaytları kurulayın ve her slayta 100 ila 200 μL tiramide-Alexa 555 çalışma solüsyonu pipetleyin, bir parça termoplastik laboratuvar filmi lamel ile kaplayın ve karanlıkta 7 dakika inkübe edin.
  11. Bir sürgülü kavanozda her biri 5 dakika boyunca 1× PBS ile iki kez yıkayın.
  12. Her slayta 500 μL seyreltilmiş nükleer leke (1× PBS'de) pipetleyin ve 23-26 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
  13. Bir sürgülü kavanozda 23-26 ° C'de 1× PBS ile her biri 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
  14. Slaytları solmaya karşı dayanıklı montaj ortamı ile monte edin ve montaj ortamının karanlıkta 24 saat kürlenmesine izin verin.
  15. Floresan solmasını önlemek için slaytları görüntülemeye kadar uygun sıcaklıkta saklayın.

7. Mikroskopi görüntüleme

  1. Kullanılan floroforlar için uygun filtrelerle donatılmış bir epifloresan veya konfokal mikroskop kullanarak görüntü slaytları.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Mevcut protokol, deneycinin ilgilendiği genin ve nöronal aktivite belirteci pS6'nın floresan olarak etiketlendiği mikroskopi görüntüleri elde etmeyi amaçlamaktadır. Açıklanan yöntem, çok az arka plan ile veya hiç arka plan olmadan net ve güçlü etiketleme üreten Tyramid Signal Amplification'ı içerir. pS6 immün boyama, genellikle tüm nöronal hücre gövdesini dolduran sitoplazmik floresan sinyali olarak görünürken, koku alma reseptörü nöronları için in situ hibridizasyon sinyali sitoplazmik boyama olarak görülür. pS...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan protokol, nöronal aktivitenin dolaylı bir belirteci olan pS6'nın immünotespiti ile OR veya VR reseptörlerinin yerinde tespitinin bir kombinasyonu yoluyla koku alma sistemindeki kimyasal ipuçlarıyla aktive edilen duyusal nöronları güvenilir bir şekilde tanımlar. Deneyci, histoloji bütünlüğünü korumak için ekstra dikkat göstermeli ve RNaz içermeyen koşullar altında hibridizasyondan önce tüm adımları gerçekleştirmelidir. Bunun yapılmaması, mRNA'nın bozulmasına nede...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, herhangi bir şekilde rekabet eden çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Kaynaklar için GAG Pereira ve JA Yunes'e, idari ve teknik yardım için APF Ferreira ve WO Bragança'ya ve konfokal mikroskopi konusunda yardım için Yaşam Bilimleri Çekirdek Tesisi (LaCTAD-UNICAMP) personeline teşekkür ederiz. Bu çalışma, Sao Paulo Araştırma Vakfı (FAPESP; hibe numaraları 2009/00473-0 ve 2015/50371-0'dan F.P.'ye), PRP/UNICAMP (hibe numaraları 2969/16, 725/15, 348/14 ve 315/12 F.P.), V.M.A.C. (2014/25594-3, 2012/21786-0, 2012/01689-0), T.S.N. (2012/04026-1) ve Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) bursu ile T.S.N. tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS)Thermo Fisher ScientificAM9625n/a
20x amplifikasyon seyrelticisi (<  Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kiti)Thermo Fisher ScientificB40923 veya  B40922, tiramid-Alexa 488 veya tiramid-Alexa 555 sinyal amplifikasyonu için çalışma çözümlerinde Amplifikasyon Tamponu A olarak anılır
20x SSCMerck (Calbiochem)8310-OPn/a
%30 Sığır Serum Albümini (BSA)Merck (Sigma-Aldrich)A9576n/a
%30 hidrojen peroksid (H2O<>sub2)Merck (Sigma-Aldrich)H1009n/a
Asetik anhidritMerck (Sigma-Aldrich)320102n/a
AgarozMerck (Sigma-Aldrich)A9539n/a
Amplifikasyon seyrelticisi (TSA Biotin kitinden )Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAtiramid-biyotin sinyal amplifikasyonu için çalışma çözeltisinde Amplifikasyon Tamponu B olarak anılır
Anti-pS6 (Ser 244/247) tavşan poliklonal antikoruThermo Fisher Scientific Cat# 44-923G, RRID: AB_2533798n / a
Engelleme tamponu 1x (Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kitinden )Thermo Fisher ScientificB40923 veya  B40922, tiramid sinyal geliştirme adımında bloke edici çözelti B olarak anılır
Bloke edici reaktif (TSA Biotin kitinden )Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAiçin formülasyonda bloke edici reaktif A olarak anılır
Thermo Fisher ScientificD1306n/a
Denhardt çözeltisi (50x)Merck (Sigma-Aldrich)D9905n/a
Deoinize formamidMerck (Sigma-Aldrich)F9037n/a
Dekstran sülfat çözeltisi (%50)Merck (Chemicon)S4030n/a
Etilen-diamin-tetraasetik asit (EDTA)Merck (Sigma-Aldrich)E9884n/a
Hoechst 33342 nükleer lekeThermo Fisher ScientificH1399n/a
Hidroklorik asit (HCl)Merck ( Sigma-Aldrich)320331yok
Koku alma uyaranların/aPapes ve ark. (2010), Carvalho ve ark. (2015), Nakahara ve ark. (2016), Carvalho ve ark. (2020)n/a
ParaformaldehitMerck (Sigma-Aldrich)P6148n/a
Peroksidaz konjuge anti-digoksigenin antikoru (Fab fragmanları)Merck (Roche)11207733910;   RRID: AB_514500peroksidaz konjuge anti-DIG antikoru olarak adlandırılır
Peroksidaz konjuge anti-tavşan ikincil antikoru (poliHRP konjuge keçi anti-tavşan reaktifi  Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kiti)Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Peroksidaz konjuge streptavidin (TSA biotin kitinden itibaren)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
ProLong Gold antifade mountantThermo Fisher ScientificP36934solma önleyici montaj ortamı olarak anılır
RNaz içermeyen ultra saf suThermo Fisher Scientific10977015yok
Sodyum klorür (NaCl)Merck (Sigma-Aldrich)S9888n/a
Sodyum dodesil sülfat (SDS)Merck (Sigma-Aldrich)436143n/a
Sodyum hidroksit (NaOH)Merck (Sigma-Aldrich)S8045n/a
SükrozMerck (Sigma-Aldrich)S0389n/a
TrietanolaminMerck (Sigma-Aldrich)T58300n/a
Triton X-100Merck (Sigma-Aldrich)X100n/a
Trizma hidroklorür (Tris-Cl)Merck (Sigma-Aldrich)T5941n/a Tween-20
Merck (Sigma-Aldrich)822184yok
Tyramide-Alexa 488 eşleniği (Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kitinden)Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Tyramide-Alexa 555 konjugatı (Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kitinden)Thermo Fisher ScientificB40923n/a
Tyramide-Biotin konjugatı (TSA Biotin kitinden itibaren)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
Maya tRNAMerck (Roche)10109495001n/a
Kritik Ticari Tahliller ve Hayvanlar
Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kitiThermo Fisher ScientificB40922n/a
Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kitiThermo Fisher ScientificB40923n/a
DIG RNA Etiketleme Kiti (SP6/T7)Merck (Roche)11175025910n/a
Yüksek Hassasiyetli RNA ScreenTape Analizi reaktifleri (tampon, merdiven ve bant)Agilent5067-5580, 5067-5581 ve 5067-5579otomatik elektroforez sistemi olarak anılır
Fare: C57BL/6J kendi içinde yetiştirilmiş suşJacksonLaboratories Stok No:  000664;   RRID:IMSR_JAX:000664)n/a
ProbeQuant G-50 Mikro SütunlarCytiva Biosciences28903408jel filtrasyon bazlı saflaştırma kiti olarak anılır
QIAquick jel ekstraksiyon kitiQiagen28506mini kolon bazlı jel saflaştırma kiti olarak anılır
RNeasy MinElute temizleme kitiQiagen74204, mini sütun bazlı RNA saflaştırma kiti
TSA olarak anılır Biyotin kitiAkoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAyok
< güçlü > Oligonükleotidler< / güçlü >
5 ' & ndash; AAACTTCATCCTTACAGAATGG
CAG – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/aOlfr692
5' – ACTGGCTTTGGGACAGTGTGAC – 3'Entegre DNA Teknolojilerin/a
5'- GGTAATATCCATTATCCTAGTT
TCCC – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/aOlfr124
5' – TTGACCCAAAACTCCTTTGTTAG
TG – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/a
5' – ATGGGAGCTCTAAATCAAACAA
GAG – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/aOlfr1509
5' – TAGAAAACCGATACCACCTTGTC
G – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/a
5' – TACATCCTGACTCAGCTGGGGA
ACG – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/aOlfr1512
5' – GGGCACATAGTACACAGTAACA
ATAGTC – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/a
5' – GAGGAAGCTCACTTTTGGTTTG
G – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/aOlfr78
5' – CAGCTTCAATGTCCTTGTCACA
G – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/a
5' – TGGGTTGGAGGCTTATCATACC
TG – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/aOlfr691
5' – AAGAACAACACAGAGTCTTGAT
GTC – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/a
5' – AGAAGTAACTAACACCACTCAT
GGC – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/aOlfr638
5' – TTAGTGCACCTTTTTTGCAAC – 3'Entegre DNA Teknolojilerin/a
5' – TAACAGCTCTTCCCATCCCCTG
TTC – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/aOlfr569
5' – TAGGGTTGAGCATGGGAGGAAC
AAGC – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/a
5' – CACTGGATCAACTCTAGCAGCA
CTG – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/aVmn2r1
5' – CTGCCCTTCTTGACATCTGCTG
AG – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/a
5' – ATCGGATCCACTGCTTTAGCATT
TCTTACAGGACAG – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/aVmn2r2
5' – ATCCTCGAGTCATGCCTCTCCAT
AAGCAAGGAATTCCAC – 3'Entegre		DNA Teknolojilerin/a
5' – TAGGAAGCTATTTGCCTTGTTTC
CAC – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/aVmn2r13
5' – AGGAGATTTTACCAACCAGATTC
CAG – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/a
5' – CTCTAAGAACAGCAGTAAAATGG
ATCT – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/aVmn2r89
5' – ATGGGAATGACCAACTTAGGC
A – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/a
5' – ATCCCATGGCTGAGAACATGTGC
TTCTGGAG – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/aVmn2r118
5' – ATCCTCGAGTCAGTCTGCATAAG
CCAGATATGTCAC – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/a
5' – ATCGGATCCGCTGATTTTTCT
CCCAGATGCTTTTGG – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/aVmn2r116
5' – ATCCTCGAGTCATGGTTCTTCAT
AGCTGAGAAATACAAC – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/a
5' – TGGGTGTCTTCTTTCCTCAA
GA – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/aVmn2r28
5' – GGTGACCCATATTCTGTATAA
CTGT – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/a
5' – GATGTTCATTCATGAGAGTCT
TCC – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/aVmn2r41
5' – CATTTGTGGATGACATCACAATT
TGG – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/a
5' – TTTATGGCAAATTTCACTGATCCC
G – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/aVmn2r46
5' – AGTGGGTCTTTCTTAGAAAGGAG
TG – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/a
5' – ACATGAACCAGAATTTGAAGCAG
GC – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/aVmn2r69
5' – GCCAAGAAAGCTACAGTGAAAC
C – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/a
5' – AGGTGAAGAAATGGTATTCTTCC
AG – 3'		Entegre DNA TeknolojileriN/AVmn2r58
ACTGTGGCCTTGAATGCAATAACT – 3'Entegre DNA Teknolojilerin/a
5' – TTCCTAAAGAACACCACTGA
AGCATCG – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/aVmn2r90
5' – CATATTCCACAGAAGAGAAGT
TGGAC – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/a
5' – TTGAGGTGAGAGTCAACAGT
TTAGAC – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/aVmn2r107
5' – CCCTTGTTGCAAAATGAT
GATGTGA – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/a
5' – ATCCCATGGAGTCAGAGTAT
CTACTACACCATGATGG – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/aVmn2r83
5' – ATCCTCGAGTCAATCATTAT
AGTCCAGAAAGGTGACAG – 3'		Entegre DNA Teknolojilerin/a
Rekombinant DNA
pGEM-T-Easy vektörPromegaA1360önerilen PCR klonlama
vektörüDiğer malzemeler
1 mL şırıngalarFisher Scientific14-829-10Fyok
Konik tüpler (15 mL ve 50 mL)Fisher Scientific14-432-22, 14-959-49Bn/a
Coplin kavanozlarıFisher Scientific12-567-099, 07-200-81n/a
KriyostatLeica BiosystemsCMS 1850n/a
Diseksiyon aletleri ve forsepsRobozRS-6802, RS-8124, RS-7110, RS-5111n/a
Kuru banyon/an/an/a
Elektroforez ekipmanFisher Scientific09-528-110Bn/a
İnce nokta boya fırçalarıWinsor & Newton10269097yok
Floresan veya konfokal mikroskopLeica MicrosystemsTCS SP5IIyok
Isıtmalı plakaFisher ScientificHP88850200yok
Nemlendirilmiş oda (daha yüksek sıcaklıklarda kullanılıyorsa, plastik bir Tupperware kabının içine kapatılması gerekecektir)Thermo Fisher Scientific22-045-034n/a
Tüy bırakmayan laboratuvar KimwipesKimberly-Clark34120tüy bırakmayan laboratuvar kağıt mendil kağıdı olarak anılır
MikrosantrifüjEppendorf5401000013yok
Fare kafesleriInnoViveM-BTM, MVX1n/a
PCR ThermocyclerThermo Fisher Scientific4375786yok
Pipet p1000, p200 ve p20 tek kullanımlık uçlarFisher Scientific02-707-408, 02-707-411, 02-707-438n/a
Plastik histoloji gömme kalıbıThermo Fisher Scientific22-19n/a
Qubit 4 FlorometreThermo Fisher ScientificQ33238son derece hassas florometrik yöntem olarak anılır
Jiletler veya neşterlerFisher Scientific12-640n/a
RNA tapestation veya BioAnalyzerAgilent4200 TapeStation System veya 2100 Biyoanalizör Aletn/a
RNaz içermeyen cam veya plastik dereceli silindirler ve beherlerFisher Scientific10-462-833, 02-555-25B, 02-555-25Dn/a
StereomikroskopLeica MicrosystemsM80n/a
SuperFrost Plus mikroskop slaytlarıThermo Fisher Scientific12-550-15pozitif yüklü mikroskop slaytları olarak adlandırılır
ParafilmBemis CompanyPM999, termoplastik laboratuvar filmi olarak anılır
Su banyosuThermo Fisher ScientificTSCIR19yok
TNB tamponu DAPI nükleer lekesi , , , , ,

Kaynaklar

  1. Stowers, L., Holy, T. E., Meister, M., Dulac, C., Koentges, G. Loss of sex discrimination and male-male aggression in mice deficient for TRP2. Science. 295 (5559), 1493-1500 (2002).
  2. Chamero, P., et al. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450 (7171), 899-902 (2007).
  3. Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection of protein pheromone homologs. Cell. 141 (4), 692-703 (2010).
  4. Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annual review of physiology. 71, 115-140 (2009).
  5. Chess, A., et al. Allelic inactivation regulates olfactory receptor gene expression. Cell. 78, 823-834 (1994).
  6. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nature Reviews Neuroscience. 5, 263-278 (2004).
  7. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
  8. Dulac, C., Axel, R. A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals. Cell. 83 (2), 195-206 (1995).
  9. Herrada, G., Dulac, C. A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographically organized and sexually dimorphic distribution. Cell. 90 (4), 763-773 (1997).
  10. Martini, S., Silvotti, L., Shirazi, A., Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. Co-Expression of Putative Pheromone Receptors in the Sensory Neurons of the Vomeronasal Organ. J. Neurosci. 21 (3), 843-848 (2001).
  11. Silvotti, L., Moiani, A., Gatti, R., Tirindelli, R. Combinatorial co-expression of pheromone receptors, V2Rs. Journal of Neurochemistry. 103 (5), 1753-1763 (2007).
  12. Ishii, T., Mombaerts, P. Expression of nonclassical class I major histocompatibility genes defines a tripartite organization of the mouse vomeronasal system. Journal of Neuroscience. 28 (10), 2332-2341 (2008).
  13. Saraiva, L. R., et al. Hierarchical deconstruction of mouse olfactory sensory neurons: From whole mucosa to single-cell RNA-seq. Scientific Reports. 5, (2015).
  14. Hanchate, N. K., et al. Single-cell transcriptomics reveals receptor transformations during olfactory neurogenesis. Science. 350, 1251-1255 (2015).
  15. Matsunami, H. Functional expression of mammalian odorant receptors. Chemical Senses. 30, Suppl 1 95-96 (2005).
  16. Isogai, Y., et al. Molecular organization of vomeronasal chemoreception. Nature. 478 (7368), 241-245 (2011).
  17. Xu, L., Li, W., Voleti, V., Zou, D. J., Hillman, E. M. C., Firestein, S. Widespread receptor-driven modulation in peripheral olfactory coding. Science. 368 (6487), (2020).
  18. Pfister, P., et al. Article Odorant Receptor Inhibition Is Fundamental to Odor Encoding Odorant Receptor Inhibition Is Fundamental to Odor Encoding. Current Biology. , 1-14 (2020).
  19. de March, C. A., Titlow, W. B., Sengoku, T., Breheny, P., Matsunami, H., McClintock, T. S. Modulation of the combinatorial code of odorant receptor response patterns in odorant mixtures. Molecular and Cellular Neuroscience. 104, 103469(2020).
  20. Nakahara, T. S., Carvalho, V. M. A., Souza, M. A. A., Trintinalia, G. Z., Papes, F. Detection of Activated Mouse Neurons with Temporal Resolution via Dual c-Fos Staining. STAR Protocols. 1 (3), 100153(2020).
  21. Nakahara, T. S., et al. Detection of pup odors by non-canonical adult vomeronasal neurons expressing an odorant receptor gene is influenced by sex and parenting status. BMC biology. 14 (1), 12(2016).
  22. Carvalho, V. M. A., et al. Lack of spatial segregation in the representation of pheromones and kairomones in the mouse medial amygdala. Frontiers in Neuroscience. 9, 1-19 (2015).
  23. Carvalho, V. M. A., et al. Representation of Olfactory Information in Organized Active Neural Ensembles in the Hypothalamus. Cell Reports. 32 (8), 108061(2020).
  24. Papes, F., Nakahara, T. S., Camargo, A. P. Behavioral assays in the study of olfaction: a practical guide. Methods in Molecular Biology, v1820: Olfactory receptors. , 289-388 (2018).
  25. Jiang, Y., Gong, N. N., Hu, X. S., Ni, M. J., Pasi, R., Matsunami, H. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors responding to odors in vivo. Nature Neuroscience. 18, 1446-1454 (2015).
  26. Von Der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Neuroscience. 18 (10), (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Nöronal AktivasyonFare Olfaktör SistemiFosforile S6Kimyasal Uyaranların TespitiG-Proteini Kenetli ReseptörlerOlfaktör DavranışlarVomeronazal Reseptörler

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.