Bağırsak Mezarlarından Murine Primer Kolon Epitel Monolayerlerinin Üretimi

Özet

Bu protokolde, murine primer epitel kolon monolayerlerinin doğrudan bağırsak mahzenlerinden nasıl üretılacağını açıklıyoruz. Geçirgen filtreler üzerinde birleştirici monolayerler, çizik yarası iyileşmesi ve biyokimyasal çalışmalar için birikme monolayerleri ve immünofluoresans analizi için seyrek ve birleştirici monolayerler üretmek için deneysel yaklaşımlar sunuyoruz.

Özet

Bağırsak epitel, bağırsak lümen ve vücudun içi arasında bir bariyer görevi gören tek bir hücre tabakasından oluşur. Bu bariyerin devamlılığındaki bozulma, enflamatuar bağırsak hastalığı gibi enflamatuar bozukluklara neden olabilir. Bağırsak epitel biyolojisi çalışmasındaki sınırlamalardan biri, araştırmacıları karsinomlardan elde edilen model hücre çizgilerini kullanmaya zorunlu kılan birincil hücre kültürü modellerinin eksikliği olmuştur. Üç boyutlu (3D) enteroidlerin ortaya çıkması, epitel biyologlarına birincil hücre kültürleri oluşturmak için güçlü bir araç vermiştir, bununla birlikte, bu yapılar hücre dışı matrise gömülüdür ve farklılaşmış bağırsak epitel hücrelerinin olgunluk özelliğinden yoksundur. Bağırsak epitel monolayerleri oluşturmak için çeşitli teknikler yayınlanmıştır, ancak çoğu süreci zahmetli ve pahalı hale getiren yerleşik 3D enteroidlerden türetilmiştir. Burada, doğrudan murine bağırsak mahzenlerinden birincil epitel kolon monolayerleri oluşturmak için bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca geçirgen filtreler üzerinde birleşimli kültürlerin üretilmesi, çizik yarası iyileştirme çalışmaları için birikme monolayer ve immünofluoresans analizi için seyrek ve konfluent monolayerler gibi bu modelle kullanılabilecek deneysel yaklaşımları detaylandırıyoruz.

Giriş

Bağırsak epitel hücreleri (IEC), mikroorganizmaların ve toksinlerin vücuda girmesini önlerken besin ve su emilimini sağlayan seçici geçirgen bir bariyer oluşturan bağırsakları hizalar ¹. Bağırsak mukozası villi adı verilen ışıklı projeksiyonlardan (sadece ince bağırsakta bulunur) ve mahzen adı verilen invajinasyonlardan oluşur. Villi ve kolon kriptlerinin yüzeyi farklılaştırılmış epitel hücreleri ile kaplanırken, mahzenlerin tabanı 3 ila 7 gün arasında bir ciroya sahip olan bağırsak epitelinin hızlı yenilenmesini sağlayan kök hücrelerden oluşur. Bağırsak kök hücreleri (ISC) sadece bağırsak homeostazını korumak için değil, hasarlı epitellerin yeterli onarımı için de önemlidir².

Bağırsak epitel biyolojisinin incelenmesi, dönüştürülmüş hücre çizgilerinin mevcut tek araç olduğu birincil hücre kültürlerinin eksikliği ile sınırlıydı. Bağırsak epitel modeli hücre çizgileri normal bağırsak epitelinin fizyolojisini doğru bir şekilde çoğaltabilir. ISC'den türetilen 3D kültürlerin gelişimi, bağırsak mukozal biyologlarına in vivo bağırsak mukozal koşullarına benzeyen in vitro modeller sağladı³. Mahzenler, bir bodrum membran matrisi ortamına (örneğin Matrigel) gömülü ve Wnt3a, R-spondin ve Noggin içeren koşullandırılmış ortamda yetiştirilen murine örneklerinden kolayca izole edilebilir ve enteroidler (ince bağırsak) veya kolonoidler (kalın bağırsak) olarak bilinen 3D yapılar üretebilir⁴. Enteroidler ve kolonoidler, apikal etki alanının bir iç lümenle karşı karşıya olduğu ve bazolateral bölgenin hücre dışı matrisle doğrudan temas halinde olduğu polarize sferoidal yapılardır. Enteroidler ve kolonoidler, Enterositler / Kolonositler, Paneth, Enteroendokrin ve Goblet hücreleri gibi tüm büyük farklı bağırsak epitel alt tiplerini içerir ve bağırsakların^5'tenizole edildikleri bölümünde göründükleri ile nispeten aynı oranlarda görünürler. 3D enteroidler ve kolonoidler bağırsak gelişimi ve fizyolojisi çalışmasında önemli bir ilerlemeyi temsil etse de, bu modeller epitel hücrelerinin (lümen) apikal yüzeyine sınırlı erişim ve ilgi moleküllerinin yüksek verimli taramasını elde etmek için kültürleri yukarı veya aşağı ölçeklendirme yeteneği gibi bazı dezavantajlar sunar. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, 3D enteroidlerden/kolonoidlerden elde edilen birincil IEC 2D kültürlerini elde etmek için protokoller oluşturuldu. 2D enteroidler / kolonoidler, tıpkı model hücre çizgilerinin yaptığı gibi hücre tabakası olarak büyür ve bağırsak yarası onarımı, konak-patojen etkileşimleri ve diğerleri arasında rejeneratif tıbbı incelemek için idealdir. Yayınlanan birkaç makale, 3D yapılardan veya doğrudan bağırsak mahzenlerinden 2D monolayerlerin nasıl üretileceğini açıklar (bkz.^{6,7,8,9,10,11}) ancak bu yöntemler emek yoğun ve üremesi zor olma eğilimindedir. Monolayerleri doğrudan yeni izole edilmiş fare bağırsak mahzenlerinden elde etmek için hızlı, basit ve tekrarlanabilir bir yöntem bu protokolde özetlenmiştir.

Burada, minimum nesil döküntü, hücre dışı matris seçimi ve bu teknik için farklı yüzeyler ve uygulamalar ile mahzen çıkarma işlemini ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu deneysel yaklaşım kolon mahzenleri için optimize edilmiştir, ancak ince bağırsak için uygulandığında benzer sonuçlar elde edilir.

Protokol

Aşağıda açıklanan tüm prosedürler Michigan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak onaylanmış ve yürütülmüştir.

1. Crypt izolasyonu ve kültürü için reaktiflerin hazırlanması (doku kültürü davlumbazında hazırlanın)

1. 50 mM etilenediamin tetraasetik asit (EDTA): 500 mL hazırlamak için kalsiyum (Ca 2+ ) ve magnezyum (Mg²⁺) olmadan 450 mL fosfat tamponlu saline 50 mL 0.5 M stok ekleyin. Bu protokolde PBS, aksi belirtilmedikçe kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS'ye atıfta bulunacaktır.
2. Sallama tamponu: 500 mL hazırlamak için PBS'de 7,4 g sakkaroz (43,3 mM) ve 5 g sorbitol (54,9 mM) çözün.
3. L-WRN (L-Wnt-3A, R-spondin ve Noggin) medya: Supplement Advanced Dulbecco's Modifiye Eagle Medium/Ham's F-12 (DMEM/F12) (780 mL) ile %20 Fetal Sığır Serumu (FBS) (200 mL), 1x piyasada bulunan glutamin takviyesi (10 mL), 100 U/mL penisilin ve, 100 g/mL streptomisiyan (10 mL) ve filtre 0,22 μm filtre ile sterilize edilir.
   1. L-WRN hücrelerini ATCC'den geçirin, T175 şişelerinde büyüyün ve Geneticin ve Hygromycin'i kullanmayı seçin. Medya değiştirilir ve 12 gün boyunca toplanır.
      NOT: Her ortam grubu, TOPflash Wnt Reporter tahlili kullanılarak Wnt etkinliği için sınanmıştır. Bu durumda Michigan Tıp Çevirisel Doku Modelleme Laboratuvarı protokolleri (https://www.umichttml.org/protocols) takip edilmiştir. TOPflash HEK 293 hücre hattı, bir T75 şişesinde izdiah olarak yetiştirilir, denenmez ve 96 kuyulu bir plakaya kaplanır. Ertesi gün toplanan ortamın farklı seyreltmeleri hücrelere eklenir ve bir gecede 37 ° C'de% 5 CO₂ inkübatörde inkübe edilir. Ertesi gün, hücreler lislenir ve Firefly Luciferase tahlili üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirilir. Test, rekombinant Wnt-3A kullanılarak normalleştirilir. Ortam, 50 mL konik tüplerde 25 mL aliquots'a ayrılır ve -80 °C'de saklanır.
4. Baz medya: 500 mL için, 2x ticari olarak mevcut glutamin takviyesi (10 mL), 20 mM HEPES (10 mL), 100 U/mL penisilin ve, 100 g/mL streptomisiyan (10 mL), 2 mM N-asetil-L-sistein (2 mL), N2 takviyesi (10 mL) ve B27 takviyesi (20 mL), 0,22 μm filtre ile sterilize edin. Medyayı 50 mL konik tüpte 25 mL aliquots'a bölün ve -80 °C'de saklayın.
5. LWRN komple ortam: 25 mL LWRN medyayı 25 mL baz ortamla birleştirin ve 200 ng/mL Epidermal büyüme faktörü (EGF) (20μL) ve 2x antibiyotik-antimykotik çözelti (1 mL) ile destekleyin. Tüm ortamı 4 °C'de saklayın.
6. Kollajen ve Laminin: 1 mg/mL stok konsantrasyonu üretmek için 5 mg tozu 5 mL filtre sterilize edilmiş 100 mM asetik asitte çözün (9,94 mL moleküler dereceli suya 60 μL asetik asit stoğu ekleyin). 4 saat boyunca 4 °C'de döndürün ve 0,2 mL tüplerde 100 μL aliquot yapın. -20 °C'de dondurun. Laminin 100 μg/ mL stok konsantrasyonu ile satın alınır.
7. Büyüme faktörleri olmadan komple ortam (CMGF-): 1x ticari olarak mevcut glutamin takviyesi (5 mL), 10 mM HEPES (5 mL), 100 U/mL penisilin ve 100 g/mL streptomisin (5 mL) ile Gelişmiş DMEM/F12 (500 mL) takviyesi.
8. Farklılaşma ortamı: 9,2 mL CMGF-ortam, 200 μL B27 takviyesi, 100 μL N2 takviyesi, 20 μL N-asetil-L-sistein, 500 μL Noggin media¹² (Noggin üreten hücrelerden yapılmış) ve 2 μL EGF ekleyerek 10 mL farklılaşma ortamı yapın.

2. Plakaların, hazneli slaytların ve hücre kültürü membran uçlarının hazırlanması

1. Kaplama için 48 kuyu plakası ve hazneli kaydıraklar 2D monolayer: Soğuk Dulbecco'nun Fosfat tamponlu salininde laminin (1:40 seyreltme, bkz. Malzeme Tablosu)ve kollajen (1:30 seyreltme) oluşturan kaplama çözeltisini Ca²⁺ ve Mg²⁺ (DPBS) ile kullanın. Her kuyuya 200 μL kaplama çözeltisi ekleyin ve plakayı / hazne slaydını en az₂ saat boyunca 37 °C'de% 5 CO 2 inkübatörde önceden kuluçkaya yatırın.
2. Kaplama 0.4 μm hücre kültürü membran ekler: Moleküler sınıf suda kollajenin 1:30 seyreltilmesini yapın ve her kesici uç içine 200 μL ekleyin. Membran kesici ucu içeren plakayı 30 dakika boyunca 4 °C'de buz üzerinde tutun. 30 dk inkübasyonu takiben, plakayı 1,5-2 saat boyunca₃₇ °C'de% 5 CO 2 inkübatörde tutun. Polyester ve polikarbonat membran kesici uçlar benzer sonuçlar verir.
   NOT: Kaplama yüzeyinin tam kapsamını elde etmek için kollajen/laminin hacmini ayarlayarak bu protokol kullanılarak herhangi bir doku kültürü plakası tohumlanabilir (yukarı ve aşağı ölçekleme yapılabilir).

3. Crypt izolasyonu

NOT: Diseksiyona başlamadan önce kollajen ve/veya laminin kaplı plaka/membran uçları/hazneli slayt hazırlayın ve 37 °C'de_%5 CO 2 inkübatörde bırakın. Ameliyat için uygun temiz bir çalışma tezgahı ve steril cerrahi aletler ve 2D monolayerleri kültleme için biyolojik bir güvenlik kabini hazırlayın. Nemlendirilmiş CO 2 inkübatörü, masa üstü santrifüjler (4 °C'de tutulur), mikroskop ve pipetler (serolojik pipetler dahil) gibi_2D monolayer kültürleme için diğer tüm standart ekipmanları onaylayın.

1. 8-12 haftalık C57Bl / 6 fareler kullanın. Onaylanan bir ötenazi yöntemi kullanarak fareleri ötenazi.
2. Diseksiyon alanını temizlemek ve kağıt mendil kullanarak fazla EtOH'yi çıkarmak için fare karkaslarını% 70 etanol (EtOH) çözeltisi ile püskürtün.
   NOT: Crypt isolation reaktiflerinin (PBS, 50 mM EDTA, shake buffer gibi) mahzenlerinin soğuk tutulmasını sağlayın. Bu reaktifler bir gün önce hazırlanabilir ve 4 °C'de depolandığında en az 3 ay boyunca kullanıma hazırdır. Ayrıca, LWRN komple ortamın kullanıma kadar 37 °C'de tutulan bir boncuk/su banyosunda tutulduğundan emin olun.
3. Temiz diseksiyon makası ve tokmaklar kullanarak, kolonu rektumdan cecum'a kadar parçalara ayırın. Kolonun ucunu tokalar kullanarak tutun ve 20 G besleme tüpü ile donatılmış 10 mL şırıng içinde buz gibi PBS kullanarak dışkıyı hafifçeyıkayın (Şekil 1A). Kolonu yırtmamaya dikkat edin.
   1. Proksimal iki nokta üst üsteyi çıkarın. Bu, kolonun ileocecal birleşime en yakın kısmı olacaktır.
4. Tokalarla, distal kolonu 20 G besleme tüpüne hafifçe kaydırın, tüpün ucundaki kolonu 4-0 ipek dikiş ipliği ile uçtan tutun (Şekil 1B).
5. Birinin parmaklarını ucundan bağlayarak iki nokta üst üste ters çevirin ve diğer ucunu 4-0 ipek dikiş ipliği ile bağlayın. Cerrahi makas kullanarak, besleme tüpünün ucunun altındaki kolonu kesin (Şekil 1C,D,E).
6. 1,25 mL'lik bir tekrar şırınnasının pistonunu kullanarak, ters kolonun çözünmemiş ucunu 1,25 mL'lik bir tekrar şırınnanın ucuna hafifçe açın. Ters kolonu şırındının ucuna kaydırın ve 4-0 ipek dikiş ipliği ile sıkıca bağlayın(Şekil 1F,G).
7. Pistonu şırındağa yerleştirin ve bir sosis oluşturmak için kolonu şişirin. Kolon sosisi görünür kırışıklıklar olmadan turgent görünene kadar şişirin (Şekil 1H).
8. Şırınd/kolonu 20 dakika boyunca buz üzerine 5 mL Hücre Kurtarma Çözeltisi ile 15 mL tüpe yerleştirin, kolonu her 5 dakikada bir şişirin vesöndürün (Şekil 1I). Sosis kuluçka sırasında şişirilmiş kalmalıdır.
9. Kolon şişirilmiş olarak tekrar şırındağının ucunun altında 4-0 ipek dikiş ipliği kullanarak bağlayın. Sosisi tekrar şırınnadan kesin ve 40 dakika boyunca 10 mL 50 mM (ince bağırsak için 2mM) EDTA içeren 15 mL tüpe yerleştirin ve 4 °C'dedöndürün (Şekil 1J,K).
10. EDTA çözeltisini dekantlayın ve 5 mL sallama tamponu ile değiştirin. Sosisi 2 dakika boyunca dikey pozisyonda (kuvvetlice) manuel olarak çalkalayın.
11. Sallama çözeltisini yeni bir 15 mL tüpe deklare edin ve sallama tamponunda toplam 10 mL crypt için sallama adımını tekrarlayın.
12. Bir Petri kabına 20 μL crypt süspansiyonu alın ve mikroskop altında mahzen sayısını sayın. Mahzenlerdeki/μL'deki mahzen konsantrasyonunun hesaplayın. Konsantrasyona bağlı olarak, kaplama anında 5 mahzen / μL elde etmek için numuneleri seyreltin (1000 mahzen /cm^2).
13. Tüpü, 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da masa üstü santrifüj kullanarak izole edilmiş mahzenlerle döndürün.
14. Bu arada, 48 kuyu plakası/ kesici uç / oda kaydırağından çıkarın ve biyogüvenlik kabinine yerleştirin. P200 kullanarak kaplama soluyun ve hücreler kaplanmaya hazır olana kadar plakayı kapakla hafifçe dengede bırakın.

4. Kült 2D monolayer

NOT: 3D kolonoidlerden bağırsak epitel monolayerlerinin nasıl üretilme konusunda ayrıntılı bir protokol için Estes ve Kovbasnjuk laboratuvarlarının protokollerini kontrol edin (^7,11).

1. 10 mL serolojik pipet kullanarak sallama tamponu çıkarın. Peletin sağlam olduğundan ve kalan sıvıları çıkarmak için P1000'i kullanabileceğinden emin olun. Peletin 3 mL LWRN komple ortam ve pipet yukarı ve aşağı P1000 ile yeniden askıya alın. Önceden kaplanmış 48 kuyulu plaka/hazne kaydırağın her kuyusuna 200 μL crypt ekleyin ve 37 °C'de %5 CO₂ inkübatörde kuluçkaya yatırın.
2. Ertesi gün P200 kullanarak medyayı aspire edin ve yeni ortam ekleyin. Hücreler 24-48 saat içinde birleşir.
3. Hücre kültürü membran uçları için, kesici uçların üstüne 200 μL mahzen (5 crypts/μL) ve alt kısma 600 μL komple L-WRN ortamı ekleyin. Ertesi gün P200 kullanarak medyayı aspire edin ve yalnızca üst bölmeye taze ortam ekleyin. Plakayı 37 °C'de_%5 CO 2 inkübatörde kuluçkaya yatırın. Transepithelial Elektrik Direnci (TEER) her gün Epitel Volt/Ohm metre (EVOM) kullanılarak ölçülür.
   NOT: Kültürün 300 Ω.cm^2'denbüyük bir TEER okuması varsa, bunların bir araya geldiği amaçlanır. 3-4 gün içinde izdiah elde edilir. Medyayı her 2 günde bir değiştirin.

Sonuçlar

Birincil epitel kolon monolayer kültürlerinin güvenilirliğini göstermek için, protokolden türetilen mahzen yalıtımının ve temsili görüntülerin bir özeti gösterilmiştir. Kullanıcı, yalıtılmış mahzenlerin steril koşullarda kültüre olduğunu akılda bulundurmalıdır, bu nedenle iki nokta üst üste doğru bir diseksiyon ve temizlik bir önceliktir. Şekil 1, mahzen yalıtımı sırasında önemli adımlara sahiptir. İzole edilmiş mahzenler (Şekil 2A) artık sayılır ve konsantre edilir (Şekil 2B) 5 mahzen / μL konsantrasyon elde etmek için. Mahzenlerin konsantre bir şekilde hazırlanmasından sonra, hücreler istenen formatta (kültür çanağı, membran uçları veya oda slaytları) kaplanacak ve deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak uygun ortamla inkübe edilecektir. Şekil 3, 48 kuyu plakalarında 24 ve 48 saat kültürden sonra kültürün ilerleyişini göstermektedir. İstenilen izdiah edilene kadar hücreler inkübe edilir. Bu yöntemin olası uygulamalarını örneklendirmek için, 48 kuyulu plaka kuyularının izdiah etmesine izin verdik ve çizik yarası tahlilini yapmaya devam ettik. Şekil 4, 2D kolonoid monolayerde ve aynı yara 24 saat sonra (Şekil 4B) yeni oluşturulmuş bir çizik ( Şekil4A) tasvir eder. Kültürün hala sağlıklı ve uygulanabilir olduğu ve yara onarımı olduğu açıktır. Farklılaştırılmış monolayerler oluşturmak için ortam LWRN'den farklılaştırma ortamına değiştirilir. Diferansitasyon, yüksek TEER değerleri (Şekil 5A),ISC belirteçlerinin azalması ((Lösin bakımından zengin tekrar içeren G-protein bağlantılı reseptör 5 (Lgr5) ve Achaete-scute gibi 2 (Ascl2)) ve farklılaşma işaretleyicilerinin artması () gösterilerek elde edilir. (Alanyl aminopeptidaz (Anpep), Mucin 2 (Muc2), lysozyme 1 (Lyz1), Sükroz iso-maltase (Sis) ve Chrmogranin A (Chga)) (Şekil 5B,C) PCR tarafından. CDX2 ve KRT20 olarak diğer işaretleyiciler de bu panele dahil edilebilir. mRNA ekspresyon seviyelerine ek olarak, farklılaşma koşullarında yetişen 2D kolonoidlerde alt tip farklılaştırılmış epitel hücrelerinin görünümü de immünofluoresans (Muc2 ve Chga; Şekil 5D).

Şekil 1: Sağlıklı monolayer üretimi için örnek hazırlık. Numune hazırlama, sağlıklı monolayerlerin üretimi için çok önemlidir. İzolasyon sürecinin önemli adımları, okuyucunun daha kolay olmasını sağlamak için bu şekilde tasvir edilir. Kolon fareden dışarı atılır, kürk artıkları olmadığından emin olun. Kolonu delinmediğinden emin olarak dışkıyı dikkatlice çıkarın; kolonun hava tutabilmesi ve şişirilmesi ve söndürülebilmesi gerektiğinden bu hayati öneme sahiptir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Crypt izolasyon sayısı ve konsantrasyonu. (A) Kolon sosislerini salladıktan sonra kolonik mahzenler. Görüntüde 20 μL'lik bir düşüş alanı resmedilmiştir. (B) 5 mahzen / μL elde etmek için mahzen konsantrasyonu. Ölçek çubuğu: 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Birincil IEC Monolayer büyümesi. (A) 24 saat kaplama ve hücre kalıntılarının giderilmesinden sonra 2D IEC monolayers. (B) Confluent 2D IEC monolayers kaplamadan sonra 48 saat. Ölçek çubuğu: 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Murine birincil IEC kullanılarak yara testlerini çizin. Epitel kolon monolayerinde bir çizik yapıldıktan sonra yara iyileşme gösteren görüntüler. Ölçek çubuğu: 5 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Epitel kolon monolayerlerinin farklılaşması. (A) Farklılaşma ortamı TEER tarafından gösterildiği gibi sıkı epitel bariyerler oluşturur. Farklılaşma ortamı,(B)kök hücre belirteçlerinin mRNA ifadesinde bir düşüşe ve (C) farklılaşma işaretçilerinin yukarıgülasyonuna neden olur. (D) Muc2 ve Chromogranin-A gibi özel farklılaştırılmış epitel hücrelerinin belirteçleri de doğrudan 2D kolonoidlerin immünofluoresansı yoluyla tespit edilebilir. Ölçek çubuğu: 5 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Protokolümüz, doğrudan birincil 2D IEC monolayerleri oluşturmak için hızlı, tekrarlanabilir ve güvenilir bir yöntem sağlar. Kolon epitel monolayerleri oluşturmak için daha önce yayınlanan protokollere kıyasla protokolümüzdeki temel farklılıklardan biri, mahzenleri özgürleştirmek için kolonu küçük parçalar halinde kesmememizdir. Bunun yerine, bağırsak epitelini mezenkim^13'ten ayırmak için bir protokol uyarladık kimyasal ve mekanik kuvvetlerin bir kombinasyonu ile son derece temiz bir preparatta mahzenleri serbest bırakmak için, (Şekil 2), araştırmacıya birincil kültürleri oluşturmak için ideal malzemeyi sağladık. İzolasyon yöntemimiz 3D enteroidler ve kolonoidler üretmek için de kullanılabilir. Kaplanan mahzen sayısını normalleştirmek için her deneme gerçekleştirildiğinde bir mahzen sayımı yapmak önemlidir. Kolon sosisi turgoru, izolasyon hızı, kullanıcı uzmanlığı gibi değişkenler izole edilen mahzen sayısını etkileyebilir. Protokolde belirtilen önerilen kaplama şifreli konsantrasyonu bir başlangıç noktasıdır, ancak kullanıcı odaklı değişkenleri hesaba katacak her kullanıcı bunu en iyi duruma getirmelidir. Bu tekniği 8 ila 20 hafta arasında değişen erkek ve dişi WT farelerle kullandık ve hücre sağkalımında büyük farklılıklar görmedik, teoride genç farelerden izole edilen mahzenlerin hayatta kalma şansı daha yüksektir. Mahzenler, sadece küçük bir yüzdesi yüzeye yapıp hayatta kaldığı için fazla miktarda kaplanır. Kaplamadan bir gün sonra% 50 izdiah edecek kadar mahzenin olduğu, ancak ölen mahzenlerin sitotoksik etkiye sahip olacağı çok fazla mahzenin olmadığı bir denge hedeftir. LWRN medya, ölü mahzenleri ve kalıntıları ortadan kaldırmak için kaplamadan 24 saat sonra dikkatlice çıkarılmalıdır, bu, zaten monolayer olarak büyüyen hücrelerin ayrışmasını önlemek için dikkatlice yapılmalıdır.

LWRN medyasının ilk çıkarılmasından sonra, kullanıcı deneysel koşulların kök hücrelere daha yakın kalan birincil IEC monolayerleri gerektirip gerektirmeyeceğine ve taze LWRN ortamı ekleyip eklemediğine veya monolayer'ın farklılaştırılması isteniyorsa, farklılaşma ortamıyla değiştirin. Bu protokoldeki en önemli faktör, izolasyon işlemi sırasında kolonun bütünlüğünü sağlamaktır. Bir yırtılma meydana gelirse, sosis hasarlı bölgeyi ortadan kaldırmak için kısaltılabilir. Sosisi EDTA'ya koymadan önce düğümlerin mümkün olduğunca sıkı olduğundan emin olun. Sosis EDTA inkübasyonundan sonra söndürülirse, protokol genel mahzen veriminde çok az veya hiç etkisi olmadan devam edilebilir. Tekrar şırınga mevcut değilse, normal bir şırıngaya bağlı normal bir mikropipette ucu da şişirme ve deflasyon işlemi için kullanılabilir. Ayrıca, hücre kurtarma çözümü yoksa, EDTA'da (2mM ince bağırsak, 50 mM kolon) enflasyon ve deflasyon adımları yapılabilir, ancak bu ikame önerilmez. Konfluens gerekli değilse, mahzenler sadece kolajenle kaplanmış plakalarda ve hatta kaplamasız plakalarda büyüyebilir. Sadece kaplamasız plaka kılıfları kullanın Başka bir seçenek yoktur, ancak hücreler kollajen kaplı plakalarda olduğu gibi sağlıklı büyümeyecektir. Kültür sağlığı ve stabilitesi söz konusu olduğunda, plastik kaplama monolayerler 4 ila 5 gün sağlıklıdır, transküllerde kaplanmış monolayerler ise 8 güne kadar taşınabilir.

Bu yöntemin ana sınırlamalarından biri epitel kolon monolayerlerini büyütmek için gereken hücre ortamıdır. LWRN hücreleri ATCC'de mevcuttur, ancak LWRN şartlandırılmış medya üretimi emek yoğundur ve Wnt aktivitesini belirlemek için floresan spektrometreye erişim gerektirir. Farklılaştırma ortamı, kullanımdan önce taze eklenen bir dizi reaktif gerektirir, bu da onu sıkıcı bir işlem haline getirir. Son olarak, bu reaktiflerin çoğu maliyetlidir ve reaktifleri hızlı bir şekilde yakmak kolaydır. Bir laboratuvar bu tekniği önceki bağırsak birincil hücre kültürü olmadan kurmak istiyorsa, deneyime sahip bir işbirlikçi / kolej bulmanız ve üyelerinden birini eğitmeniz şiddetle tavsiye edilir.

3D kültürünün bakımı, bodrum membran matrisi ortamının maliyeti ve organoid kültürleri için gereken yüksek hacimli şartlandırılmış ortam nedeniyle pahalı olabilir, ancak daha az sayıda fare kullanma avantajına sahiptir ve oluşturulan yapılar birçok kez geçilebilir. Enteroidler (ince bağırsaktan türetilmiştir) kolonoidler daha hassasken, daha yavaş bir hızda büyürken ve daha sınırlı bir geçiş kapasitesine sahipken izole etmek ve sürdürmek nispeten kolaydır. 3D kolonoidlerden monolayer üretimi, bu tür deneyleri zaman alıcı ve maliyetli hale getiren orantısız miktarda 3D yapı gerektirir. Aksine, doğrudan epitel kolon monolayer hazırlığı hızlıdır ve sonuçları elde etmenin hızlı bir yoludur. Bir kolon hazırlığı, kaplamadan 2 ila 3 gün sonra 75 cm² (10 ila 15 mL şartlandırılmış ortam, bir kez değiştirir) bir izdiah alanı oluşturabilir (bu alan, neredeyse 6mL Matrigel ve 250 mL'den fazla koşullandırılmış ortam anlamına gelen 144 3D kolonoid kuyusu gerektirir). Daha düşük ortam tüketimi, hücre kültürünün düşük maliyetli bakımı ve fonksiyonel testler yapma yeteneği ve hızlı aşağı akış işleme epitel kolon monolayerlerinin büyük avantajlarıdır.

Bu protokol, hücre yapışması, polarite ve farklılaşma gibi alanlarda bağırsak epitel hücre biyolojisinin incelenmesinde değerli bir araçtır. Genetiği değiştirilmiş farelerden (nakavt, aşırı ifade, muhabirler) birincil hücre kültürleri üretme avantajı sağlar. Birincil bağırsak epitel monolayerleri, apikal ve bazolateral yüzeylere kolay erişim sağlar (transwells üzerine kaplandığında) farklı hücre tiplerinin geçirgenlik, bariyer ve transepithelial göçünün incelenmesine izin verir. Son olarak, bu model konak-patojen etkileşimleri, epitel hasarı ve onarım ve ilaç keşfi gibi farklı alanlarda yararlı olabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Gelişmiş DMEM/F12	Gibco	12634-010
Antibiyotik Antimikotik çözelti	Corning	30-004CI
B27 takviyesi (50X)	Gibco	12587-010
Hücre Geri Kazanım Çözeltisi	Corning	354253
İnsan plasentasından elde edilen kollajen (tip IV)	Sigma-Aldrich	C5533
D-Sorbitol	Sigma	85529-250G
D-Sükroz	Fisher Bilimsel	BP220-1
Dulbecco' s fosfat tamponlu salin, Ca < sup>2 + < / sup> ve Mg < sup> 2 + < / sup> (DPBS)	ile Corning	21-030-CV
Epitel Volt / Ohm metre	Dünya Hassas Aletler	0-10K ve Omega; STX2 (EVOM2)
ile Etilendiamin tetraasetik asit (EDTA)	Lonza	51201
Fetal Sığır Serumu (FBS)	Corning	35-016-CV
Ateşböceği Lusiferaz testi	Biotium	30085-2
Geneticin	Gibco	10131-035
GlutaMAX (100X)	Gibco	35050-061
HEPES (1M)	Corning	25060CI
İnsan rekombinant EGF	R & D sistemleri	236-EG	Stok Konsantrasyonu: 500 & mikro; g/mL
İnsan rekombinant Wnt-3A R	& D sistemleri	W3a-H-005
Higromisin B	İnvitrojen	10687010
LWRN hücreleri	ATCC	CRL-3276
Moleküler dereceli su	Corning	46-000-CV
N2 takviyesi (100X)	Gibco	17502-048
N-asetil-L-sistein	Sigma-Aldrich	A9165-5G	Stok Konsantrasyonu: 500mM
Noggin	Şartlandırılmış	ortam-Nunc
Lab-Tek Hazneli kayar sistem	Sigma-Aldrich	C7182-1PAK
Pencillin-Streptomisin (10.000U/mL)	Corning	30002CI
Fosfat tamponlu salin, Ca2+ ve Mg2+ free (PBS)	Corning	21-040-CV
Plastik 20G besleme tüpü	Fisher Scientific	50-810-46
rh-laminin-521	Gibco	A29248	Stok konsantrasyonu: 100 & mikro; g / mL
Roboz Cerrahi 4-0 İpek Siyah Örgülü 100YD	Fisher Scientific	NC9452680
TOPflash HEK293 hücreleri	ATCC	CRL-3249
Transwell Geçirgen destekler (0.4 ve mikro; m)	Corning	3470