Membranlar Arasında Fosfataylserine/Fosfatidiylinositol 4-Fosfat Değişiminin Floresan Bazlı Ölçümleri

Summary

Burada, bir proteinin fosfatidiylserine veya fosfatidiliinositol 4-fosfat in vitro'yuayıklayıp taşımadığını belirlemek için floresan lipid sensörleri ve lipozomlar kullanarak protokolleri açıklıyoruz.

Abstract

Evrimsel olarak korunmuş oksisterol bağlayıcı protein (OSBP) ile ilişkili proteinler (ORP)/OSBP homologları (Oş) ailesinin birkaç üyesinin son zamanlarda maya ve insan hücrelerinde yeni bir lipit transfer proteini (LTP) grubunu temsil ettiği bulunmuştur. Fosfatidiylinositol 4-fosfat (PI(4)P) değişim döngüleri ile endoplazmik reticulumdan (ER) plazma membranlarına (PM) fosfatidiylserine (PS) aktarırlar. Bu bulgu, sinyalizasyon işlemleri için kritik olan PS'nin hücre boyunca nasıl dağıtıldığının ve bu işlem ile fosfoinositid (PIP) metabolizması arasındaki bağlantının araştırılmasının daha iyi anlaşılmasını sağlar. Yeni floresan bazlı protokollerin geliştirilmesi, bu yeni hücresel mekanizma in vitro'nun moleküler düzeyde keşfedilmesinde ve karakterizasyonunda etkili olmuştur. Bu makale, bir proteinin PS veya PI(4)P çıkarma yeteneğini ölçmek ve bu lipitleri yapay zarlar arasında aktarmak için floresan etiketli iki lipit sensörünün, NBD-C2_Lact ve NBD-PH_FAPP'ınüretimini ve kullanımını açıklamaktadır. İlk olarak, protokol bu iki yapının yüksek saflıkta örneklerinin nasıl üretılacağını, etiketlenerek ve elde edilir. İkinci olarak, bu makale, bir proteinin Osh6p'yi vaka çalışması olarak kullanarak lipozomlardan PS veya PI(4)P çıkarıp çıkarabileceğini belirlemek için bu sensörlerin floresan mikro plaka okuyucu ile nasıl kullanılacağını açıklar. Son olarak, bu protokol, tanımlanmış lipid bileşiminin lipozomları arasındaki PS/PI(4)P değişiminin kinetiğinin nasıl doğru bir şekilde ölçüleceğini ve standart bir florometre kullanılarak floresan rezonans enerji transferi (FRET) ile lipid transfer oranlarının nasıl belirleneceğini göstermektedir.

Introduction

Lipitlerin farklı membranlar arasında ve ökaryotik hücrelerin zarları içinde kesin dağılımı^1,2 derin biyolojik etkilere sahiptir. LTP'lerin nasıl çalıştığının şifresini çözmek hücre biyolojisinde önemli bir konudur^3,4,5,6ve in vitro yaklaşımlar bu sorunu ele almada büyük değere sahiptir 7 ,^8,9^,10,11. Burada, birka....

Protocol

1. NBD-C2_{Laktının Saflaştırılması}

NOT: Bu protokol bakterileri kırmak için bir hücre bozucunun kullanımını detaylandırsa da, diğer liziz stratejilerini(örneğin, bir Fransız basını) kullanmak için değiştirilebilir. Saflaştırmanın başlangıcında, sistein oksidasyonunu önlemek için taze gazdan arındırılmış, filtrelenmiş ve 2 mM dithiothreitol (DTT) ile desteklenmiş tampon kullanılması zorunludur. Bununla birlikte, protein etiketleme adımı için DTT'yi tamamen çıkarmak çok önemlidir. Herhangi bir protein bozulmasını önlemek için buzda veya soğuk bir odada birçok adım atılmalıdır. Saflaştırmanın ilerlemesini kontrol etmek için% 1....

Results

Şekil 1: Floresan lipit sensörlerinin ve in vitro tahlillerin açıklaması. (A) Sığır laktadherin C2 etki alanının kristal yapısına (PDB ID: 3BN6⁴⁸⁾ve insan_FAPP1 proteininin PH alanının NMR yapısına dayanan NBD-C2_Lact ve NBD-PH FAPP'ın üç boyutlu modelleri (PDB ID: 2KCJ^46).......

Discussion

Bu tahlillerin sonuçları doğrudan floresan lipid sensörlerinin sinyallerine dayanır. Bu nedenle, NBD ile 1:1 oranında etiketlenen ve serbest NBD florofor kontaminasyonu olmadan etiketlenen bu probların saflaştırılması bu protokolde kritik bir adımdır. Muayene edilen LTP'nin düzgün bir şekilde katlanıp katlanmadığını ve toplanmadığını kontrol etmek de zorunludur. Bu LTP'nin bu lipitleri verimli bir şekilde çıkarıp çıkarmadığını düzgün bir şekilde ölçmek için ekstraksiyon testlerinde test edilen LTP miktarı erişilebilir PS.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-sistein ve ge; 97 % (FG)	Sigma	W326305-100G	Suda 10 mM L-sistein stok çözeltisi hazırlayın. Alikotlar -20 °C'de saklanır; C
2 mL Amber Şişe, PTFE / Rub Lnr, CHCL < sub > 3 < / sub >	Wheaton	W224681
4 mm çapında cam boncuklarda	Sigma	Z265934-1EA
50 mL konik santrifüj tüpü	Falcon
& Auml; KTA temizleyici	GE healthcare		FPLC
Alüminyum folyo
3 ve 10 kDa Merck UFC900324 MWCO'lu Amicon Ultra-15, 3 ve 10 kDa
Amicon Ultra-4	Merck	UFC800324, UFC801024
Ampisilin			bir stok çözeltisi hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın. derece;C.
Bestatin	Sigma	B8385-10mg
BL21 Altın Yetkin Hücreler	Agilent
C16:0 Liss  (Rhod-PE) CHCl3< / sub> (1 mg / mL)	içinde Avanti Polar Lipidler	810158C-5MG
C16: 0 / C16: 0-PI (4) P ve nbsp;	Echelon Lipids	P-4016-3	1 mg C16: 0 / C16: 0-PI (4) P tozunu 250 & mikroda çözün; L MeOH ve 250 &mikro; CHCl3'nin L'si. Daha sonra CHCl3 ile 1 mL ile tamamlayın. Çözüm netleşmeli.
CHCl3 (10 mg / mL) içinde C16: 0 / C18: 1-PS (POPS)	Avanti Polar Lipidler	840034C-25mg
C18: 1 / C18: CHCl3< / sub> (25 mg / mL) içinde (DOPC)	Avanti Polar Lipidler	850375C-500mg
CaCl2< / sub>	Sigma		Suda 10 mM CaCl2 stok çözeltisi hazırlayın.
Hücre Bozucu	Sabit Dinamik
Kloroform (CHCl3) RPE-ISO	Carlo Erba	438601
Komple EDTA içermeyen proteaz inhibitör kokteyli	Roche	5056489001
Deiyonize (Milli-Q) su
Dimetilformamid (DMF), susuz, %>99 saf
DNAse I Rekombinant, RNAse içermez, toz halinde	Roche	10104159001
DTT	Euromedex	EU0006-B	Milli-Q suda 1 M DTT stok çözeltisi hazırlayın. 1 mL alikot hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın.
Econo-Pac kromatografi sütunları (1,5 > 12 cm).	Biorad	7321010
Elektroporasyon küveti 2 mm	Ozyme	EP102
Elektroporatör Eppendorf 2510	Eppendorf
Sabit Açılı Rotor Ti45 ve Ti45 tüpleri	Beckman	Pil lizatlarının
Cam şırıngalar (10, 25 ve 50 &mikro; L) floresan deneyi için	Hamilton
Cam şırıngaları (25, 100, 250, 500 ve 1000 &mikro; L) lipid stok çözeltilerini işlemek için	Hamilton	1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN tip3, 1001RN
Glutatyon Sefaroz 4B boncukları	GE Healthcare	17-0756-05
Gliserol (%99 saf)	Sigma	G5516-500ML
Kapaklı
HEPES ,% >99 saf	Sigma	H3375-500G
Illustra NAP 10 tuz giderme sütunu	GE healthcare	GE17-0854-02
İzopropil β-D-1-tiyokalaktopiranosit (IPTG)	Euromedex	EU0008-B	Milli-Qwater'da 1 M IPTG stok çözeltisi hazırlayın. 1 mL alikot hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın.
K-Asetat	Prolabo	26664.293
Lennox LB Glikozsuz			Mili-Q su ile hazırlanır ve otoklavlanır.
Sıvı nitrojen	Linde Metanol
(MeOH) > % 99.8VWR		20847.24
MgCl 2 < / sub>	Sigma		2 M MgCl < sub > 2 çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi 0.45 & mikro kullanarak filtreleyin; m filtresi.
Mikroplaka 96 Kuyulu PS F-Botom Siyah Bağlayıcı Olmayan	Greiner Bio-one	655900
Mini-Ekstruder, iki adet 1 mL gaz geçirmez Hamilton şırınga ile	Avanti Polar Lipids	610023
Monokromatör bazlı floresan plaka okuyucu	TECAN	M1000 Pro
N,N'-Dimetil-N-(İyodoasetil)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oksa-1,3-Diazol-4-il)Etilendiamin) (IANBD Amid)	Moleküler Problar		25 mg IANBD'yi 2.5 mL dimetilsülfoksit (DMSO) içinde çözün ve 100 & mikrodan 25 alikot hazırlayın; 1,5 mL vidalı kapaklı tüplerde L. Kapağı tamamen vidalamayın. Ardından, tüp başına 1 mg kuru IANBD elde etmek için DMSO'yu dondurarak kurutucuda çıkarın. Tüpler kapatılır ve -20 ° C'de saklanır; Karanlıkta C.
NaCl	Sigma	S3014-1KG
PBS			137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2< / sub>PO4< / sub>, 1.8 mM KH2< / sub>PO4< / sub>, otoklavlanmış ve 4 ° C'de saklanmıştır.
Armut biçimli cam şişeler (25 mL, 14/23, Duran camı)	Duran Group
Pepstatin	Sigma	p5318-25mg
pGEX-C2LACT  plazmit			Laboratuvarımızdan istek üzerine temin edilebilir
pGEX-PHFAPP plazmit			Talep üzerine laboratuvarımızdan temin edilebilir
Fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ≥ % 98,5 (GC)	Sigma	P7626-25g	İzopropanol
Fosforamidon	Sigma	R7385-10mg
Polikarbonat filtrelerde (19 mm çapında) 200 mM PMSF stok çözeltisi hazırlayın, gözenek boyutu 0.2 & mikro; m	Avanti Polar Lipids	610006
Poly-Prep kromatografi kolonu (0-2 mL yatak hacmi ve 10 mL rezervuarlı)	Biorad	7311550
Ön Filtreleri (10 mm çapında).	Avanti Polar Lipids	610014
PyMOL	http://pymol.org/		Proteinlerin 3D modellerinin yapımı (Şekil 1A)
UV/görünür floresan için kuvars küvet (minimum hacim 600 & mikro; L)	Hellma
Kuvars küvetleri	Hellma
Soğutmalı santrifüj ve nbsp; Eppendorf 5427R	Eppendorf
Döner buharlaştırıcı	Buchi	B-100
Vidalı mikrosantrifüj tüpleri (1,5 mL)	Sarsted
Küçük manyetik PFTE karıştırma çubuğu (5 & kez; 2 mm)Geçmeli
kapaklı mikrosantrifüj tüpleri (0,5, 1 ve 2 mL)	Eppendorf
SYPRO turuncu			SDS-PAGE jel Thermomixer
	Starlab
TROMBİN, İNSAN PLAZMASINDAN	leke Sigma	10602400001	20 birimi 1 mL mili-Q suda çözün ve 25 & mikro hazırlayın; 0.5 mL Eppendorf tüplerinde L alikotları. Sonra dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
Tris, ultra saf	MP	819623
Ultrasantrifüj L90K	Beckman
UV/Görünür absorbans spektrofotometresi	SAFAS
UV/sıcaklık kontrollü hücre tutuculu ve karıştırma cihazlı görünür spektroflorometre	Jasco veya Shimadzu	Jasco FP-8300 veya Shimadzu RF-5301PC
Vakum odası
Sephacryl S200HR	GE healthcare
su banyosu	Julabo