Yöntem makalesi

Yüz Gelişimini Değerlendirmek için Kuş Ön Beyin Kimeraları Oluşturmak

DOI:

10.3791/62183

⸱

18 Şubat 2021

 , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Orthopaedic Trauma Institute, University of California

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, kraniyofasiyal gelişim sırasında bazal ön beynin sinyal ve paternleme özelliklerini test etmek için tasarlanmış bir doku nakli tekniği anlatılmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kuş embriyosu, bir yüzyıldan fazla bir süredir model bir sistem olarak kullanılmış ve omurgalı gelişiminin temel olarak anlaşılmasına yol açmıştır. Bu model sisteminin güçlü yönlerinden biri, kimerik embriyolarda dokuların etkisinin ve dokular arasındaki etkileşimin doğrudan değerlendirilebilmesidir. Daha önce ön beyinden gelen sinyallerin, Frontonazal Ektodermal Bölgede (FEZ) Sonik kirpi (SHH) ekspresyon alanının şeklini düzenleyerek yüz morfogenezine katkıda bulunduğunu göstermiştik. Bu makalede, ön beyin kimeralarını üretme yöntemi ve bu deneylerin sonuçlarının illüstrasyonları açıklanmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gelişim biyolojisindeki birçok çağdaş araştırma, embriyoların şekillendirilmesinde genlerin rolüne odaklanmaktadır. Gelişimsel mekanizmaları genetik bir perspektiften incelemek için iyi araçlar vardır. Bununla birlikte, embriyolar bir araya getirilir ve doku etkileşimlerine yanıt olarak morfogeneze tabi tutulur. Kuş sistemi, aşağıdaki nedenlerden dolayı gelişimi düzenleyen doku etkileşimlerinin çeşitliliğini değerlendirmek için kullanılan klasik bir araçtır: embriyoloji iyi anlaşılmıştır, embriyolara kolayca erişilebilir, kuş sistemlerinin analizi için araçlar iyi gelişmiştir ve embriyolar ucuzdur.

Kuş nakli sistemi, soy takibi ve gelişim sırasındaki doku etkileşimlerini değerlendirmek için neredeyse bir yüzyıl boyunca yaygın olarak kullanılmaktadır 1,2,3,4. Bu sistem, üst çene5'in morfogenezini düzenleyen bir sinyal merkezi olan Frontonazal Ektodermal Zon'u (FEZ) araştırmak için kullanıldı ve daha önce bu tekniği tanımlayan bir video yayınlandı6. Bıldırcın-civcivlere ek olarak, doku etkileşimlerinin analizi için kimera üretmek için başka türler de kullanılmıştır. Örneğin, fare FEZ'si vahşi tip7 ve mutant fareler8'den nakledildi ve diğerleri, yüz iskeleti 9,10,11,12'nin modellenmesinde nöral tepenin rolünü değerlendirmek için bir ördek, bıldırcın ve civciv sistemleri kullandılar.

Bu çalışmada, bıldırcın, ördek ve civciv embriyoları arasında ventral ön beyni karşılıklı olarak naklederek FEZ'deki gen ekspresyonunun paternini düzenlemede ön beynin rolü değerlendirilmiştir, çünkü FEZ'de Sonic kirpi ekspresyonunu indüklemek için ön beyinden bir sinyal gereklidir. Ön beyin nakilleri bu alanda benzersiz değildir. Bu nakiller, bıldırcın ve ördek embriyolarında motilitenin gelişimini değerlendirmek için kullanıldı13, ancak bu deneylerde nöral olmayan türevlere katkıda bulunan dokular da nakledildi. Diğer çalışmalarda, kuşlardaki işitsel devreler ön beyin nakli14 ile değerlendirilmiştir, ancak bu nakiller, yüz şekli 9,10'a katkıda bulunan ve FEZ15'te SHH ekspresyonunun düzenlenmesine katılan varsayımsal nöral krest hücreleri içeriyordu. Bu nedenle, beynin yüz şeklindeki rolünü değerlendirmek için nöral tüpün kapanmasından önce sadece ventral ön beyni bir kuş türünden diğerine nakletmek için bir sistem geliştirilmiştir16 (Şekil 1A, B). Bu yöntemde greftin nöral krest kontaminasyonu yoktu. Bu makalede yöntem gösterilerek beklenen sonuçlar açıklanmış ve karşılaşılan zorluklar tartışılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyaz Pekin ördeği (Anas platyrhynchos), beyaz Leghorn tavuğu (Gallus gallus) ve Japon bıldırcını (Cortunix coturnix japonica), HH7/8 17'de aşama eşleşene kadar nemlendirilmiş bir odada37 ° C'de inkübe edilir.

1. Donör dokunun hazırlanması

NOT: Reaktiflerin ve aletlerin hazırlanması ve deneysel manipülasyon için yumurtaların nasıl açılacağı açıklanmıştır6.

  1. DMEM ortamını nötr kırmızı, cam transfer pipeti ve keskinleştirilmiş tungsten iğneleri ile hazırlayın.
  2. Embriyoları açığa çıkarın (6'da gösterildiği gibi).
  3. Evre 7/8 embriyoların bazal ön beyninin sol tarafından doku greftleri toplayın. Ön beynin ~ 0.3 mm uzunluğunda ve 0.2 mm genişliğinde bir parçasını hafifçe kesmek için kavisli keskinleştirilmiş tungsten iğneleri6 kullanın, iğneyi ön beynin altına kaydırarak altta yatan endodermi içermediğinizden emin olun, böylece iğne nöral tüpün eksenine paralel olur.
  4. Cam transfer pipetini kullanarak, grefti donör embriyodan alın.
  5. Grefti boyamak için 2 dakika boyunca Nötr Kırmızı (PBS'de% 0.01, 23 °C) içeren DMEM'ye aktarın ve ardından boyanmış grefti engraftmana hazır olana kadar Nötr Kırmızı içermeyen DMEM'e yerleştirin.

2. Ev sahibini hazırlama

  1. Döllenmiş yumurtaları beyaz Leghorn tavuğundan (Gallus gallus) 37 ° C'de HH7/8 17'ye kadar nemlendirilmiş bir odada kuluçkaya yatırın.
  2. Embriyoları açığa çıkarın (6'da gösterildiği gibi).
  3. Keskinleştirilmiş tungsten iğneleri kullanarak, greft bölgesini yavaşça keserek hazırlayın, ardından donör dokuyu izole etmek için yapıldığı gibi grefti yerleştirmek için sol taraftan 0.3 mm x 0.2 mm'lik bir bazal ön beyin parçasını çıkarın.
  4. Altta yatan endodermin aşırı bozulmasını önlemeye dikkat edin, bu da yumurta sarısı granülleri yapılan herhangi bir yırtılmadan sızmaya başlayacağı için belirgin olacaktır. Bu pratik gerektirir ve tüm girişimler başarılı olmaz.
  5. Konakçı6'ya transfer ettikten sonra, grefti konağın dökülmüş bazal ön beynini değiştirecek şekilde konumlandırın.
  6. Bandı deliğin üzerine sıkıca yerleştirin ve embriyoyu analiz için uygun süre boyunca 37 ° C inkübatöre geri gönderin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kimerizm ve Transplantasyon Kontaminasyonunun Değerlendirilmesi
Kimeraları değerlendirmek için, kimerizmin derecesi ve greftin diğer hücre tipleriyle kontaminasyonu ele alınmalıdır. Bıldırcın dokularını civciv embriyolarına naklederek kimera oluşturmak bu tür analizlere izin verir. QCPN antikoru kullanılarak bıldırcın hücreleri görselleştirilebilir ve konakçı dokulardan ayırt edilebilir (Şekil 1 C,D). Bu durumda, sadece ventral ön beyinden türetilen dokul...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tarif edilen yöntem, bazal ön beyin ile komşu ektoderm arasındaki doku etkileşimlerinin incelenmesine izin verir. Bu yaklaşım önceki ön beyin nakli yöntemlerinden farklıdır, çünkü donör dokusu ventral ön beyinle sınırlıydı. Bu, yüz morfolojisinin modellenmesine katıldığı gösterilen nöral krest hücrelerinin transplantasyonunu ortadan kaldırır 9,10. Bu nedenle, greftin bazal ön beyinle sınırlandırılması, planlanan deneysel sonuçların değerlendirilmesi için çok önem...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Diş ve Kraniofasiyal Araştırma Enstitüsü tarafından R01DE019648, R01DE018234 ve R01DE019638 ödül numaraları altında desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1x PBSTEKTEKZR114
35x10 mm Petri kabıFalcon1008
DMEMThermofisher11965084
İğne tutucuGüzel Bilim Araçları26016-12
Nötr KırmızıSigma553-24-2
No. 5 Dumont forsepsGüzel Bilim Araçları11252-20
Pasteur PipetleriThermofisher13-678-6B
QCPN antikoruGelişimsel Çalışmalar Hibridoma bankası, Iowa Üniversitesi, Iowa, ABD
MakasGüzel Bilim Araçları14058-11
Tungsten İğneGüzel Bilim Araçları26000

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Waddington, C. Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos. Nature. 125, 924-925 (1930).
  2. Noden, D. M. The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).
  3. Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
  4. Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods in Molecular Biology. 461, 337-350 (2008).
  5. Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face. Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).
  6. Hu, D., Marcucio, R. S. Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
  7. Hu, D., Marcucio, R. S. Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals. Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).
  8. Griffin, J. N., et al. Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules. Developmental Biology. 374 (1), 185-197 (2013).
  9. Schneider, R. A., Helms, J. A. The cellular and molecular origins of beak morphology. Science. 299 (5606), 565-568 (2003).
  10. Tucker, A. S., Lumsden, A. Neural crest cells provide species-specific patterning information in the developing branchial skeleton. Evolution & Development. 6 (1), 32-40 (2004).
  11. Fish, J. L., Schneider, R. A. Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
  12. Schneider, R. A. Neural crest and the origin of species-specific pattern. Genesis. 56 (6-7), 23219(2018).
  13. Sohal, G. S. Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos. Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).
  14. Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes. PLoS One. 7 (7), 42477(2012).
  15. Hu, D., Marcucio, R. S. Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation. Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).
  16. Hu, D., et al. Signals from the brain induce variation in avian facial shape. Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).
  17. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  18. Xu, Q., et al. Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape. Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).
  19. Eames, B. F., Schneider, R. A. The genesis of cartilage size and shape during development and evolution. Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).
  20. Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis. Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Doku TransplantasyonuBazal n BeyinN ral Krist H creleriSonic HedgehogFrontonazal Ektodermal B lgeB ld rc n Civciv KimeralarT m Mount HibritizasyonuEmbriyo Manip lasyonu

İlgili makaleler