Endojen Olarak İfade Edilen İnsan RYR1 Varyantlarının İşlevsel Karakterizasyonu

Susan Treves; Thierry Girard; Francesco Zorzato

doi:10.3791/62196

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Endojen Olarak İfade Edilen İnsan RYR1 Varyantlarının İşlevsel Karakterizasyonu

2.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62196

⸱

9 Haziran 2021

Susan Treves¹^,² , Thierry Girard³ , Francesco Zorzato¹^,²

¹Department of Biomedicine, Basel University Hospital, ²Department of Life Sciences, University of Ferrara, ³Department of Anesthesia, Basel University Hospital

Bu makalede

Özet

Burada Epstein Barr Virüs ölümsüzleştirilmiş insan B-lenfositler ve miyotubes içine farklılaştırılmış kas biyopsisi türetilmiş uydu hücreleri endojen olarak ifade edilen RYR1 mutasyonlarının fonksiyonel etkisini incelemek için kullanılan yöntemler açıklanmıştır.

Özet

Malign hipertermi duyarlılığı, çekirdek miyopatiler ve merkezkonükleer miyopati gibi farklı nöromüsküler bozuklukları olan hastalarda RYR1 geninde 700'den fazla varyant tanımlanmıştır. RYR1 mutasyonlarına bağlı çeşitli fenotipler nedeniyle, gelecekteki terapötik müdahaleler için hastalar tarafından taşınan varyantları sınıflandırmak ve patojenik olmayan varyantları tanımlamak için fonksiyonel etkilerini karakterize etmek esastır. Birçok laboratuvar, hastaların hücrelerinde ifade edilen RYR1 mutasyonlarını işlevsel olarak karakterize etmek için yöntemler geliştirmekle ilgilenmiştir. Bu yaklaşımın çok sayıda avantajı vardır: mutasyonlar endojen olarak ifade edilir, RyR1 aşırı ifade edilir, heterolog RyR1 eksprese hücrelerinin kullanımından kaçınılır. Bununla birlikte, hastalar RYR1 dışında farklı genlerde mutasyonlar sunabileceğinden, aynı mutasyonu barındıran bireylerden elde edilen biyolojik materyalin sonuçlarını farklı genetik geçmişlerle karşılaştırmak önemlidir. Bu makale, endojen olarak ifade edilen RYR1 varyantlarının fonksiyonel etkilerini incelemek için geliştirilen yöntemleri açıklar: (a) Epstein Barr virüsü, kas biyopsilerinden elde edilen ve miyotüplere farklılaşan insan B-lenfositlerini ve (b) uydu hücrelerini ölümsüzleştirmiştir. Daha sonra farmakolojik RyR1 aktivatörlerinin eklenmesiyle tetiklenen hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikler izlenir. Seçilen hücre tipi bir oranmetrik floresan kalsiyum göstergesi ile yüklenir ve hücre içi [Ca²⁺] değişiklikler floresan mikroskopi ile tek hücre düzeyinde veya spektrofluorometre kullanılarak hücre popülasyonlarında izlenir. Dinlenme [Ca²⁺], agonist doz yanıt eğrileri daha sonra sağlıklı kontrollerden gelen hücreler ile belirli bir varyantın işlevsel etkisi hakkında fikir veren RYR1 varyantlarını barındıran hastalar arasında karşılaştırılır.

Giriş

Bugüne kadar insan popülasyonunda 700'den fazla RYR1 varyantı tanımlanmış ve malign hipertermi duyarlılığı (MHS), egzersize bağlı rabdomiyoliz, merkezi çekirdek hastalığı (CCD), çoklu minicore hastalığı (MMD), merkezkronükleer miyopati (CNM)^1,²^,³ dahil olmak üzere çeşitli nöromüsküler bozukluklarla bağlantılıdır. ; bununla birlikte, fonksiyonel etkilerini karakterize etme çalışmaları gecikmektedir ve mutasyonların sadece yaklaşık% 10'unu işlevsel olarak test edilmiştir. Belirli bir RyR1 varyantının etkisini değerlendirmek için farklı deneysel yaklaşımlar kullanılabilir, HEK29....