Katı Hal NMR ile Doğal Membranlardaki Proteinlerin Yüksek Çözünürlüklü Çalışmaları

Özet

Bu çalışma, izotop etiketli membran protein örneklerinin nasıl hazırlanacağına ve bunların modern katı hal NMR spektroskopi yöntemleriyle yüksek çözünürlükte nasıl analiz edileceğine dair sağlam temel rutinleri detaylandırmaktadır.

Özet

Membran proteinleri hücre fonksiyonu için hayati öneme sahiptir ve bu nedenle önemli ilaç hedeflerini temsil eder. Katı Hal Nükleer Manyetik Rezonans (ssNMR) spektroskopisi, artan karmaşıklıktaki biyolojik zarlarda bu tür proteinlerin yapısını ve dinamiklerini araştırmak için benzersiz bir erişim sunar. Burada, doğal lipid zarlarında ve atomik ölçekte proteinlerin yapısını ve dinamiklerini incelemek için bir araç olarak modern katı hal NMR spektroskopisini sunuyoruz. Bu tür spektroskopik çalışmalar, yüksek hassasiyetli ssNMR yöntemlerinin, yani proton (¹H) ile tespit edilen ssNMR ve DNP (Dinamik Nükleer Polarizasyon) destekli ssNMR'nin kullanılmasından yararlanır. Bakteriyel dış zar beta-varil proteini BamA ve iyon kanalı KcsA'yı kullanarak, izotop etiketli zar proteinlerini hazırlamak ve ssNMR ile yapısal ve hareketsel bilgi elde etmek için yöntemler sunuyoruz.

Giriş

Fizyolojik olarak ilgili ortamlarda membran proteinlerinin yapısal ve hareketsel çalışmaları, geleneksel yapısal biyoloji tekniklerine bir meydan okuma teşkil etmektedir¹. Modern katı hal nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (ssNMR) yöntemleri, zar proteinlerinin 2,3,4,5,6,7 karakterizasyonu için benzersiz bir yaklaşım sunar ve zara gömülü protein pompaları 8, kanallar ^9,10,11 veya reseptörler^12,13 dahil olmak üzere zar proteinlerini incelemek için uzun süredir kullanılmaktadır ^,14,15. Ultra yüksek manyetik alanlar >1.000 MHz, hızlı sihirli açı eğirme frekansları >100 kHz ve hiperpolarizasyon teknikleri¹⁶ gibi teknik gelişmeler, ssNMR'yi lipozomlardan hücre zarlarına ve hatta tüm hücrelere kadar giderek artan karmaşıklıktaki ortamlarda zar proteinlerinin incelenmesi için güçlü bir yöntem olarak kurmuştur. Örneğin, DNP bu tür deneyler için güçlü bir araç haline gelmiştir (bkz.^referans 17,18,19,20,21,22,23,24,25). Daha yakın zamanlarda, ¹H-tespit edilen ssNMR, membran proteinlerini yüksek spektral çözünürlük ve duyarlılıkta incelemek için artan olanaklar sunmaktadır 25,26,27,28,29. Bu çalışma, protein yerleştirme ve iyon taşınması gibi temel işlevlerde yer alan iki bakteri zarı proteinini vurgulamaktadır. Karşılık gelen proteinler, BamA ^{25,30,31,32,33} ve KcsA 23,27,28,34,35,36,37,38,39 (veya bunların ^10,40 kimerik varyantları) ssNMR tarafından incelenmiştir on yıldan fazla bir süredir yöntemler.

Bakteriyel kaynaklı membran proteinlerinin hazırlanması ve ssNMR karakterizasyonu için temsili bir protokol burada sunulmuştur. Protokolün farklı adımları Şekil 1'de gösterilmiştir. İlk olarak, BamA'nın ifadesi, izotop etiketlemesi, saflaştırılması ve zar sulandırması açıklanmaktadır. Daha sonra, zar proteininin ssNMR ile karakterizasyonu için genel bir iş akışı sunulur; spesifik olarak, hızlı sihirli açı eğirmede ¹H-tespit edilen ssNMR kullanılarak zar proteini omurgalarının atanması. Son olarak, ssNMR sinyal hassasiyetini önemli ölçüde artıran dinamik nükleer polarizasyon (DNP) destekli deneylerin temel kurulumu ve edinimi detaylandırılmıştır.

Protokol

1. Üniform etiketli ²H, ¹³C, ¹⁵N etiketli BamA-P4P5 üretimi

NOT: Bu protokol patojenik olmayan Gram-negatif bakterilerle çalışmayı gerektirse de, temel biyolojik güvenlik prosedürlerine uyulması şarttır, yani koruyucu gözlük, laboratuvar önlüğü, eldiven giymek ve mikroorganizmalarla çalışmak için kurumsal standart çalışma prosedürlerini takip etmek.

1. 50 μg/L ampisilin ile desteklenmiş 50 mL Lizojeni suyunu aşılamak için E. coli BamA-P4P5'i kodlayan pET11aΔssYaeT plazmidini içeren tek bir E. coli BL 21 Star (DE3) kolonisi kullanın.
2. Kültürü 37 °C'de 200 rpm'de 0,6'lık bir OD_600'e ulaşılana kadar büyütün. 10 dakika boyunca 2.000 x g'da döndürün. Peleti 50 mL M9'da (bkz. Tablo 1) maksimum_{OD 600} 0.1'e kadar yeniden süspanse edin.
   NOT: Gelecekteki tüm büyüme adımları, aksi belirtilmedikçe yukarıda belirtilen koşullarda gerçekleşir.
3. Kültürü OD₆₀₀ /0.5'e kadar büyütün. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2.000 x g'da döndürün. Pelet% 90 D 2 O içeren 50 mL_M9'da(tarif için Tablo 1'e bakınız) maksimum OD₆₀₀ 0.1'e kadar yeniden süspanse edin. Kültürü gece boyunca 30 °C'de 200 rpm'de büyütün.
4. Kültürü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2.000 x g'da döndürün. Peleti önceden ısıtılmış 50 mL %90 D₂O M9'da maksimum_{OD 600} 0.1'e kadar yeniden süspanse edin. 1.0 OD_600'e ulaşılana kadar büyüyün.
5. Kültürü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2.000 x g'da döndürün. İzotop bakımından zenginleştirilmiş miktarlarda zenginleştirilmemiş glikoz ve amonyum klorür içeren 100 mL %100 D₂O M9 ortamı hazırlayın. %100 D₂O M9 ortamında maksimum OD₆₀₀ 0.1'e kadar yeniden süspansiyon edin. 0,7'lik bir OD_600'e ulaşılana kadar büyütün.
6. Kültürü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2.000 x g'da döndürün. Süpernatanı atın ve peleti izotoplarla birlikte 500 mL% 100 D₂O M9 ortamında (bkz. Tablo 1) maksimum OD₆₀₀ 0.1'e kadar yeniden süspanse edin.
7. 0.6-0.9'luk bir OD_600'e ulaşılana kadar kültürün büyümesine izin verin. 1 mM izopropil β-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) ile indükleyin. 4 saat boyunca ekspresin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 4.000 x g'da hücreleri hasat edin.

2. Saflaştırma, yeniden katlama ve BamA-P4P5 proteo-lipozom oluşumu

NOT: Bu bölümün tüm adımları bir çeker ocakta yapılmalıdır. Santrifüjleme sonrası tüpleri açarken özel dikkat gösterilmelidir: zararlı aerosolleri sınırlar.

1. Peletleri buz üzerinde çözdürün. Pelet 20 mL soğuk Tampon 1'de tekrar süspanse edin. Arabellekler için Tablo 2'ye bakın.
2. Çözeltiyi 4,000 ° C'de 20 dakika boyunca 4 x g'da döndürün. Peletleri 20 mL soğuk damıtılmış H₂O içinde yeniden süspanse edin. Süspansiyonun buz üzerinde 10 dakika inkübe etmesine izin verin.
3. Süspansiyonu 4,000 °C'de 20 dakika boyunca 4 x g'da döndürün. 10 mL soğuk Tampon 2'de tekrar süspanse edin ve 30 dakika buz üzerinde inkübe etmeye bırakın.
4. Karışımı ilave 10 mL soğuk tampon 2 ile destekleyin ve buz üzerinde 30 dakika daha inkübe edin. % 0.5 n-Dodesil-BD-Maltoside (DDM) ekleyin ve hafifçe döndürün.
5. Numuneyi 13 kHz'de buz üzerinde sonikasyon yapın, kısır kullanım 10 s uzunluğunda açma / kapama darbelerine kadar. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 25.000 x g'da döndürün. 20 mL Tampon 3 ile üç kez yıkayın. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 25.000 x g'da santrifüjleyin.
6. Peleti 20 mL Tampon 4'te yeniden süspanse edin. 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Numuneyi 13 kHz'de buz üzerinde sonikasyon, 10 s uzunluğunda açma / kapama darbeleri net bir şekilde kullanana kadar.
7. Numuneyi 25,000 ° C'de 20 dakika boyunca 4 x g'da döndürün. Proteaz inhibitörü ilavesini ve 37 ° C'de inkübasyonu atlayarak 2.4 ila 2.6 arasındaki adımları tekrarlayın.
8. Peleti 20 mL su ile ve iki kez Tampon 3 ile yıkayın. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 25.000 x g'da döndürün. Süspansiyonu 1 mL mikrosantrifüj tüplerine alın ve mikrosantrifüj tüplerini 20 dakika boyunca tezgah üstü bir santrifüjde maksimum hızda döndürün. İnklüzyon vücut saflığı% 10 SDS-Page jeli ile değerlendirilir, bkz. Şekil 2A. Etiketlenmiş saflaştırılmış BamA-P4P5 üçlü (²H, ¹³C , ¹⁵N) için beklenen verim 30 mg / L'dir.
9. İnklüzyon cisimciklerini 200 μL Tampon 5 ve 300 μL_H2O'daçözündürün. 6M guanidyum klorür (GdnCl) ekleyin. Mikrosantrifüj tüpünün hacmini H₂O ile 1 mL'ye ayarlayın ve karışımı vorteksleyin ve oda sıcaklığında 4 saat inkübe edin. Mikrosantrifüj tüplerini periyodik olarak (her 30 dakikada bir) vorteksleyin.
10. 4 °C'de 1 saat boyunca 100.000 x g'da sıkın. Protein konsantrasyonunu 280 nm belirlemek için Beer-Lambert Yasasını kullanın. Molar sönme katsayısı 117,120 ^{M-1 cm-1'dir}. Konsantrasyon >100 μM ise, 1x Tampon 5 ile 6 M GdnCl ile seyreltin. Proteini Tampon 6'da 10x hızla seyreltin. Karışımı gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    NOT: Ultrasantrifüjleme için ultrasantrifüj sınıfı 1,5 mL tüpler kullanın.
11. Yarı doğal bir SDS-Page jeli kullanarak yeniden katlama verimliliğini belirleyin. Adım 2.10'dan iki adet 10 μL'lik alikot alın ve her alikota 10 μL Lameili tamponu (tampon 8) ekleyin. Bir numuneyi 95 °C'de 10 dakika kaynatın; Diğer alikotu buzun üzerinde bırakın. Daha sonra, her iki numuneyi de %10'luk bir SDS-Page jel üzerinde 14 mA'da çalıştırın. Jellerin istifleme ve çalışma kısımları indirgeyici ajan ve SDS'den yoksundur. Protein boyama, Coomassie boyası kullanılarak elde edilir. Beklenen sonuçlar Şekil 2B'de gösterilmiştir.
12. Numuneyi 4,000 ° C'de 20 dakika boyunca 4 x g'da döndürün. Numuneyi 30 kDa'lık bir santrifüj filtre kullanarak 8 mL'lik bir çalışma hacmine konsantre edin. Numuneyi 4,000 ° C'de 20 dakika boyunca 4 x g'da döndürün. Protein emilimini 280 nm'de ölçün. Adım 2.10'da olduğu gibi, protein konsantrasyonunu belirleyin.
13. 10:1 lipid/protein oranı (LPR-mol/mol) için gereken lipid miktarını hesaplayın. Bir kloroform stoğundan, adım 2.12'de hesaplandığı gibi gerekli miktarda lipiti 100 mL'lik yuvarlak tabanlı bir şişeye (RBF) ekleyin. Kloroformu RBF'den hafif bir nitrojen akışı altında boşaltın. RBF'yi 3 saat boyunca yüksek vakuma koyun. Lipid filmi 1 mL Tampon 7 ile nemlendirin. RBF'yi 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
14. Protein karışımını (adım 2.12'den itibaren) RBF'ye ekleyin.
15. Protein / lipit karışımını (adım 2.14'ten itibaren) RBF'deki 50 mL'lik son hacme kadar seyreltin. DMSO'da çözünmüş 1x proteaz inhibitörü ile desteklenmiş Tampon 7'yi kullanın ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
16. 2 hafta boyunca 100 hacim Tampon 7'ye karşı diyalize gidin (12-14 kDa moleküler ağırlıklı kesme diyaliz tüpü kullanın). İlk 24 saat boyunca, diyalizi oda sıcaklığında her 8 saatte bir taze Tampon 7 ilavesiyle gerçekleştirin. Daha sonra tamponu günde bir kez değiştirin ve 4 °C'de diyaliz yapın.

3. ssNMR rotorunun doldurulması

1. Adım 2.16'dan sonra, bir pelet oluşması için 4 °C'de 10.000 x g'da 30-60 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir pipetle çıkarın.
   NOT: Aşağıda tartışılan teknik, 3,2 mm'lik bir rotor için optimize edilmiştir ancak hemen hemen her rotor çapı için geçerlidir.
2. Numuneyi rotora pipetleyin ve aynısını bir tabla santrifüjü ile yavaşça döndürün.
   NOT: Numune tutarlılığına bağlı olarak, numuneyi sıkıştırmak için bir yoğunlaştırma aracı veya numuneyi rotora koymak için pipet yerine bir spatula kullanılabilir.
3. Rotor doğru yüksekliğe kadar dolana kadar bu işlemi 2-3 kez tekrarlayın ve yoğunlaştırma aletindeki işaret çizgisiyle gösterildiği gibi kapak için yeterli alan olup olmadığını kontrol edin. Rotoru kapak konumlandırma aletiyle düz bir yüzeyde kapatın. Rotorun alt kenarının yarısını işaretleyin.
   NOT: Yeni ssNMR rotor nesilleri, rotor eğirme frekansının optik olarak algılanması için alt kenarda dayanıklı bir lazer işareti ile birlikte gelir. Aksi takdirde, bir keskin kalem kullanılması önerilir; MAS dedektörü özellikle sharpie mürekkebi için optimize edilmiştir.
4. Kapağın iyi yerleştirilip yerleştirilmediğini kontrol etmek için bir büyüteç kullanın.

4. 2D ¹³C- ¹³C ssNMR spektroskopisi ile numune karakterizasyonu

1. MAS ünitesinin otomatik eğirme rutinini kullanarak rotoru mıknatısın içine yerleştirin, numuneyi 10 K ayar sıcaklığına soğuturken 20 ila 270 kHz MAS arasında istenen MAS frekansına kadar döndürün. ¹H ve ¹³C kanallarını ayarlayın ve eşleştirin.
   NOT: MAS frekansının seçimi için, spektral Cα bölgesi ile Karbonil karbon bölgesi arasındaki kimyasal kayma mesafesini yanlışlıkla eğirme frekansıyla eşleştirmekten kaçının, yani birinci dereceden dönme rezonans koşulu^41'den kaçının.
2. Proton kanalındaki rf gücünü 1-13 kHz arasında değiştirerek 42 H-25 C çapraz polarizasyon⁸⁰ (CP) deneyini optimize edin. Tipik parametreler ¹³° C'de 45 kHz rf gücü, 80-100 kHz heteronükleer ¹H-dekuplaj⁴³ edinim sırasında, 1.8-2.0 s geri dönüşüm gecikmesi ve 64 taramadır.
   1. Alifatik karbonlarda maksimum sinyal hassasiyeti için CP temas süresini optimize edin.
   2. ^Başlangıçdarbesini ^dörtile çarparak, yani 360°'lik bir darbeyi optimize ederek 13 C-CP deneyinde 1 H 90° darbe uzunluğunu belirleyin ve sinyal kaybolana kadar uzunluğu değiştirin. CP aktarımından hemen sonra dikdörtgen bir darbe ekleyin ve ¹³C 90° darbe uzunluğunu benzer şekilde optimize edin.
3. Kalıntı içi korelasyonları tespit etmek ve numune kalitesini ölçmek için 30 ms manyetizasyon transfer süresine sahip PARIS gibi 2D ^{13 C-13}C proton tahrikli spin difüzyon (PDSD) tipi bir deney çalıştırın. Daha önce optimize edilmiş ¹³C-CP deneyinden güç seviyelerini, temas süresini ve 90° darbe uzunluklarını aktarın. Dolaylı boyutta 4-6 ms'lik bir alım süresi kullanın. Spektrumu kare günah çanı fonksiyonları (QSIN) ile veya duyarsız örnekler için her iki boyutta üstel çizgi genişletme ile işleyin.
4. İzole edilmiş çapraz tepe dilimlerini çıkarın ve yarı yüksekliklerde çizgi genişliğini belirleyin. ~0.3-1.0 ¹³C ppm arasındaki bir çizgi genişliği, ssNMR karakterizasyonu için ideal olan iyi sıralanmış bir numunenin göstergesidir, oysa 1.0 ¹³C ppm'nin üzerindeki bir çizgi genişliği, ssNMR karakterizasyonunu tehlikeye atabilecek konformasyonel heterojenliğin göstergesidir. Şekil 3A'da gösterilen BamA'nın 2D CC PARIS spektrumu, yüksek kaliteli spektrumlar veren iyi düzenlenmiş bir protein örneğidir.

5. ¹H tarafından algılanan 3D ssNMR spektroskopisi ile omurga ataması

1. 2D NH spektral parmak izlerinin elde edilmesi
   1. Numuneyi yukarıda açıklandığı gibi 1,3 mm'lik bir rotorda doldurun. Rotoru mıknatısın içine yerleştirin, numuneyi 10-20 kHz MAS'a döndürün ve ssNMR prob kafasının özelliklerine bağlı olarak numuneyi 240-250 K ayar sıcaklığına veya daha düşük bir sıcaklığa soğutun. MAS frekansını 5 kHz ila 60 kHz MAS arasındaki adımlarla kademeli olarak artırmak için MAS ünitesi arayüzünü kullanın.
   2. ¹³C ve 15 N CP deneylerinde CP genliklerini, temas sürelerini ve ⁹⁰° darbe uzunluklarını optimize edin. Heteronükleer kanallarda 30-50 veya 70-100 kHz civarında genlikler kullanın ve ¹H kanalındaki genliği 80-180 kHz arasında değiştirin. 0.7 kHz düşük güçlü heteronükleer proton ayırma 1.2 ile birlikte^15-44 s'lik bir geri dönüşüm gecikmesi kullanın. Ayrıca, CP ssNMR deneylerinin nasıl kurulacağına ilişkin daha fazla pratik ayrıntı için referans^45'e bakın.
   3. ¹H çözünürlüğünü ölçmek için bir 2D NH deneyi edinin. ¹⁵N-CP parametresini aktarın ve doğrudan ve dolaylı boyutlarda yaklaşık 15 ve 25 ms çekim süresi kullanın. İlk ¹H ila ¹⁵N CP aktarımı için önceden optimize edilmiş temas süresini kullanın. ¹⁵N ila ¹H geri aktarım için, artık manyetizasyon transferini en aza indirmek için 0.7-1.0 ms temas süresi kullanın.
   4. Numune su içeriğine bağlı olarak 50-250 ms su MISSISSIPPI bastırma⁴⁶ kullanın. Spektrumu her iki boyutta da kare günah zili fonksiyonları (QSIN) ile işleyin. İzole edilmiş çapraz tepe dilimlerini çıkarın ve yarı yüksekliklerde çizgi genişliğini belirleyin. Şekil 3B'de membrana gömülü BamA-P4P5 için yüksek kaliteli bir 2D NH spektrumu²⁵ örneği gösterilmiştir.
2. Omurga atamaları
   1. 1D ¹⁵N ila ¹³Cα spesifik CP deneyini^{optimize edin 47}. ¹³C taşıyıcıyı Cα bölgesinin ortasına yaklaşık 55 ppm yerleştirin. 20 kHz'lik bir ¹³C rf genliği kullanın ve Cα sinyallerine maksimum aktarım ve karbonil sinyallerine minimum aktarım için ¹⁵N genliği 35 ila 45 kHz arasında değiştirin. Temas süresini 1 ms'lik artışlarla 3 ila 10 ms arasında optimize edin.
   2. Bir 3B CαNH deneyi çalıştırın. Tüm CP genliklerini, temas sürelerini ve darbe uzunluklarını önceden optimize edilmiş adımlardan aktarın. Dolaylı ve doğrudan edinim boyutlarında yaklaşık 10 ms ve 30 ms kullanın. Spektrumu her üç boyutta da kare günah zili fonksiyonları (QSIN) ile işleyin.
   3. 1D Cα'dan CO DREAM'e manyetizasyon transferini^{optimize edin 48}. ¹⁵N ila ¹³Cα spesifik CP transferi ile başlayın. Ardından, ¹³C kanalında bir döndürme kilidi kullanarak manyetizasyonu Cα'dan CO'ya aktarın. Optimum aktarım için rf genliğini 20 ila 35 kHz arasında değiştirin. Aktarım süresini 4 ila 10 ms arasında optimize edin.
   4. Bir 3B Cα(CO)NH deneyi yapın. Daha önce optimize edilmiş adımlardan tüm rf genliklerini, temas sürelerini ve darbe uzunluklarını aktarın. Dolaylı ve doğrudan edinim boyutlarında yaklaşık 10 ms ve 30 ms kullanın. Spektrumu her üç boyutta da kare günah zili fonksiyonları (QSIN) ile işleyin.
   5. Benzer 3D CONH ve CO(Cα)NH deneyleri için 1-4 arasındaki adımları tekrarlayın ve uyarlayın. Şekil 4^28'deki KcsA örneğinde gösterildiği gibi, protein omurgasını atamak için sıralı Cα ve CO yürüyüşleri için bu dörtlü 3B deneyleri kullanın.

6. ¹H tarafından tespit edilen ssNMR spektroskopisi ile protein dinamikleri

1. ¹⁵N T₁ etütleri için, 60 kHz MAS'ta önceden optimize edilmiş 2D NH deneyini kullanın ve ilk ¹H ila ¹⁵N çapraz polarizasyon adımından sonra bir gecikme ekleyin. Bir dizi 2D NH deneyi edinin ve örneğin 0, 2, 4, 8 ve 16 s'lik adımları kullanarak gecikmeyi 0 ila 16 sn arasında değiştirin.
2. Artan gecikme süresinin bir fonksiyonu olarak çözülen sinyaller için normalleştirilmiş yoğunlukları çizin. T'yi_{sığdırın1} bozunmasını y = exp^(-x/T1)'e göre tek üstellere sığdırın, y bozunma zamanı x'teki sinyal yoğunluğudur.
3. Benzer şekilde, ¹⁵N T_1rho çalışmaları için, ^{ilk 1 H ila}15 N çapraz polarizasyon adımından^sonra 20-26,49 kHz arasında bir rf genliği ile 15 N kanalındaki darbe programına bir spin-lock darbesi ekleyin. Bir dizi 2D NH deneyi elde edin ve gecikmeyi 0 ila 150 ms arasında değiştirin ve çözülen sinyallerin T_1rho bozunmasını tek üstellere sığdırın. Açıklayıcı ¹⁵N T_1rho verileri, Şekil 5 27,28'de membrana gömülü K⁺ kanalları için gösterilmiştir.

7. Dinamik nükleer polarizasyon

NOT: Aşağıdaki hazırlık adımları, 3.2 mm safir MAS rotorları kullanan ticari bir DNP kurulumlarının kullanımıyla ilgilidir (Şekil 6)²⁰. Zirkonya rotorlarının veya diğer DNP ekipmanlarının kullanılması, daha düşük DNP sinyal geliştirmelerine yol açabilir.

1. 50 μL döteryumlu DNP tamponu (%60 (h/h) döteryumlu d8- ve gliserol ve 15 mM AMUPol⁵⁰ içinde membran protein peletini (adım 3.1'den itibaren) yeniden süspanse edin. 800 MHz'deki deneyler için 10 mM NATriPOL-3⁵¹ kullanmanızı öneririz. Ayrıca DNP ssNMR deneylerinin daha pratik yönleri için referans^52'ye bakın.
2. Bir pelet oluşması için 4 ° C'de 100.000 x g'de 10-20 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir pipetle çıkarın.
3. Santrifüj adaptörünü ve 3,2 mm safir MAS rotor bileşenlerini <4 °C'ye kadar önceden soğutun. DNP ajanlarının azalmasını önlemek için aşağıdaki adımların (7.4-7.7) mümkün olduğunca çabuk yapılması gerekir.
4. 3.2 mm safir rotoru santrifüj adaptörüne yerleştirin ve adım 7.2'deki proteo-lipozomların süspansiyonu ile doldurun.
5. Yeniden süspanse edilmiş membran protein örneğini 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak rotorun iç duvarına dikkatlice pipetleyin. Çözeltinin rotorun altına doğru kaymasına izin verin. Hava kabarcıklarının oluşmadığından emin olun.
6. Numuneyi rotorda 5-10 dakika, 4,500 x g'de 4 °C'de döndürün. Fazla DNP suyu içeren süpernatanı, hücre peletini bozmadan dikkatlice pipetleyerek çıkarın. Rotor dolana kadar 6.4-6.6 adımlarını tekrarlayın.
7. Rotorun üstündeki ara vidayı kullanarak politetrafloroetilen (PTFE) ara parçasını dikkatlice yerleştirin.
8. Rotoru, kapak tarafı aşağı bakacak şekilde bir rotor pistonuna⁵³ yerleştirin ve rotoru sıvı nitrojenin içine daldırın. Rotor ve numunenin donması için en az 30-60 saniye bekleyin.
9. Isı eşanjörü ünitesini çalıştırın ve DNP probunu ~90K'ya soğutun.
10. MAS ünitesini Manuel moda ayarlayın ve değişken sıcaklığı (VT) 135 l/s'ye ve yatak ve tahrik gazı akışlarını ~6 l/s'ye ayarlayın.
11. MAS konsolunda Çıkar ile etkileşime geçin.
12. Adım 7.8'deki donmuş numuneyi sıvı N2'den numune tutucuya aktarın ve proba yerleştirin (ayrıca bkz. referans⁵³).
13. "Insert" i devreye sokmadan önce prob yatak basıncını (Bp) manuel olarak ~500 mbar'a yükseltin. Bu, rotorun dengeli ve güvenli bir şekilde eğirilmesi için tavsiye edilir.
14. Referans^53'te açıklanan prosedürü kullanarak MAS oranını istenen değere yükseltin.
15. Çok boyutlu deneylere devam etmeden önce, standart bir 1D CP deneyi (ayrıca bkz. örneğin, referans ^51,54) (Şekil 7) kullanarak mikrodalgalı ve mikrodalgasız DNP geliştirmelerini kontrol edin, örneğin, bu makalenin 3. bölümünde açıklanan 2D CC deneyleri.

Sonuçlar

Şekil 2, inklüzyon cisimciği saflığı (Panel A) ve inklüzyon cisimlerinin yeniden katlanması (Panel B3) için temsili jelleri göstermektedir. Şekil 2 , ^{13 C,15}N etiketli BamA-P4P5'in başarılı bir şekilde saflaştırıldığını doğrulamaktadır.

Şekil 3A, iyi düzenlenmiş bir zar proteininin tipik bir 2D ^{13 C-13}C spektrumunu gösterir ve Şekil 3B

Tartışma

Membran proteinleri, hem prokaryotik hem de ökaryotik organizmalarda hayati hücresel fonksiyonların düzenlenmesinde kilit oyunculardır; Bu nedenle, atomik çözünürlük seviyelerinde etki mekanizmalarını anlamak hayati önem taşımaktadır. Mevcut yapısal biyoloji teknikleri, zar proteinlerinin bilimsel anlayışını oldukça ileri götürmüştür, ancak zarlardan yoksun in vitro sistemlerden toplanan deneysel verilere büyük ölçüde dayanmıştır. Bu makalede, en son katı hal NMR tekniklerini, yani fast-...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Amonyum molibdat	Merck	277908
Amonyum-15N Klorür	Cortecnet	CN80P50
Ampisilin	Sigma Aldrich	A9518
AMUpol	Cortecnet	C010P005
Benzonaz	EMD Millipore Corp	70746-3
Borik asit	Merck	B6768
bromofenol mavisi	Sigma	B0126
kalsiyum diklorür	Merck	499609
Kolin klorür	Sigma	C-1879
Kobalt klorür	Merck	449776
Bakır sülfat	Merck	C1297
D-Biotin	Merck	8512090025
Döteryum Oksit	Cortecnet	CD5251P1000
Dimetil sülfoksit	Merck	D9170
Etilendiamintetraasetik asit	Sigma Aldrich	L6876
Folik asit	Sigma	F-7876
Glikoz 13C + 2H	Cortecnet	CCD860P50
Gliserol	Honeywell	G7757
Gliserol (12C3, %99,95 D8, %98)	Eurisotop	CDLM-8660-PK
gliserol (zenginleştirilmemiş)	Honeywell	G7757-1L
Glisin	Sigma Aldrich	50046
Guanidin hidroklorür	Roth Carl	NR.0037.1
Demir sülfat	Merck	307718
izopropil ve beta;-D-1-tiyokalaktopiranosit	Thermofisher	R0392
Lizojen Et Suyu	Merck	L3022
Lizozim	Sigma Aldrich	L6876
Magnezyum klorür - hekzahidrat	Fluka	63064
magnezyum sülfat	Merck	M5921
monopotasyum fosfat	Merck	1051080050
Myoinositol	Sigma	I-5125
n-Dodesil-BD-maltosit	Acros Organics	3293702509
N, N-Dimetildodesilamin N-oksit	Merck	40236
Nikatinamid	Sigma	N-3376
Pantotenik asit	Sigma	21210-25G-F
proteaz inhibitörü	Sigma	P8849
Piridoksal-HCl	Sigma Aldrich	P9130
Riboflavin	Aldrich	R170-6
Sodyum Klorür	Merck	K51107104914
Sodyum dihidrojen fosfat - monohidrat	Sigma Aldrich	1,06,34,61,000
Sodyum dodesil sülfat	Termo-bilimsel	28365
Sodyum hidroksit	Merck	1,06,49,81,000
Sükroz	Sigma Yaşam	Bilimleri S9378
Tiamin-HCl	Merck	5871
Tris-HCl	Sigma Aldrich	10,70,89,76,001
Çinko klorür	Merck	208086
E.coli BL21 DE3*	New England Biolabs	C2527
1.5 mL Ultra tüpler	Beckman Coulter	357448
30 kDa santrifüj filtre	Amicon	UFC903024
3,2 mm safir DNP rotor, kapaklı	Cortecnet	H13861
3,2 mm teflon uç	Cortecnet	B6628
3,2 mm numune paketleyici/paketten çıkarıcı	Cortecnet	B6988
3,2 mm Normal Duvar MAS Rotor	Cortecnet	HZ16913
3,2 mm Normal Duvar MAS rotoru	Cortecnet	HZ09244
3,2 mm İnce Duvar rotoru için Alet Kiti	Cortecnet	B136904
1,3 mm MAS rotor + kapaklar	Cortecnet	HZ14752
1,3 mm doldurma aleti	Cortecnet	HZ14714
1,3 mm numune paketleyici	Cortecnet	HZ14716
1,3 mm kapak sökücü	Cortecnet	HZ14706
1.3 mm kapak seti aleti	Cortecnet	HZ14744
Diyaliz tüpü 12-14 kDa	Spectra/Por	132703
Sharpie - Black	Merck	HS15094