Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Summary

Bu protokol, prob ucu sonikasyonu kullanarak büyük hacimlerde lipid kapsüllenmiş decafluorobutane mikrobubbles üretme ve daha sonra yüksek basınçlı ekstrüzyon ve mekanik filtrasyon kullanarak faz kaydırma nanodropletlerine yoğuşma yöntemini açıklar.

Abstract

Görüntüleme ve tedavi için buharlaştırılabilir faz kayması damlacıklarının üretimi için kullanılabilecek birçok yöntem vardır. Her yöntem farklı teknikler kullanır ve fiyat, malzeme ve amaca göre değişir. Bu imalat yöntemlerinin çoğu, tekdüze olmayan aktivasyon eşiklerine sahip polidispers popülasyonlarla sonuçlanır. Ek olarak, damlacık boyutlarının kontrol altına getirilmesi tipik olarak pratik in vivo olmayan yüksek aktivasyon eşiklerine sahip kararlı perflorokarbon sıvılar gerektirir. Düşük kaynayan nokta gazları kullanarak tek tip damlacık boyutları üretmek in vivo görüntüleme ve terapi deneyleri için faydalı olacaktır. Bu makalede, düşük kaynama noktası decafluorobutane (DFB) ile boyut filtreli lipid stabilize faz kaydırma nanodropletlerinin oluşumu için basit ve ekonomik bir yöntem açıklanmaktadır. Lipid mikrobubbles oluşturmanın yaygın bir yöntemi, tek bir adımda yüksek basınçlı ekstrüzyon ile yoğuşma yeni bir yönteme ek olarak açıklanmaktadır. Bu yöntem, birçok biyolojik laboratuvarda bulunan ortak laboratuvar ekipmanlarını kullanarak çok çeşitli uygulamalar için zamandan tasarruf etmek, verimliliği en üst düzeye çıkarmak ve çok çeşitli uygulamalar için daha büyük hacimlerde mikrobubble ve nanodroplet çözümleri üretmek için tasarlanmıştır.

Introduction

Ultrason kontrast ajanları (UCAs) görüntüleme ve tedavi uygulamaları için popülaritesi hızla artmaktadır. Mikrobubbles, orijinal UCA’lar, şu anda klinik tanı uygulamalarında kullanılan ana akım ajanlardır. Mikrobubbles, genellikle 1-10 μm çapında, lipid, protein veya polimer kabuklarla çevrili gaz dolu ^kürelerdir1. Ancak, boyutları ve in vivo stabiliteleri birçok uygulamada işlevlerini sınırlayabilir. Aşırı ısınmış bir sıvı çekirdek içeren faz kaydırma nanodropletleri, daha küçük boyutları ve geliştirilmiş dolaşım ömrü nedeniyle bu sınırlamaların bazılarının üstesinden ^gelebilir2. Isıya veya akustik enerjiye maruz kaldığında, aşırı ısınmış sıvı çekirdek buharlaşarak gaz mikrobubble2,3,4,5 oluşturur. Buharlaşma eşiği damlacık ^boyutu5,6 ile doğrudan ilişkili olduğundan, tekdüze boyutta damlacık süspansiyonlarının formüle edilmesi tutarlı aktivasyon eşiklerine ulaşmak için son derece arzu edilir. Tek tip damlacık boyutları üreten formülasyon yöntemleri genellikle karmaşık ve maliyetlidir, daha uygun maliyetli yaklaşımlar ise polidisperse çözümleriyle ^{sonuçlanır7}. Diğer bir sınırlama, ^vivo8’de verimli aktivasyon için kritik olan düşük kaynama noktası perflorokarbon (PFC) gazları ile kararlı faz kayması damlacıkları üretme yeteneğidir. Bu yazıda, in vivo görüntüleme ve terapi uygulamaları için kararlı filtrelenmiş düşük kaynama noktası buharlaştırılabilir faz kayması damlacıkları üretmek için bir protokol açıklanmıştır.

Monodispersed altmikron faz-shift damlacıkları üretmenin birçok yöntemi ^vardır7. Boyutu kontrol etmenin en sağlam yöntemlerinden biri mikroakışkan cihazların kullanılmasıdır. Bu cihazlar maliyetli olabilir, yavaş damlacık üretim oranlarına (~104-106 damlacık/ s)⁷ sahip olabilir ve kapsamlı eğitim gerektirir. Mikroakışkan cihazlar ayrıca sistemin kendiliğinden buharlaşmasını ve tıkanmasını önlemek için genellikle yüksek kaynama noktası gazlarına ihtiyaç ^duyar7. Bununla birlikte, de Gracia Lux ve ^ark.9 tarafından yapılan yeni bir çalışma, bir mikrofloluidizatörin soğutulmasının, düşük kaynama noktası decafluorobutane (DFB) veya octafluoropropane (OFP) kullanarak yüksek konsantrasyonlarda mikron faz kayması (^1010-1012/mL) üretmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Genel olarak, DFB veya OFP gibi düşük kaynayan nokta gazlarının önceden biçimlendirilmiş gaz kabarcıkları kullanılarak işlenmesi daha kolaydır. Buharlaştırılabilir damlacıklar, düşük sıcaklıklar ve ^{yüksek basınç5,10} kullanılarak gazın yoğunlaşarak öncü lipid stabilize kabarcıklardan üretilebilir. Bu yöntem kullanılarak üretilen damlacıkların konsantrasyonu öncü mikrobubble konsantrasyonuna ve kabarcıkların damlacıklara dönüştürülmesinin verimliliğine bağlıdır. Konsantre mikrobubbles ^{1010 MB / mL11} > yaklaşan uç sonication bildirilmiştir^{, ayrı} bir çalışma yoğunlaşmış OFP ve DFP kabarcıkları gelen ~1-3 ^x1011 damlacık / mL arasında değişen damlacık konsantrasyonları bildirilmiştir12. Monodispersed damlacıklar bir sorun olmadığında, yoğuşma yöntemleri, düşük kaynama noktası PFC’leri kullanarak lipid stabilize faz kaydırma damlacıkları üretmenin en basit ve en düşük maliyetli yöntemleridir. Yoğuşmadan önce tekdüze boyut kabarcıkları oluşturma yöntemleri, daha fazla monodisperse damlacık popülasyonu oluşturmaya yardımcı olabilir. Bununla birlikte, monodisperse öncü kabarcıkları üretmek de zordur, mikroakışkanlar veya tekrarlanan diferansiyel santrifüj teknikleri gibi daha maliyetli yaklaşımlar ^gerektirir11. DFB ve OFB nanodroplets üretimine alternatif bir yaklaşım son zamanlarda lipozomlarda damlacıkların kendiliğinden çekirdeklenmesi kullanılarak ^{yayınlanmıştır13}. Bir “Uzo” etkisi kullanan bu yöntem, kabarcıkları yoğunlaştırarak ihtiyaç duymadan düşük kaynama noktası PFC damlacıkları üretmenin basit bir yoludur. PFC damlacıklarının boyut dağılımı, damlacıkların çekirdeklenmesini başlatmak için kullanılan hassas titrasyon ve PFC, lipid ve etanol bileşenlerinin karıştırılması ile kontrol edilebilir. Ayrıca, perflorokarbonların karıştırılmasının nanodropletlerin stabilitesini ve aktivasyon eşiklerini kontrol etmek için kullanılabileceğini belirtmek ^gerekir14,15. Shakya ve ark. tarafından yapılan daha yeni çalışmalar, damlacık çekirdeği içindeki heterojen çekirdeklenmeyi kolaylaştırmak için bir hidrokarbon endoskeleton içindeki yüksek kaynama noktası PFC’leri emülsifiye edilerek nanodroplet aktivasyonunun nasıl ayarlanabileceğini ^{göstermektedir16}, bu da diğer damlacık boyutu filtrasyon biçimleriyle birlikte düşünülebilecek bir yaklaşımdır.

Oluştuktan sonra, faz kayması damlacıkları oluşumdan sonra ekstrüde edilerek daha fazla monodispers popülasyonu oluşturulabilir. Aslında, burada açıklanan yönteme benzer bir protokol daha önce Kopechek ve ^ark.17 tarafından damlacık çekirdeği olarak yüksek kaynama noktası dodecofluorpentane (DDFP) kullanılarak yayımlanmıştır. Yüksek kaynama noktası perflorokarbonlu (oda sıcaklığında stabil) faz kaydırma damlacıkları kullanmak isteyen okuyucular bunun yerine yukarıdaki makaleye referans vermelidir. DFB ve OFP gibi düşük kaynama noktası gazları ile damlacık üretmek ve ekstrüde etmek daha karmaşıktır ve en iyi önceden biçimlendirilmiş gaz kabarcıklarının yoğunlaştırılmasıyla yaklaşılır.

Bu protokolde, prob ucu sonikasyonu kullanılarak DFB gaz çekirdeği ile önceden biçimlendirilmiş lipid mikrobubbles oluşturmanın yaygın bir yöntemi açıklanmıştır. Daha sonra, önceden biçimlendirilmiş mikrobubbles mikromikron faz kaydırma nanodroplets içine yoğuşmak için ticari bir ekstrüder kullanılır (Şekil 1). Elde edilen damlacıklar daha sonra ısı ve ultrason ile aktive edilebilir. Bu yöntem, pahalı mikroakışkan cihazlara ihtiyaç duymadan daha dar boyut dağılımlarına sahip geleneksel yoğuşma yöntemlerinden daha büyük miktarlarda nanodroplet çözeltisi üretebilir. Dar boyutlu dağılımlara sahip nanodroplet çözeltilerinin üretimi muhtemelen daha düzgün buharlaşma eşikleri oluşturabilir. Bu, görüntüleme, ablasyon, ilaç teslimi ve embolizasyon ^gibi çok sayıda uygulama için potansiyellerini en üst düzeye çıkaracaktır1,3,4,6.

Şekil 1: Önceden biçimlendirilmiş mikrobubbles faz kaydırma nanodropletler içine yoğuşmak için yüksek basınçlı ekstrüzyon kurulumu şeması. Mikrobubble çözeltisi ekstrüder odasına eklenir ve bulunur ve azot tankından 250 psi, oda giriş vanasından uygulanır. Azot gazı, mikrobubble çözeltisini odanın tabanındaki filtreden geçirerek numuneyi nano damlacıklara yoğunlayacaktır. Çözelti sonunda numune çıkış tüpünden ekstrüder dışına itilir ve toplanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protocol

1. Lipid filmleri yapmak

1. Lipitleri aşağıdaki talimatları kullanarak doğru oranda karıştırarak% 90 DSPC ve% 10 DSPE-PEG2K kullanarak mikrobubble üretimi için lipid filmleri hazırlayın:
   1. DSPC ve DSPE-PEG2K stok lipitlerini kloroform olarak yapın. Her lipit tozunun 50 mg’ını ayrı şişelerde tartın. 1 mL cam şırınna kullanarak her şişeye 1 mL kloroform ekleyin.
   2. Cam şırıngam kullanarak 20 mL scintillation şişesine 287 μL DSPC stoğu ve 113 μL DSPE-PEG2K stoğu (her ikisi de 50 mg/mL) ekleyin.
   3. Azot kullanarak kloroformu çıkarmak için karışık lipitleri kurutun. Ev nitrojenine bağlı uygun bir boru uzunluğu kullanarak, karıştırma yaparken şişenin kafa boşluğu üzerinden hafifçe azot gazı akışı. Kloroform gözlenene ve kalan lipit filmi beyazlaşmaya başlayana kadar devam edin. Polipropilen vidalı kapaklar kullanın, kafa boşluğuna azot sokulurken numuneyi örtün.
   4. Artık kloroformları çıkarmak için bir vakum kurutucu kullanarak şişeleri bir gecede vakumun altına yerleştirin. Şişenin altını kaplayan ince yarı saydam bir film kalacaktır.
   5. Şişeleri ihtiyaç duyulana kadar -20 °C’de saklayın.

2. Lipid filmlerinden mikrobubbles üretmek

1. Mikrobubbles yapmak için, kuru bir lipid filme% 20 v / v Propilen Glikol ve% 20 v / v Gliserol (son pH 7.2-7.4) içeren 1x fosfat tampon salin (PBS) 10 mL ekleyin.
2. Numuneyi ve ılık numuneyi bir ısıtma bloğunda (veya ısıtmalı su banyosunda) 30 dakika boyunca 65 °C’ye yeniden kaplayın.
3. Numune ısınırken, banyo sıcaklığını 65 ° C’ye artırarak banyo sonicator’u hazırlayın.
   NOT: Banyo sonicator’a yerleştirmeden önce su mikrodalga fırında veya ocakta önceden ısıtılırsa bu işlem daha hızlıdır.
4. Isıtılmış örneği içeren scintillation şişesini banyo sonicator’a yerleştirin, böylece şişenin sadece lipit çözeltisini içeren kısmı su banyosuna batırılır.
5. En az 15 dakika boyunca sıcak lipid çözeltisini sonicate edin. Su sıcaklığının 65 °C’de kaldığından emin olun. Çözelti tamamen net olana kadar 10-15 dakikalık aralıklarla sonicate devam edin (Şekil 2).
   NOT: Banyo sonicator mevcut değilse, çözüm net olana kadar% 10 güçte uç sonicated olabilir. Bununla birlikte, mikro uç daha hızlı yıpranır ve değiştirilmesi daha pahalıdır.

Şekil 2: Hidratlı lipit filmlerinin örneği. Tek-lameller vesikles oluşturmak için banyo sonication öncesi ve (B) hidratlı lipid filmi örneği. Banyo sonikasyonundan sonra, lipid çözeltisi daha opak bir çözeltiden yarı saydam çözeltiye kaymalıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

6. Hala sıcakken, kapağı çıkarın ve şişeyi sonicator’un ses geçirmez muhafazasına sıkıştırın, böylece sonicator’un mikro uç ataşmanı hava / sıvı arayüzünün hemen altına batırılır (Şekil 3).
7. Kafeinsizoraton tankını sonicator’un ses geçirmez muhafazasının yanına yerleştirin.
8. Bir buz banyosu hazırlayın ve ses geçirmez muhafazanın yanına yerleştirin. Bu daha sonra Adım 2.14’te kullanılacaktır.
9. Sonicator için güç anahtarını açın.
10. Sistem başladıktan sonra güç seviyesini %70 olarak ayarlayın. Mikro uç ataşmanı ile %70 genliği aşmayın. Sonicator’ı şu anda çalıştırmayın.
11. DFB tank çıkışındaki gazı muhafazada tutulan sıcak lipit çözeltisine yönlendirmek için uygun bir boru uzunluğu takın. Tüp, sonikasyon sırasında gazın kafa boşluğuna akmasını sağlamak için şişenin hemen boynuna yerleştirilmelidir (Şekil 3).
12. Lipid çözeltisi üzerinde gaz aktığı görülene kadar tank vanasını yavaşça açın. Bu, sıvının yüzeyinde hafif dalgalanmalara neden olur. Gaz akışı çok yüksekse, çözelti mikrobubble formülasyonu sırasında taşacaktır.
13. Sonicator’ı başlatın ve mikrobubbles oluşturmak için sürekli olarak 10 s boyunca çalıştırın. Kabarcık çözeltisi sonication sırasında taşmaya başlarsa, hemen sonicator durdurun.
14. Sonicator’ı kapatın ve DFB tank vanasını hemen kapatın.
15. Mikrobubble çözeltisini hızla kaplayın ve numuneyi 55 °C’nin (DSPC’nin cam geçiş sıcaklığı) altında soğutmak için şişeyi buz banyosuna batırın
16. Mikrobubble örneklerini ihtiyaç duyulana kadar buz banyosunda bırakın.

Şekil 3: Mikrobubble oluşumunu optimize etmek için prob ucunun lipid çözeltisine yerleştirilmesi. Probun ucunun cama temas etmesine izin vermemeye dikkat edin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Mikrobubble yoğuşması için ekstrüder hazırlama

1. Yüksek basınçlı ekstrüderi 200 nm seramik filtre (üreticiden temin edilir) kullanarak kullanım kılavuzunda ayrıntılı olarak belirtildiği şekilde monte edin.
2. Ekstrüderi su geçirmez bir kabın ortasına yerleştirin, böylece numune çıkış borusu yana bastırılır veya kıvrılmaz.
3. Ekstrüderi, üretici tarafından sağlanan adaptörü kullanarak azot gazı tankına birleştirir.
4. Ekstrüderin etrafındaki su geçirmez kapta 400 mL su ve 10 g sodyum klorür kullanarak -2 °C tuzlu buz banyosu yapın.
5. Ekstrüde numuneyi toplamak için çıkış tüpünün ucunu bir scintillation şişesine yerleştirin.
   NOT: Tüpü düz uzanmazsa veya şişenin içinde kalmazsa, kabı bantla sabitleyin.

4. Mikrobubble yoğuşması için ekstrüderin astarlanması

1. Ekstrüder içinde basınç olmadığından emin olmak için serbest bırakma vanasını açın ve kapatın.
2. Oda kapağını çıkarın ve ekstrüder odasına 5 mL 1x PBS ekleyin.
3. Kapağı, yerine güvenli bir şekilde tıklamasını sağlayarak değiştirin.
4. Azot gazı deposunu açın, böylece basınç göstergesi 250 psi okur. Basınç kontrol vanasının kapalı konumda olduğundan emin olun.
5. Gaz tankını kapatın ve ekstrüder odası giriş vanasını açın. PBS çözeltisi sistemden geçirilecek ve numune çıkış tüpünden scintillation şişesine itilecektir.
6. Borudan sadece gaz çıkarken, serbest bırakma vanasını açın ve basıncın 0 psi’ye düşmesini kesin.
7. Scintillation şişesini çıkarın.

5. Ekstrüzyon için ön soğutma mikrobubbles

1. Ekstrüder içinde basınç olmadığından emin olmak için serbest bırakma vanasını açın ve kapatın. Çıkış tüpünün ucuna yeni bir scintillation şişesi yerleştirin.
2. Çelik bir kabı 2 metil bütanla doldurun ve sıcaklığı -18 °C’ye düşürmek için kuru buz ekleyin.
3. Mikrobubble çözeltisini soğutulmuş 2 metil bütan içine yerleştirin, böylece numune 2 dakika boyunca batırılır. Kabarcıkları hafifçe karıştırmak için scintillation şişesini 2 dakika boyunca hareket ettirin. -15 ile -18 °C arasındaki sıcaklığı korumak için gerektiğinde kuru buz ekleyin. -20 ° C’yi geçmemeye dikkat edin, aksi taktir çözeltisi kabarcık örneğini dondurur ve yok eder.
   NOT: Adım 5.2 ve 5.3, kabarcık örneğini laboratuvar dondurucusunda daha uzun bir süre boyunca soğutarak da yapılabilir. Bununla birlikte, dondurucunun sıcaklığını dikkatlice izlemek ve numunenin donmasını önlemek için dikkatli olunmalıdır.
4. 2 dakika sonra, mikrobubbles soğutulmuş 2-metil bütan çıkarın, mikrobubbles karıştırmak için şişeyi hafifçe sallayın ve çözeltiyi ekstrüdere aktarmak için soğutulmuş 10 mL şırınga kullanın.
5. Ekstrüder hazne kapağını çıkarın ve pistonu şırınganın üzerine yavaşça iterek mikrobubble çözeltisini odaya ekleyin. Ekstrüder kapağını, yerine güvenli bir şekilde tıklatılarak değiştirin.
6. Basınç kontrol vanasının ve ekstrüderin serbest bırakma vanasının kapalı konumda olduğunu doğrulayın.
7. Basınç göstergesi 250 psi okuyana kadar azot gazı tankını açın, gaz tankını kapatın ve basınç kontrol vanasını açık konuma getirin.
8. Çözelti çıkış tüpünde scintillation şişesini doldurduğunda ve tüpten sadece gaz çıktığında, basınç tahliye vanasını yavaşça açın ve basıncın 0 psi’ye düşmesini kesin.
9. Scintillation şişesini saklamak için bir buz banyosuna veya buzdolabına yerleştirin.
10. Uzun süreli depolama ve spontan buharlaşmayı en aza indirmek için numuneyi standart bir dondurucuda saklayın. Numunenin donmasını önlemek için sıcaklığın -20 °C veya daha yüksek olduğundan emin olun (%20 PPG ve%20 Gliserol’ün eksiptif çözeltisi, numunenin çoğu laboratuvar dondurucusunda donmasını önleyecektir).

6. Damlacıkları lipozomlardan santrifüjleme ile ayırmak

1. Ekstrüde damlacık çözeltisinin 10 mL’lik kısmını 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.
2. Ekstrüde numuneyi 4 °C’de 10 dakika boyunca 1.500 x g’da santrifüj edin. Tüpün dibinde DFB nanodropletlerinden oluşan bir pelet belirgin olacaktır (Şekil 4). Çözeltinin üst kısmında kendiliğinden buharlaşan damlacıklar görünecektir ve atılmalıdır.

Şekil 4: Santrifüjlemeden sonra faz kaydırmalı DFB damlacıklarının peletleme örneği. DFB nanodroplets lipozomlardan daha yoğundur ve santrifüj tüpünün dibinde bir pelet (kırmızı kutu) içinde toplanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Süpernatant çıkarın ve peleti% 20 gliserol ve% 20 propilen glikol ile 2 mL 1x PBS’de yeniden atın.
4. Homojen bir çözelti elde etmek için tüpü hafifçe karıştırın ve damlacıkları daha küçük bir 2 mL santrifüj tüpüne aktarın.
5. Numuneyi 2 mL santrifüj tüpünde iki kez daha yıkayın.
6. Son yıkamadan sonra, peleti% 20 gliserol ve% 20 propilen glikol ile 100 μL 1x PBS’de yeniden depolayın ve ihtiyaç duyulana kadar buzda veya dondurucuda saklayın.

7. Damlacık buharlaşmasının mikroskopi doğrulaması

1. 7,5 μl 1x PBS’ye 2,5 μl konsantre damlacık ekleyerek seyreltilmiş bir damlacık çözeltisi yapın.
2. Seyreltilmiş numunenin 10 μl ile bir mikroskop slaytı hazırlayın. 40x hedefi kullanarak örneği gözlemleyin ve görüntüleri kaydedin.
3. Slaytı mikroskoptan çıkarın ve nano damlacıkları mikrobubbles içine buharlaştırmak için 1 dakika boyunca 65 °C ısı plakasına yerleştirin.
4. Damlacık buharlaşmasını doğrulamak için ısıttıktan sonra numuneyi gözlemlemek için aynı 40x hedefini kullanın.

Representative Results

Discussion

Vivo görüntüleme ve tedavi için mikrobubbles ve faz kaydırma damlacıklarının formülasyon, fizik ve potansiyel uygulamalarını tartışan kapsamlı bir literatür gövdesi mevcuttur. Bu tartışma açıkça lipid mikrobubbles üretmek ve düşük kaynama noktası DFB gaz ve yüksek basınç ekstrüzyon kullanarak mikron altı faz kaydırma damlacıkları dönüştürmekle ilgili. Burada özetlenen yöntem, önceki mikrobubble yoğuşma yöntemlerini tek bir adımda damlacık ekstrüzyonu ile birleştirerek büyük miktarlarda lipid mikrobubbles ve DFB faz kaydırma damlacıkları üretmek için nispeten basit bir yöntem sağlamayı amaçlamıştır. Bu yöntem, filtre seçimine dayalı dar boyut dağılımlarına sahip DFB damlacıkları oluşturmak için kullanılan yüksek konsantrasyonlarda kabarcıklar üretme avantajına sahiptir. Elde eden tutarlı numune buharlaştırma eşikleri nedeniyle dar boyut dağılımı önemlidir. Bu yöntem, dar boyutlu bir dağıtım oluşturmak için kullanılan diğer yaygın yöntemlerden daha basit ve daha az maliyetlidir. Ayrıca, potansiyel çözüm hacmi diğer karşılaştırılabilir yöntemlerden daha büyüktür. Protokol üç ana kategoriye ayrılabilir: (1) Lipid mikrobubbles üretmek, (2) Yoğuşma ve ekstrüde mikrobubbles, (3) Faz kayması damlacıklarını lipozomlardan santrifüjleme ile ayırmak.

Prob ucu sonikasyonu kullanarak mikrobubble üretimi lipid mikrobubbles yapmanın en yaygın yollarından biridir. Bu yordamı açıklayan birçok yayın vardır. Bu protokol Feshitan ve ^ark.11’den uyarlanmıştır ve tezgah üstü ekstrüderin maksimum kapasitesi olan 10 mL mikrobubble çözeltisi yapmak için optimize edilmiştir. Bu yöntem ayrıca, Feshitan ^{ve al11} tarafından gösterildiği gibi, mikro uç ataşmanını çıkararak ve lipid çözelti hacmini 100 mL veya daha fazlasına çıkararak daha büyük hacimlerde lipid mikrobubbles çözeltisi üretmek için ölçeklendirilebilir. Aynı şekilde, 100 mL’den 800 mL’ye kadar hacimleri barındıran daha büyük ticari ölçekli ekstrüderler, artan mikrobubble hacimlerini karşılamak için kullanılabilir, böylece damlacık üretimini en üst düzeye çıkarır. Yöntemin sonuçları yalnızca kullanılan ekipmanla sınırlıdır ve bu da hacmi buna göre artırmak için değiştirilebilir. Boyut filtreli damlacık üretimi, daha düzgün buharlaşma eşikleri nedeniyle çeşitli uygulamalar için faydalıdır. Antikor yükleme ve moleküler hedefleme için mikrobubble ve damlacık kabuklarının işlevselleştirilmesi gibi belirli ihtiyaçlar için sonuçları bireyselleştirmek için protokolde gelecekteki değişiklikler yapılabilir.

Burada kullanılan ekstrüzyon yöntemi genellikle monodispersed lipozom preparatı için kullanılır. Benzer bir yöntem geçmişte daha yüksek kaynama noktası DDFP damlacıkları17 kullanarak faz kaydırma damlacıkları üretmek için de kullanılmıştır. Bu tarif edilen metodolojide bazı kritik farklılıklar vardır, yani (1) düşük kaynayan nokta gazları (DFB) ile önceden biçimlendirilmiş mikrobubbles üretmek, (2) kabarcık çözeltisini ve ekstrüder sistemini verimli bir şekilde oluşturmak için soğutmak ve (3) damlacık yoğuşma verimliliğini en üst düzeye çıkarmak ve kabarcık gazının dağılmasını önlemek için basıncın hızlı ^{uygulanması10}.

Mikrobubble örneğinin ekstrüzyon için soğutulmak, yüksek konsantrasyonlarda stabil DFB damlacıkları üretmede kritik bir adımdır. Bu protokolde, tüm ekstrüder buz banyosu içeren bir tuza yerleştirilir ve -2 ° C’de tutulur. Ekstrüder, daha verimli ve daha hızlı soğutma sağlamak için sirkülasyon sıvısı için giriş ve çıkış bağlantı noktalarına sahiptir ve sirkülasyon pompası gerektirir. DFB damlacık üretimi için, sirkülasyonlu bir su sistemi olmadan yüksek konsantrasyonlarda damlacıklar (^1011-1012 damlacık/mL) üretilebilir. Bununla birlikte, damlacık üretim verimliliğinin soğuk dolaşan bir banyo dahil edilerek daha da iyileştirilerek soğutma için bekleme süresinin azaltılması beklenebilir. Bu tam protokol OFP mikrobubbles için de kullanılmıştır. İlginçtir ki, OFP kabarcıkları mikroskopi kullanılarak gözlendiğinde daha çok sayıda ve daha küçük görünüyordu (Şekil 9), ancak peleti yıkadıktan ve topladıktan sonra damlacıkların verimi belirgin şekilde daha azdır. Ekstrüderin daha da soğutularak azot tankından gelen basıncın arttırılması, OFP damlacık üretimini büyük olasılıkla artıracaktır. OFP damlacıkları da oldukça kararsızdır ve spontan buharlaşmayı en aza indirmek için nazik kullanım ve uygun depolama koşulları gerektirir.

Basıncın hızlı uygulanması bu prosedürdeki bir diğer kritik adımdır. Bu protokolde ekstrüzyon kullanmak, basıncın birikmesine ve bu basıncın ekstrüder odasındaki mikrobubbles’a anında uygulanmasına bağlıdır. Standart lipid ekstrüzyon protokollerinde, numune membran filtresinden geçmeye başlayana kadar basınç yavaşça artar. Deneysel gözlemler, basıncın yavaş uygulanmasının kabarcıkların damlacıklara yoğunlaşması yerine kabarcık çekirdeğinden gaz çözünmesine yol açabileceğini gösterdi. Bu nedenle, ekstrüder giriş tüplerinin gaz giriş vanası kapatılarak ve tank basıncı 250 psi olarak ayarlanarak azot gazı ile “astarlanmasına” karar verildi. Daha sonra giriş vanasını ekstrüdere açmadan önce tank kapatılmalıdır. Prosedürün bu kısmının takip edilmemesi, ekstrüderin çıkışından hızlı bir şekilde atılmasına ve numune kaybına neden olacaktır. 250 psi’den yüksek basınçlar, tank düzgün bir şekilde kapatıldığında bile numunenin hızlı bir şekilde atılması nedeniyle numune kaybına neden olabilir. Hazırlarken, adımları tamamlarken veya ekstrüderi herhangi bir şekilde kullanırken, basınç göstergelerini ve valfleri kontrol etmeye özen edilmelidir. Basınç sıfıra düşmezse veya çözelti beklendiği gibi ekstrüderden çıkmazsa, önce tüm vanaların uygun konumda olup olmadığını kontrol edin; basınç tahliye vanası, oda içeriğini etkilemeden basıncı serbest bırakmak için her zaman açılabilir. Ekstrüdere basınç uygulandığında gazdan kaçışı dinlemek ve basınç göstergelerini izlemek de önemlidir. Genellikle, basınç uygulanırsa, çözelti çıkış tüpünden çıkmaya başlar veya sistemde bir sızıntı olur. Odaya bir mikrobubble çözeltisi eklemeden önce ekstrüderin doğru şekilde monte edilmesini sağlamak için her zaman sistemi astarladığından emin olun. Zamanla O-halkaları aşınabilir ve sistemin doğru şekilde sızdırmazlık yapmasını önleyebilir. En iyi sonuçları elde şekilde elde edersiniz ve tüm parçaların düzgün çalıştığından ve sıkı bir conta oluşturulduğundan emin olun. Burada özetlenen protokolde sadece tek bir ekstrüzyon gerçekleştirildi. Damlacık örneğini ekstrüder içine yeniden sokarak ve birden fazla ekstrüzyon adımı gerçekleştirerek (genellikle 5 ila 10 arasında) boyut dağılımını daha da daraltmak mümkündür. Çoklu ekstrüzyon muhtemelen damlacıkların toplam verimini azaltacaktır. DLS ve TRSP’den gelen boyut dağılımları göz önüne alındığında, çoğu uygulama için tek bir ekstrüzyon muhtemelen yeterlidir. Son olarak, bu protokol 200 nm filtreler için en iyi duruma getirilmiştir. Basınçların daha büyük veya daha küçük filtre boyutları için optimize edilmesi gerekir.

Örnek başarıyla ekstrüde edildikten sonra, kabarcıkların damlacıklara düzgün bir şekilde yoğunlaşıp yoğunlaşmadığını kontrol etmek için test edilmelidir. Alt deri damlacıkları standart ışık görüntüleme teknikleri kullanılarak görünmez, bu nedenle daha görünür hale gelmek için önce buharlaştırılmaları ^gerekir6. Mikrobubbles yokluğunu doğrulamak veya damlacıkları ısıtmadan önce spontan buharlaşma seviyesini belirlemek için buharlaşmadan önce numuneyi görüntülemek hala önemlidir. Görüntüleme yazılımı, nanodropletler hakkında dolaylı olarak veri sağlamak için görüntüdeki mikrobubbles’ı saymak ve boyutlandırmak için kullanılabilir. Bununla birlikte, buharlaşmayı takiben, kabarcıkların ısınma sırasında hızla birleşeceği belirtilmelidir. Bu nedenle, kabarcık boyutu ve mikroskopi analizinden elde edilen sayımlar muhtemelen ilk damlacık boyutlarını ve konsantrasyonlarını yansıtmaz. Damlacık dağılımının ve konsantrasyonunun doğrudan ölçümleri, varsa ayarlanabilir dirençli darbe algılama (TRPS) kullanılarak en iyi şekilde gerçekleştirilir. TRSP’den temsili damlacık dağıtım verileri sağlanmıştır (Şekil 6).

Materials

15 mL Centrifuge Tubes	Falcon	352095	Collecting and centrifuging droplets
200 nm polycarbonate filter	Whatman	110606	Extruder filters
2-methylbutane	Fisher Chemical	03551-4	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion
3-prong clamps X2	Fisher	02-217-002	Holding scintilation vials in place for probe tip sonication
400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn	Branson	101-063-198R	Used to generate lipid microbubbles from lipid solution
Bath Sonicator	Fisher Scientific	15337402	Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles
Chloroform	Fisher Bioreagents	C298-4	Used to make lipid film for microbubble preperation
Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas	FluoroMed L.P.	1 kg	generating microbubbles via probe tip sonication
Dry Ice	–	–	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion
DSPC Lipid Powder	NOF America	COATSOME MC-8080	Component of lipid film
DSPE-PEG-2K Lipid Powder	NOF America	SUNBRIGHT DSPE-020CN	Component of lipid film
General Thermometer	–	–	Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures)
Glass Syringes	Hamilton	81139	Used to mix lipids in chloroform
Glycerol	Fisher Bioreagents	BP229-1	Reduces freezing temperature of PBS solution
Heating Block	VWR Scientific Products		Heating lipid films and vaporizing droplets
Lipex 10 mL Extruder	Evonik		Commercial high-pressure extrusion system
Mini Vortex Mixer	Fisher brand	14-955-151	Used to remove excess chloroform from lipid films
Nitrogen Tank	–	–	Used to operate extruder
Phosphate Buffer Saline	Fisher Scientific		Hydrate lipid films and washing droplets
Polyester Drain Disk	Whatman	230600	Provides support for polycarbonate filter
Polypropylene Caps	Fisher Scientific	298417	Used for solution storage
Propylene Glycol	Fisher Chemical	P355-1	Reduces freezing temperature of PBS solution
Scintiliation Vials	DWK Life Sciences Wheaton	986532	Used for lipid films and microbubble generation
Small hammer	–	–	Used to break apart dry ice for cooling methylbutane
Sonicator Microtip Attachment	Branson	101148070	Used to generate microbubbles from lipid solution
Steel Container	Medegen	79310	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work)
Vacuume Dessicator	Bel-Art SP Scienceware	08-648-100	Removes excess chloroform from lipid films
2mL Centrifuge Tube	Fisher	02682004	Used for concentrating nanodroplets