Method Article

Kolon Mukozasındaki Mikro Epitel Boşluklarının İmmünofloresan Boyama Kullanılarak Değerlendirilmesi ve Miktar Tayini

DOI:

10.3791/62204

⸱

June 11th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Fisiología, Biofísica y Neurociencias del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), 2Departamento de Biomedicina Molecular, del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), 3Unidad de Investigación Epidemiológica en Endocrinología, y Nutrición (UIEEN), Hospital Infantil de México Federico Gomez, 4Laboratorio de Investigación en Inmunología y Proteómica, Hospital Infantil de México Federico Gómez

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, iltihaplı kolon mukozasında transselüler ve paraselüler geçirgenliğin arttığı spesifik konumu görselleştirmek için yeni bir yöntem açıklıyoruz. Bu tahlilde, kolon mukozasındaki yüksek geçirgenlik bölgelerini (HPR) görselleştirmek için lizin ile sabitlenebilir bir dekstrana konjuge edilmiş 10 kDa'lık bir floresan boya uyguluyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağırsak mukozasını kaplayan epitel hücreleri, luminal içeriği interstisyumdan ayıran fiziksel bir bariyer oluşturur. Epitel bariyer bozukluğu, inflamatuar barsak hastalıkları (IBD) gibi çeşitli patolojilerin gelişimi ile ilişkilendirilmiştir. İltihaplı mukozada, epitel tek tabakalarını bozan yüzeysel erozyonlar veya mikro erozyonlar, yüksek geçirgenliğe sahip bölgelere karşılık gelir. Hücre dökülmesi ve apoptoz dahil olmak üzere mikro erozyonların oluşumunda çeşitli mekanizmalar rol oynamaktadır. Bu mikro erozyonlar genellikle kolonda rastgele dağılmış mikroskobik epitel boşluklarını temsil eder. Bu epitel boşluklarının görselleştirilmesi ve ölçülmesi, bağırsak epitel bariyeri fonksiyonunu araştırmak için önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Burada, iltihaplı kolon mukozasında transselüler ve paraselüler geçirgenliğin arttığı spesifik konumu görselleştirmek için yeni bir yöntem açıklıyoruz. Bu tahlilde, kolon mukozasındaki yüksek geçirgenlik bölgelerini (HPR) görselleştirmek için lizin ile sabitlenebilir bir dekstrana konjuge edilmiş 10 kDa'lık bir floresan boya uyguluyoruz. Hücre ölümü belirteçlerinin ek kullanımı, HPR'nin epitelyal ekstrüzyon / dökülmenin meydana geldiği apoptotik odakları kapsadığını ortaya koydu. Burada açıklanan protokol, bağırsak epitel bariyerinin tehlikeye atıldığı hastalık modellerinde çok yararlı bir araç olan bağırsaktaki mikro erozyonları görselleştirmek ve ölçmek için basit ama etkili bir yaklaşım sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gastrointestinal (GI) mukoza, hücre dışı ortamı ve iç konak ortamını ayıran fiziksel bir bariyer oluşturur ve besinlerin, suyun ve elektrolitlerin emilmesinde rol oynar. Bağırsak bariyeri, glikoproteinlerden oluşan bir mukus tabakasını, epitel hücrelerinin bir monotabakasını kapsar ve alttaki lamina propria, bağışıklık ve stromal hücreler bulunur. Fiziksel bariyeri oluşturan bağırsak epitel hücreleri, adherens bileşkesi (AJ), sıkı bileşke (TJ) ve desmozomları (DM'ler) içeren farklı protein kompleksleri ile birbirine bağlanır. Epitel bariyer fonksiyonundaki bozulma bağırsak geçirgenliğini arttırır ve zararlı maddelerin ve patojenlerin ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm prosedürler CINVESTAV Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kurumsal Komitesi (CICUAL) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Malzemelerin ve reaktiflerin hazırlanması

  1. Hartmann çözeltisini (130 mM NaCl, 28 mM laktat, 4 mM KCl, 1.5 mM CaCl2) %95 O2/5% CO2 ile köpürürken 37 ° C'ye önceden ısıtın. Çözelti için fizyolojik pH'ı (7.4) koruyun.
  2. Pasif paraselüler geçirgenliği analiz etmek için, önceden ısıtılmış Hartmann çözeltisinde 1 mg / mL FITC-Dekstran (4 kDa) ve 1 mg / mL RITC-Dekstran (10 kDa) çözerek bir çalışma çözeltisi hazırlay....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İltihaplı mukozada, yüzeysel erozyonlar veya mikro erozyonlar epitel hücresi tek tabakasının bütünlüğünü tehlikeye atar ve yüksek geçirgenliğe sahip bölgeleri temsil eder 7,8. Bu tür olasılıkları değerlendirmek için, bir dekstran sodyum sülfat kolit murin modelinde iltihaplı kolon mukozasındaki pasif geçirgenliği analiz ettik. Kısaca, 5 gün boyunca, C57BL / 6J fareleri, içme suyunda çözünmüş %2.5 DSS (w/v, 40-50 kDa) aldı. Bu model, kalın bağırsakta epitel hücre .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre proliferasyonunun dengelenmesi ve epitelyal apoptozdan kaynaklanan epitelyal homeostaz, uygun ve fonksiyonel bir bağırsak bariyerini korur. IBD gibi birçok klinik bozukluğa, bağırsak geçirgenliğinde değişiklikler, mukozanın iltihaplanması ve epitel homeostazının bozulması eşlik eder veya karakterize edilir1. Bu süreçler arasındaki etkileşim hala oldukça tartışmalıdır. Bu nedenle, bu süreçleri doğru bir şekilde araştırmak için yeni araştırma yaklaşımlarının g.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Araştırma kısmen SEP-Conacyt hibesi (No.179'dan NV/PND'ye) tarafından desteklenmiş ve Conacyt'ten Temel Bilimler hibesi (No. A1-S-20887'den PND'ye) yoluyla araştırma ve eğitim için sektörel finansman tarafından desteklenmiştir. Norma Trejo, M.V.Z. Raúl Castro Luna, M.C. Leonel Martínez, Felipe Cruz Martínez, Victor Manuel García Gómez ve M.V.Z. Ricardo Gaxiola Centeno'ya yardımları ve teknik yardımları için şükranlarımızı sunarız.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Aktif Kaspaz-3 antikoru (1:1000)Hücre sinyalizasyonu9664Bölünmüş kaspaz-3 (Asp175)(5AE1) Tavşan mAb
Alexa Fluor 488  anti tavşan (1:1000)InvitrogenA21206
Alexa Fluor 594 anti sıçan (1:1000)InvitrogenA21209
Konfokal mikroskop (Leica TCS SP8x)LeicaHyD dedektörleri  ve Beyaz Işık Lazeri
E-Cadherin antikoru (1:750)SigmaMABT26Sıçan monoklonal Delma-1 antikoru
Etanol %70Jenerik
Sabitlenebilir-DekstranInvitrogenD22914Dekstran, Alexa Fluor, 10.000 MW, anyonik, sabitlenebilir
FITC DextranSigma46944Floresein izotiyosiyanat– dextran M. Wt. 4 kDa
Hartmann'ın ÇözümüPiSAHT PiSA
İnkübatör (AutoFlow NU-8500)Nuaire
Mikroplaka okuyucu (Tecan Infinite 200 PRO)Tecan
Nunc F96 MicroWell Siyah Beyaz Polistiren PlakaThermoFisher Scientific
ParaformaldehitSigmaP6148
Phalloidin (1:1000)İnvitrojenA12380Alexa Fluor 568 Phalloidin
RITC DextranSigmaR8881-100MGRodamin B İzotiyosiyanat-Dekstran. M. Wt. 10 kDa
İkincil antikorlar (1:10000)Jackson ImmunoResearch LaboratoriesHRP ile konjuge sekonder antikorlar
Sütür iplikleriJenerikÖrgülü ipek ve örgülü polyester Cerrahi dikişler tercih edilir.
ZO-1 (1:1000)İnvitrojen40-2200Rb anti-ZO-1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. König, J., et al. Human Intestinal Barrier Function in Health and Disease. Clinical and Translational Gastroenterology. 7 (10), 196(2016).
  2. Gassler, N., et al. Inflammatory bowel d....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epithelial GapsColonic MucosaImmunofluorescence StainingEpithelial BarrierMicro ErosionsIntestinal PermeabilityCell SheddingApoptotic FociFluorescent DyeBarrier Function
Video Coming Soon

Related Articles