Method Article

Kolon Mukozasındaki Mikro Epitel Boşluklarının İmmünofloresan Boyama Kullanılarak Değerlendirilmesi ve Miktar Tayini

DOI:

10.3791/62204

⸱

June 11th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Fisiología, Biofísica y Neurociencias del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), 2Departamento de Biomedicina Molecular, del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), 3Unidad de Investigación Epidemiológica en Endocrinología, y Nutrición (UIEEN), Hospital Infantil de México Federico Gomez, 4Laboratorio de Investigación en Inmunología y Proteómica, Hospital Infantil de México Federico Gómez

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, iltihaplı kolon mukozasında transselüler ve paraselüler geçirgenliğin arttığı spesifik konumu görselleştirmek için yeni bir yöntem açıklıyoruz. Bu tahlilde, kolon mukozasındaki yüksek geçirgenlik bölgelerini (HPR) görselleştirmek için lizin ile sabitlenebilir bir dekstrana konjuge edilmiş 10 kDa'lık bir floresan boya uyguluyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağırsak mukozasını kaplayan epitel hücreleri, luminal içeriği interstisyumdan ayıran fiziksel bir bariyer oluşturur. Epitel bariyer bozukluğu, inflamatuar barsak hastalıkları (IBD) gibi çeşitli patolojilerin gelişimi ile ilişkilendirilmiştir. İltihaplı mukozada, epitel tek tabakalarını bozan yüzeysel erozyonlar veya mikro erozyonlar, yüksek geçirgenliğe sahip bölgelere karşılık gelir. Hücre dökülmesi ve apoptoz dahil olmak üzere mikro erozyonların oluşumunda çeşitli mekanizmalar rol oynamaktadır. Bu mikro erozyonlar genellikle kolonda rastgele dağılmış mikroskobik epitel boşluklarını temsil eder. Bu epitel boşluklarının görselleştirilmesi ve ölçülmesi, bağırsak epitel bariyeri fonksiyonunu araştırmak için önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Burada, iltihaplı kolon mukozasında transselüler ve paraselüler geçirgenliğin arttığı spesifik konumu görselleştirmek için yeni bir yöntem açıklıyoruz. Bu tahlilde, kolon mukozasındaki yüksek geçirgenlik bölgelerini (HPR) görselleştirmek için lizin ile sabitlenebilir bir dekstrana konjuge edilmiş 10 kDa'lık bir floresan boya uyguluyoruz. Hücre ölümü belirteçlerinin ek kullanımı, HPR'nin epitelyal ekstrüzyon / dökülmenin meydana geldiği apoptotik odakları kapsadığını ortaya koydu. Burada açıklanan protokol, bağırsak epitel bariyerinin tehlikeye atıldığı hastalık modellerinde çok yararlı bir araç olan bağırsaktaki mikro erozyonları görselleştirmek ve ölçmek için basit ama etkili bir yaklaşım sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gastrointestinal (GI) mukoza, hücre dışı ortamı ve iç konak ortamını ayıran fiziksel bir bariyer oluşturur ve besinlerin, suyun ve elektrolitlerin emilmesinde rol oynar. Bağırsak bariyeri, glikoproteinlerden oluşan bir mukus tabakasını, epitel hücrelerinin bir monotabakasını kapsar ve alttaki lamina propria, bağışıklık ve stromal hücreler bulunur. Fiziksel bariyeri oluşturan bağırsak epitel hücreleri, adherens bileşkesi (AJ), sıkı bileşke (TJ) ve desmozomları (DM'ler) içeren farklı protein kompleksleri ile birbirine bağlanır. Epitel bariyer fonksiyonundaki bozulma bağırsak geçirgenliğini arttırır ve zararlı maddelerin ve patojenlerin lümenden interstisyuma1 translokasyonuna izin verir. Crohn hastalığı (CH), ülseratif kolit (UC) ve belirsiz kolit (IC) gibi inflamatuar bağırsak hastalıkları (IBD) gibi epitel bariyerinin tehlikeye girdiği artan sayıda hastalık vardır. IBD insidansı dünya çapında artmakta olup, Batı'da prevalansı %0,5'e yaklaşmaktadır. IBD'nin nedenleri belirsiz olsa da, bağırsak duvarında tetiklenen aşırı immün/inflamatuar yanıt, bağırsak epitel homeostazının yeniden kurulmasını sınırlayarak epitel bariyerinin bozulmasına doğrudan katkıda bulunur 2,3,4. Ek olarak, uzun süredir devam eden kolon iltihabı olan hastalar kolorektal kanser (KRK) geliştirme riski yüksektir5. Bağırsak epitel bariyeri bozulması ile ilişkili diğer patolojiler irritabl bağırsak sendromu, obezite, çölyak hastalığı, çölyak dışı glüten duyarlılığı ve gıda alerjileridir6. Bu nedenlerden dolayı, insanlarda meydana gelen patogenezi taklit eden hayvan modellerinde bağırsak epitel bariyerinin bütünlüğünün analizine izin veren deneysel yaklaşımların geliştirilmesine acil bir ihtiyaç vardır.

Burada, kolon epitelinde inflamatuar bir süreçle ilişkili gastrointestinal pasif parasellüler ve transsellüler geçirgenliği basit bir teknik kullanarak değerlendirdik. Makromoleküllerin transmural akışını araştırmak için, FITC-dekstran (4 kDa) ve RITC-dekstran'ın (10 kDa) ex vivo kolonik keselerde pasif difüzyonunu ölçtük. Ayrıca, bağırsak keselerinin lümenine floresan 10 kDa lizin ile sabitlenebilir bir dekstran enjekte ederek, iltihaplı mukozada yüksek geçirgenliğe sahip alanları özel olarak belirledik. Apoptoz belirteçlerinin ve AJ proteinlerine karşı antikorların kullanılması, iltihaplı mukozadaki yüksek geçirgenlik alanlarının, epitel hücrelerinin apoptoza uğradığı ve hücre-hücre bağlantılarının bozulduğu spesifik bölgelere karşılık geldiğini göstermemizi sağladı. Bu yeni teknik, bağırsak epitel bariyerinin tehlikeye girdiği herhangi bir modelde epitelin bütünlüğünü değerlendirmek için kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm prosedürler CINVESTAV Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kurumsal Komitesi (CICUAL) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Malzemelerin ve reaktiflerin hazırlanması

  1. Hartmann çözeltisini (130 mM NaCl, 28 mM laktat, 4 mM KCl, 1.5 mM CaCl2) %95 O2/5% CO2 ile köpürürken 37 ° C'ye önceden ısıtın. Çözelti için fizyolojik pH'ı (7.4) koruyun.
  2. Pasif paraselüler geçirgenliği analiz etmek için, önceden ısıtılmış Hartmann çözeltisinde 1 mg / mL FITC-Dekstran (4 kDa) ve 1 mg / mL RITC-Dekstran (10 kDa) çözerek bir çalışma çözeltisi hazırlayın.
  3. Hartmann'ın çözeltisinde 4 μg/mL'lik bir Alexa Fluor647 Fixable-Dextran (10 kDa) çözeltisi hazırlayın. Çalışma solüsyonlarını 15 mL'lik konik bir tüpte saklayın ve kullanana kadar ışıktan koruyun.
    NOT: Kolon başına 300 μL çalışma çözeltisi gerekli olacaktır.
  4. Her kalın bağırsak için 5 cm'lik iki bölüm keserek cerrahi bir dikiş hazırlayın. Dikişleri kapatılmamış bir düğüm haline getirin.

2. Gastrointestinal trakın diseksiyonu ve hazırlanması

  1. Farelere ötenazi yapmadan önce katı yiyecekleri 6 saat boyunca saklayın. Ad libitum içme suyu sağlayın.
    NOT: Mümkünse, fareleri besleyici jel takviyeleri (arıtılmış Su, Pekmez, Balkabağı, Mısır Şurubu, Ayçiçeği Çekirdeği, Buğday Proteini, Bitkisel Yağ, Gıda Asidi, Hidrokolloidler, Elektrolitler, Mısır Lifi, NIH-31M Mineral Karışımı, NIH-31M Vitamin Karışımı) üzerine yerleştirin.
  2. Fareleri bir CO2 odasında ötenazi yapın ve ardından kurumsal etik protokollere uygun olarak servikal çıkık yapın.
  3. Karın ve göğüs kafesini% 70 etanol ile sterilize edin.
  4. Bir makas kullanarak, karnın ortasında bir kesi yapın ve periton boşluğunu ortaya çıkarın.
  5. Oryantasyon amacıyla, ince bağırsağın ucundan (ileumun uç kısmı) çekumdan hemen önce ve ardından anal kenarda keserek kalın bağırsağı ayırın ve inceleyin. Mezenteri nazikçe çıkarmak için cerrahi forseps kullanın ve kolonu Hartmann'ın solüsyonuna yerleştirin.
  6. Daha da önemlisi, hayvanlar arasındaki tutarlılığı korumak için benzer bölümleri tanımlayın ve geçirgenliği değerlendirmek için kullanın. Çekuma yakın bölgelerin kullanılması şiddetle tavsiye edilir.
  7. Kolonda bulunan luminal içeriği nazikçe yıkamak için körelmiş bir plastik kanül ile donatılmış bir insülin şırıngası kullanın. Dışkı sertse, künt forseps yardımıyla dikkatlice itin. Dışkı çıkarıldıktan sonra, 400 μL Hartmann solüsyonu ile 3 kez yıkayın.
  8. Proksimal bölgeyi (çekuma en yakın olanı) bağlayın ve kolonun distal bölgesine önceden bağlanmış bir dikiş halkası yerleştirin. Körelmiş bir plastik kanül ile donatılmış bir şırınga yardımıyla, bağırsak kesesini arzu probunu içeren solüsyonla doldurun. Plastik kanülü dikkatlice çıkarın ve halkayı distal bölgeye bağlayın.
  9. Bağırsak kesesini 6 mL Hartmann çözeltisi ile 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin ve FITC / RITC-Dextran'in pasif paraselüler akışını değerlendirmek için 1 saat veya Alexa Fluor Fixable-Dextran'in akışını analiz etmek için 30 dakika inkübe edin.
    1. Bağırsak keseciklerini içeren konik tüpleri 37 °C'de %5 CO2 ile muhafaza ediniz ve ışıktan koruyunuz.
  10. FITC/RITC-Dextran kullanarak pasif geçirgenliği ölçmek için. 0 ve 60 dakikada, konik tüpten 100 μL'lik bir numune alın ve 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Kaybedilen hacmi yerine koymak için 100 μL taze ortam ekleyin.
  11. Bir floresan plaka okuyucusunda FITC/RITC için numuneleri ve standartları ölçün (FITC uyarma/emisyon: 495 nm/519 nm; RITC uyarma / emisyon: 570/595 nm).
  12. Alexa Fluor 647 Fixable-Dextran kullanarak pasif geçirgenliği ölçmek için, bağırsakları çıkarın, cerrahi bağ düğümüne yakın kesin ve prob ile çözeltiyi çıkarmak için lümeni açığa çıkarmak için bağırsağı kesin. Bağırsağın lümenini 2 kez soğuk Hartmann solüsyonu ile yıkayın.
  13. Dokuyu daha önce Optimal Kesme Sıcaklığı bileşiği (OCT) ile doldurulmuş bir doku kalıbına yerleştirin. Dokuyu kesitlenecek tarafa göre dikey veya yatay olarak yönlendirin. Numuneleri -80 °C'de saklayın.

3. İmmünofloresan boyama

  1. 20 mikrometrenin donmuş kısımlarını oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 3.7 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin ve ardından soğuk fosfat tamponlu salin (PBS; 37 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 ve 1.8 mM KH2 PO4) ile 3 kez yıkayın.
    NOT: Yıkamalar çok güçlüyse bağırsaklardan gelen dikey bölümler çıkma eğilimindedir.
  2. Oda sıcaklığında 12 dakika boyunca% 0.2 TX-100 / PBS ile geçirgen hale getirin ve ardından soğuk PBS ile 3 kez yıkayın.
  3. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 0.2 BSA / PBS ile bloke edin.
  4. Birincil antikoru bloke edici çözelti içinde seyreltin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Soğuk PBS ile 3 kez yıkayın.
  5. Bloke edici çözeltide ikincil antikorlarla 1 saat inkübe edin. Soğuk PBS ile 3 kez yıkayın.
  6. Kesiklere montaj ortamı uygulayın ve bir lamel ile kapatın. Slaytlar -20 °C'de 3 aya kadar saklanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İltihaplı mukozada, yüzeysel erozyonlar veya mikro erozyonlar epitel hücresi tek tabakasının bütünlüğünü tehlikeye atar ve yüksek geçirgenliğe sahip bölgeleri temsil eder 7,8. Bu tür olasılıkları değerlendirmek için, bir dekstran sodyum sülfat kolit murin modelinde iltihaplı kolon mukozasındaki pasif geçirgenliği analiz ettik. Kısaca, 5 gün boyunca, C57BL / 6J fareleri, içme suyunda çözünmüş %2.5 DSS (w/v, 40-50 kDa) aldı. Bu model, kalın bağırsakta epitel hücre ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre proliferasyonunun dengelenmesi ve epitelyal apoptozdan kaynaklanan epitelyal homeostaz, uygun ve fonksiyonel bir bağırsak bariyerini korur. IBD gibi birçok klinik bozukluğa, bağırsak geçirgenliğinde değişiklikler, mukozanın iltihaplanması ve epitel homeostazının bozulması eşlik eder veya karakterize edilir1. Bu süreçler arasındaki etkileşim hala oldukça tartışmalıdır. Bu nedenle, bu süreçleri doğru bir şekilde araştırmak için yeni araştırma yaklaşımlarının g...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Araştırma kısmen SEP-Conacyt hibesi (No.179'dan NV/PND'ye) tarafından desteklenmiş ve Conacyt'ten Temel Bilimler hibesi (No. A1-S-20887'den PND'ye) yoluyla araştırma ve eğitim için sektörel finansman tarafından desteklenmiştir. Norma Trejo, M.V.Z. Raúl Castro Luna, M.C. Leonel Martínez, Felipe Cruz Martínez, Victor Manuel García Gómez ve M.V.Z. Ricardo Gaxiola Centeno'ya yardımları ve teknik yardımları için şükranlarımızı sunarız.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Aktif Kaspaz-3 antikoru (1:1000)Hücre sinyalizasyonu9664Bölünmüş kaspaz-3 (Asp175)(5AE1) Tavşan mAb
Alexa Fluor 488  anti tavşan (1:1000)InvitrogenA21206
Alexa Fluor 594 anti sıçan (1:1000)InvitrogenA21209
Konfokal mikroskop (Leica TCS SP8x)LeicaHyD dedektörleri  ve Beyaz Işık Lazeri
E-Cadherin antikoru (1:750)SigmaMABT26Sıçan monoklonal Delma-1 antikoru
Etanol %70Jenerik
Sabitlenebilir-DekstranInvitrogenD22914Dekstran, Alexa Fluor, 10.000 MW, anyonik, sabitlenebilir
FITC DextranSigma46944Floresein izotiyosiyanat– dextran M. Wt. 4 kDa
Hartmann'ın ÇözümüPiSAHT PiSA
İnkübatör (AutoFlow NU-8500)Nuaire
Mikroplaka okuyucu (Tecan Infinite 200 PRO)Tecan
Nunc F96 MicroWell Siyah Beyaz Polistiren PlakaThermoFisher Scientific
ParaformaldehitSigmaP6148
Phalloidin (1:1000)İnvitrojenA12380Alexa Fluor 568 Phalloidin
RITC DextranSigmaR8881-100MGRodamin B İzotiyosiyanat-Dekstran. M. Wt. 10 kDa
İkincil antikorlar (1:10000)Jackson ImmunoResearch LaboratoriesHRP ile konjuge sekonder antikorlar
Sütür iplikleriJenerikÖrgülü ipek ve örgülü polyester Cerrahi dikişler tercih edilir.
ZO-1 (1:1000)İnvitrojen40-2200Rb anti-ZO-1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. König, J., et al. Human Intestinal Barrier Function in Health and Disease. Clinical and Translational Gastroenterology. 7 (10), 196(2016).
  2. Gassler, N., et al. Inflammatory bowel disease is associated with changes of enterocytic junctions. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 281 (1), 216-228 (2001).
  3. Negroni, A., Cucchiara, S., Stronati, L. Apoptosis, Necrosis, and Necroptosis in the Gut and Intestinal Homeostasis. Mediators of Inflammation. 2015, 250762(2015).
  4. Nava, P., et al. Interferon-γ regulates intestinal epithelial homeostasis through converging β-catenin signaling pathways. Immunity. 32 (3), 392-402 (2010).
  5. Choi, C. -H. R., Bakir, I. A., Hart, A. L., Graham, T. A. Clonal evolution of colorectal cancer in IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (4), 218-229 (2017).
  6. González-González, M., Díaz-Zepeda, C., Eyzaguirre-Velásquez, J., González-Arancibia, C., Bravo, J. A., Julio-Pieper, M. Investigating Gut Permeability in Animal Models of Disease. Frontiers in Physiology. 9, (2019).
  7. Poulsen, S. S., Pedersen, N. T., Jarnum, S. "Microerosions" in rectal biopsies in Crohn's disease. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 19 (5), 607-612 (1984).
  8. Neumann, H., et al. Assessment of Crohn's disease activity by confocal laser endomicroscopy. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (12), 2261-2269 (2012).
  9. Laroui, H., et al. Dextran Sodium Sulfate (DSS) Induces Colitis in Mice by Forming Nano-Lipocomplexes with Medium-Chain-Length Fatty Acids in the Colon. PLoS ONE. 7 (3), (2012).
  10. John, L. J., Fromm, M., Schulzke, J. -D. Epithelial barriers in intestinal inflammation. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (5), 1255-1270 (2011).
  11. Su, L., et al. TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis. Gastroenterology. 145 (2), 407-415 (2013).
  12. Mateer, S. W., Cardona, J., Marks, E., Goggin, B. J., Hua, S., Keely, S. Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (108), e53250(2016).
  13. Devraj, K., Guérit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57038(2018).
  14. Stamatovic, S. M., Johnson, A. M., Sladojevic, N., Keep, R. F., Andjelkovic, A. V. Endocytosis of tight junction proteins and the regulation of degradation and recycling. Annals of the New York Academy of Sciences. 1397 (1), 54-65 (2017).
  15. Srinivasan, B., et al. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  16. Pearce, S. C., et al. Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types. BMC Biology. 16 (1), 19(2018).
  17. Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epithelial GapsColonic MucosaImmunofluorescence StainingEpithelial BarrierMicro ErosionsIntestinal PermeabilityCell SheddingApoptotic FociFluorescent DyeBarrier Function
Video Coming Soon

Related Articles