Burada, hasta periferik kan mononükleer hücrelerinden insan kardiyomiyositlerini sağlam bir şekilde üretmek ve genişletmek için bir protokol sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hasta Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden İnsan Kardiyomiyositlerinin Üretimi ve Genişlemesi
Bu makalede
Özet
Özet
Tek bir kan alımından hastaya özgü kardiyomiyositler üretmek, kardiyovasküler hastalık üzerinde hassas tıbba büyük ilgi çekmiştir. İnsan indüklenen pluripotent kök hücrelerden (iPSC) kardiyak farklılaşma, embriyonik kalp gelişimi için gerekli olan tanımlanmış sinyal yolları ile modüle edilir. 2-B ve 3 boyutlu platformlarda çok sayıda kardiyak farklılaşma yöntemi çeşitli verimlilikler ve kardiyomiyosit verimi ile geliştirilmiştir. Bu yöntemlerin çeşitliliği takip etmek zor olabileceği için bu, alanın dışındaki araştırmacıların kafasını karıştırdı. Burada, periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC' ler) hastaya özgü kardiyomiyositlerin sağlam bir şekilde üretilmesini ve genişlemesini ayrıntılı olarak anlatan kapsamlı bir protokol sunuyoruz. İlk olarak, entegrasyonsuz Sendai virüs vektörleri kullanarak bir hastanın kan örneğinden yüksek verimli bir iPSC yeniden programlama protokolünü açıklıyoruz. Daha sonra, çoğu insan iPSC hattından dayak kardiyomiyositleri sağlam bir şekilde üretebilen küçük bir molekül aracılı monolayer farklılaşma yöntemini detaylandırıyoruz. Ek olarak, endüstriyel ve klinik sınıf uygulamalar için hasta kaynaklı kardiyomiyositleri hızla genişletebilen küçük bir molekül (CHIR99021) kullanılarak ölçeklenebilir bir kardiyomiyosit genişletme protokolü getirilmiştir. Sonunda, bu iPSC-CM'lerin moleküler tanımlaması ve elektrofizyolojik karakterizasyonu için ayrıntılı protokoller tasvir edilir. Bu protokolün kardiyovasküler gelişim ve kök hücre biyolojisi hakkında sınırlı bilgiye sahip yeni başlayanlar için pragmatik olmasını bekliyoruz.
Giriş
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin keşfi modern kardiyovasküler tıpta devrim yaptı1,2. İnsan iPSC'leri kardiyomiyositler, endotel hücreleri, düz kas hücreleri ve kardiyak fibroblastlar da dahil olmak üzere kalpteki tüm hücre tiplerini kendi kendine yenileyebilir ve üretebilir. Hasta iPSC türevi kardiyomiyositler (iPSC-CM'ler), genetik olarak kalıtsal kardiyovasküler hastalıkların (CVD' ler) modellanması ve yeni ilaçlar için kardiyak güvenliğin test edilebilmesi için süresiz kaynaklar olarak hizmet edebilir3. Özellikle, hasta iPSC-CM'ler, uzun QT sendromu4 ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
İnsan denekler için deneysel protokoller ve bilgilendirilmiş onay, Nationwide Çocuk Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylandı.
1. Hücre kültürü ortamlarının, çözümlerinin ve reaktiflerinin hazırlanması
- PBMC medyayı hazırlama
- 20 mL bazal PBMC kültür medya (1x) ve 0,52 mL takviye karıştırın. Her birine 20 μL SCF ve FLT3 (stok konsantrasyonu: 100 μg/mL), her biri 4 μL IL3, IL6 ve EPO (stok konsantrasyonu: 100 μg/mL) ve 200 μL L-glutamin alternatifi (100x) ekleyin. İyice karıştırın. 0,22-μm filtre ünitesi kullanarak steril bir davlumbazda filtreleyin. Bunu Tam Kan Medyası olarak adlandır.
- 20 mL b....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
PBMC'lerden insan iPSC yeniden programlanması
7 gün boyunca Complete Blood Media ile ön kültürden sonra, PBMC'ler görünür çekirdek ve sitoplazma ile büyük hale gelir (Şekil 1B), virüs transfeksiyona hazır olduklarını gösterir. Sendai virüsünün yeniden programlanması faktörleri ile transfeksiyondan sonra, PBMC'ler bir hafta daha epigenetik yeniden programlama işleminden geçecektir. Tipik olarak, 1 x 10 5 PBMC'nin transfeksiyonundan30-5.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
iPSC yeniden programlanması sırasında, PBMC'leri net çekirdek ve sitoplazma ile genişleyene kadar 1 hafta boyunca kültürlendirmek önemlidir. PBMC'ler çoğalmadığından, viral transdüksiyon için uygun bir hücre numarası başarılı iPSC yeniden programlanması için önemlidir. PBMC'lerin hücre sayısı, enfeksiyonun çokluğu (MOI) ve virüs titresi göz önünde bulundurulmalı ve en uygun transdüksiyon sonuçlarına ulaşacak şekilde ayarlanmalıdır. Kardiyak farklılaşma için, ilk tohumlama yoğunluğu, CHIR99021'in uygulandığı gün iPSC'leri.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar rakip finansal çıkarlar beyan etmemektedir.
Teşekkürler
Bu çalışma Amerikan Kalp Derneği (AHA) Kariyer Geliştirme Ödülü 18CDA34110293 (M-T.Z.), Ek Girişimler AVIF ve SVRF ödülleri (M-T.Z.), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH/NHLBI) tarafından desteklendi. 1R01HL132520 ve R01HL096962 (I.D.). Dr. Ming-Tao Zhao, Nationwide Çocuk Hastanesi Abigail Wexner Araştırma Enstitüsü'nden başlangıç fonlarıyla da desteklendi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| ABI 7300 Hızlı Gerçek Zamanlı PCR Sistemi | Thermo Fisher Scientific | ||
| Axon Axopatch 200B Mikroelektrot Amplifikatörü | Moleküler Cihazlar | Mikroelektrot Amplifikatörü | |
| B27 takviyesi Thermo | Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 takviyesi eksi insülin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fiksasyon/Geçirgenleştirme Kiti | BD Biosciences | 554714 | Fiksasyon/Geçirgenleştirme solüsyonu, Süzüntü/Yıkama tamponu |
| BD Vacutainer CPT tüpü | BD Biosciences | 362753 | Kan hücresi ayırma tüpü |
| CHIR99021 | Selleck Kimyasalları | S2924 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Yeniden Programlama Kiti | Thermo Fisher Scientific | A16517 | Sendai virüsü yeniden programlama kiti |
| Digidata 1200B | Axon Instruments | Edinme kartı | |
| Direct-zol RNA Miniprep kiti | Zymo Research | R2050 | RNA ekstraksiyon kiti |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | |
| Essential 8 orta boy | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | iPSC kültürü için E8 ortamı |
| GlutaMAX takviyesi | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-glutamin alternatifi |
| Büyüme faktörü azaltılmış Matrigel | Corning | 356231 | Bazal membran matrisi |
| iScript cDNA Snythesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA sentezi |
| IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
| KnockOut Serum Değiştirme (KSR) | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| pCLAMP 7.0 | Moleküler Cihazlar | Elektrofizyoloji veri toplama ve analiz yazılımı | |
| Rekombinant insan EPO | Thermo Fisher Scientific | PHC9631 | |
| Rekombinant insan FLT3 | Thermo Fisher Scientific | PHC9414 | |
| Rekombinant insan IL3 | Peprotech | 200-03 | |
| Rekombinant insan IL6 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Rekombinant insan SCF | Peprotech | 300-07 | |
| RPMI 1640 orta | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| RPMI 1640 orta, glikoz yok | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| SlowFade Altın Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | S36936 | Montaj ortamı |
| StemPro-34 SFM | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | PBMC kültür ortamı |
| TaqMan Hızlı Gelişmiş Master | Karışımı Thermo Fisher Scientific | 4444964 | qPCR ana karışımı |
| TrypLE Select Enzyme 10x, fenol kırmızısı yok | Thermo Fisher Scientific | A1217703 | CM ayrışma çözümü |
| UltraPure 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | iPSC ayrışma çözeltisi |
| Y-27632 2HCl | Selleck Kimyasalları | S1049 |
Kaynaklar
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
