Helmholtz-Zentrum Berlin'de Kristalografik Parça Taraması için İş Akışı ve Araçlar

Özet

Helmholtz-Zentrum Berlin'deki kristalografik parça taraması, özel bileşik kütüphaneler, kristal işleme araçları, hızlı veri toplama tesisleri ve büyük ölçüde otomatik veri analizi içeren bir iş akışı kullanılarak gerçekleştirilir. Sunulan protokol, aşağı akış yapısına dayalı ligand tasarımı için umut verici başlangıç noktaları sağlamak için bu tür deneylerin çıktısını en üst düzeye çıkarmayı amaçlamaktadır.

Özet

Parça taraması, ligand tasarımı için umut verici başlangıç noktalarını belirlemeye yardımcı olan bir tekniktir. Hedef proteinin kristallerinin mevcut olduğu ve tekrarlanabilir yüksek çözünürlüklü X-ışını kırınım özelliklerini gösterdiği göz önüne alındığında, kristalografi hassasiyeti nedeniyle parça taraması için en çok tercih edilen yöntemler arasındadır. Ek olarak, sonraki rasyonel bileşik evrim için hayati önem taşıyan parçanın bağlama modunun ayrıntılı 3D bilgilerini sağlayan tek yöntemdir. Yöntemin rutin kullanımı, uygun parça kütüphanelerinin mevcudiyetine, çok sayıda numuneyi işlemek için özel araçlara, hızlı kırınım ölçümleri için son teknoloji senkrotron kiriş hatlarına ve sonuçların analizi için büyük ölçüde otomatik çözümlere bağlıdır.

Burada, Helmholtz-Zentrum Berlin'de (HZB) kristalografik parça taramasının (CFS) nasıl gerçekleştirileceklerine ilişkin eksiksiz pratik iş akışı ve araçlar sunulmaktadır. Bu iş akışı öncesinde, kristal ıslatma koşulları ve veri toplama stratejileri tekrarlanabilir kristalografik deneyler için optimize edilmiştir. Daha sonra, tipik olarak bir ila iki günlük bir prosedürde, kurutulmuş kullanıma hazır plakalar olarak sağlanan 96 üyeli CFS odaklı bir kütüphane, daha sonra ayrı ayrı flash-soğutmalı 192 kristali ıslatmak için kullanılır. Son kırınım deneyleri, Berlin-Adlershof'ta (Almanya) HZB tarafından işletilen BESSY II elektron depolama halkasındaki robot montaj destekli bl14.1 ve BL14.2 kiriş hatlarında bir gün içinde gerçekleştirilebilir. Kristalografik verilerin işlenmesi, protein yapılarının iyileştirilmesi ve isabet tanımlaması, özel sunucularda özel yazılım işlem hatları kullanılarak hızlı ve büyük ölçüde otomatikleştirilir ve çok az kullanıcı girişi gerektirir.

HZB'deki CFS iş akışının kullanılması rutin tarama denemelerine olanak tanır. Farmakolojik veya biyokimyasal uygulamalar için yararlı olan daha güçlü bağlayıcılar geliştirmek için başlangıç noktaları olarak parça isabetlerinin başarılı bir şekilde tanımlanması şansını artırır.

Giriş

İlaç geliştirmenin ilk adımı, bileşiklerin ilgi çekici bir hedefe karşı taranmasıdır. Geleneksel olarak, ilaç endüstrisinde yüksek verimli biyokimyasal testlerde 100.000-1.000.000 giriş sırasına göre büyük bileşik kütüphaneler kullanılmaktadır. Bu strateji, son 20 yıl içinde dik bir yükselişe geçen ve yöntemin çeşitli doğal avantajları nedeniyle yüksek kaliteli lider adayları oluşturmak için ana akım bir strateji haline gelen daha yeni bir yöntem olan parça bazlı ilaç tasarımı (FBDD) ile tamamlandı¹. "Parça" terimi, tipik olarak hidrojen olmayan veya ağır 20'den az atom (HA) içeren küçük bir organik molekülü ifade eder. Bu nedenle, bir parça, geleneksel yüksek verimli taramada keşfedilen ilaç veya kurşun benzeri moleküllerden (genellikle 30 HA'dan az) önemli ölçüde daha küçüktür. Parçalar zayıf benzeşim bağlayıcılarıdır. Bununla birlikte, daha büyük moleküllere kıyasla, parçalar daha çok yönlüdür, çünkü küçük bir koleksiyon bile aynı boyuttaki moleküllerin ilgili kimyasal alanını daha iyi temsil edebilir². Ayrıca, kurşun moleküllerine gelişen parça tarama isabetleri, zaten daha büyük molekülleri optimize etmekten çok daha etkilidir²,^3,4,5. Bu, tespitin yeterli duyarlılığını bekleyen parçaların taranması verimli bir şekilde kullanılabilir ve daha fazla bileşik evrim için yüksek kaliteli başlangıç noktaları sağlar. Parça taraması için çeşitli biyofiziksel yöntemler uygulanabilir, en popüleri nükleer manyetik rezonans, X-ışını kristalografisi, yüzey plazmon rezonansı ve termal kayma tahlilleridir. Bu yöntemler, isabetlere olan güveni artırmak ve sırasıyla yanlış pozitif veya yanlış negatiflerin sayısını azaltmak amacıyla paralel veya sıralı bir şekilde kullanılır. Bununla birlikte, yakın zamanda yapılan karşılaştırmalı bir çalışma^6, farklı yöntemler arasındaki düşük çakışma nedeniyle sıralı tarama basamaklarının önlenmesi gerektiğini öne sürmektedir.

X-ışını kristalografisi atomik detaylarda yapı tespiti için iyi kurulmuş bir yöntemdir, ancak son zamanlarda tarama amacıyla bir araç olarak geliştirilmiştir^7,8. Protein kristalleri yüksek parça konsantrasyonlarını (örneğin, 100 mM) tolere ettikçe, kristalografik parça taraması (CFS), parçaları taramak için diğer biyofizik yöntemlerle rekabet edebilir veya hatta ilk adım tarama yöntemi olarak onları geride bırakabilir^6,9. Bununla birlikte, CFS için hayati bir ön koşul, hedef proteinin doğrulanmış bir kristalizasyon sistemidir ve kırınım özelliklerine sahip kristalleri tipik olarak 2 Å'dan daha iyi olan önemli ölçüde yüksek çözünürlüğe geri sunar.

CFS'nin diğer tüm parça tarama metodolojilerine kıyasla özel bir yararı, tanımlanan parçaların bağlama modu hakkında ayrıntılı 3B bilgilerin sağlanmasıdır. Bu yapısal bilgi, parça isabetlerinin daha yüksek benzeşimli bağlayıcılara rasyonel optimizasyonu için kesinlikle çok önemlidir. Yerleşik detaylandırma stratejileri büyüyor, birleşiyor ve parçayı birbirine bağlıyor⁵. Böylece başlangıçtan itibaren nispeten yüksek ligand verimliliği sağlanır ve gereksiz veya mekansal olarak uygun olmayan grupların tanıtılması önlenebilir, böylece kimyasal sentez maliyetleri azaltılabilir. Sonuç olarak, CFS uyuşturucu tasarımı için bir başlangıç stratejisi olarak rakipsiz avantajlara sahiptir.

Belirli bir biyolojik hedefin CFS'nin kristal kalitesiyle ilgili yüksek gereksinimlerini karşıladığını göz önüne alındığında, bu tür tarama kampanyalarının başarılı bir şekilde sonuç alma şansını en üst düzeye çıkaran bazı ana faktörler vardır. Kullanılan parça kitaplığının kalitesine, kırınım deneyinden önce deneyleri gerçekleştirmek için verimli bir iş akışına, yeterli otomasyon ve veri toplama hızına sahip senkrotron kiriş çizgilerine ve büyük ölçüde otomatik veri işleme ve analiz yollarına ve araçlarına bağlıdır. Burada, kristal ıslatma deneylerinden isabet tanımlamasına kadar tüm iş akışı, BESSY II'deki makromoleküler kristalografi kiriş çizgilerinde başarıyla kurulduğu şekilde sunulmaktadır (Şekil 1). Tesis, akademik ve endüstriyel kullanıcılara işbirliği için açıktır. Ayrıca, Almanya dışındaki AB ülkelerinin akademik kullanıcıları iNEXT Discovery projesi aracılığıyla finansman başvurusunda bulunabilirler.

Bir CFS kampanyası başlatabilmek ve bu çalışmada özetlenen protokolü yürütebilmek için vazgeçilmez önkoşullar vardır: hedef proteinin iyi dağıtıcı kristalleri, çok sayıda çoğaltılabilir, ortam sıcaklığında stabil ve son derece uçucu maddeler olmadan kristalleşme kokteyli kullanılarak yetiştirilmiştir. Bir diğer ön koşul ise kristal kafesin deneye uygunluğudur. Uygun bir kafeste, hedef proteinin ilginç bölgeleri çözücü kanallarına doğru maruz kalmalı ve böylece erişilebilir olmalıdır. CFS kampanyasının iş akışında başarıyı sağlamak için isteğe bağlı olan ancak yine de şiddetle tavsiye edilen bir başka önceki adım, deneme için ıslatma koşulunun optimizasyonudur. Buradaki hayati kıyaslama istatistikleri, kristalin kırınım gücü ve veri ölçeklendirme prosedürü sırasında belirlenen ilgili veri kalitesi göstergeleridir. Optimize etmek için tipik faktörler DMSO toleransı, tampon konsantrasyonu ve kriyo koruyucudur. Aşağıda daha ayrıntılı olarak açıklanmış katı bir önkoşul olmasa da, bir ortak çözücü olarak DMSO parça çözünürlüğü artırmaya yardımcı olabilir. Tipik testler bir gecede 0, 3, 6 veya% 10 (v/v) DMSO ıslatma içermelidir. Tampon konsantrasyonunun 200 veya 300 mM'ye çıkarılması, kullanılacak yüksek parça konsantrasyonlarından kaynaklanan zaman zaman pH kaydırma etkileri nedeniyle kırınım kalitesinde kaybı önlemeye yardımcı olur. Son olarak, hangi ek kriyoprotektantın gerekli olup olmadığını ve ıslatma durumuna zaten dahil edilip edilmeyeceğini bulmak belirleyicidir. Bununla birlikte, çoğu durumda, ek bir kriyo koruyucuya ihtiyaç yoktur, çünkü DMSO'nun kendisi bir kriyo koruyucu olarak hareket edebilir. Öyleyse, bu son denemede bir işleme adımı kaydeder. Çoğu kristal, uygun boyuttaki halkalarda flaşla soğutulursa, anne likörünü mümkün olduğunca en aza indirir veya önlerse daha az kriyo koruyucuya ihtiyaç duyar. Bununla birlikte, nadir durumlarda, flaş soğutması üzerine kristalin zarar görmesini önlemek için ana likörün bir tabakası gerçekten gereklidir.

Bir CFS kampanyasında elde edilen isabet sayısı sadece hedef proteinin uyuşturlanabilirliğine ve kristal kafesin uygunluğuna bağlı değildir (yukarıya bakın), aynı zamanda kütüphanenin kalitesine de bağlıdır. Kütüphane kalitesi iki açıdan oluşur: kütüphane için bileşiklerin seçimi ve bileşiklerin şekerlemesi (yani, deney için hangi fiziksel formda sunuldukları). Bileşik seçim için farklı stratejiler kullanılabilir. Kütüphane tasarımlarının çoğu, parçaların kimyasal çeşitliliğinin en üst düzeye çıkarılmasını içerir. Stratejik bir odak noktası, örneğin Diamond-SGC-iNEXT hazır kütüphanesi^10'dauygulanan takip tasarımı için parçaların kimyasal çekiş kabiliyetini dahil etmek olabilir. Kütüphane tasarımı için bir başka stratejik odak, HZB^11'degeliştirilen F2X kütüphaneleri tarafından örneklendirildiği gibi, parçaların ticari olarak mevcut kimyasal alanının şekil ve farmakofor bazlı kümeleme ile temsilini en üst düzeye çıkarmak olabilir. Daha spesifik olarak, F2X Giriş Ekranı olarak adlandırılan ilk CFS kampanyaları için 1103 üyeli F2X-Universal Library ve temsili 96 bileşik alt kümesi geliştirilmiştir ve F2X Giriş Ekranı başarıyla doğrulanmıştır¹¹. F2X Giriş Ekranı, HZB'deki CFS kampanyaları için birincil seçimdir. Daha sonra, F2X-Universal Library veya HZB'de de sunulan 1056 üyeli AB-OPENSCREEN parça kitaplığı¹² kullanılarak daha büyük kampanyalar gerçekleştirilebilir. Şu anda, bu kütüphaneler Berlin'deki BESSY II senkrotronunun makromoleküler kristalografi kiriş çizgilerinin kullanıcıları için bir işbirliği sözleşmesine dayanarak ücretsiz olarak kullanılabilir. Bu, iNEXT Discovery teklifleri aracılığıyla kullanıcılar için de geçerlidir. Ayrıca, F2X Giriş Ekranı, bir malzeme transfer anlaşması temelinde ilgilenen tüm bilim adamları tarafından kullanılabilir.

Bir kütüphanenin fiziksel sunumu ile ilgili olarak, iki yaklaşım yaygın olarak benimsenir: parçalar ya DMSO stok çözümleri olarak kullanılır ya da parçalar kullanıma hazır plakalarda kurutulur ve hareketsiz hale getirilir. HZB'de, hem F2X Giriş Ekranı hem de F2X-Universal Kütüphanesi'nin uçucu olmayan bileşikleri, 3 lensli 96 kuyulu MRC düşük profilli kristalizasyon plakasında kurumuş bileşikler olarak sunulmaktadır. Kristalizasyon plakalarında hareketsiz hale getirilen parçaların sunumu iki hayati avantaja sahiptir: Öncelikle, tarama plakalarının kullanıcının ev laboratuvarına taşınmasına izin verir. Bu nedenle, burada sunulan iş akışının ıslatma ve kristal işleme adımları (adım 1-3) her yerde gerçekleştirilebilir. İkinci olarak, DMSO içermeyen çözüm kullanılabilir. DMSO'ya duyarlı hedefler böylece kolayca taranabilir, büyük ölçüde beklenen isabet oranlarını korur¹¹. Bununla birlikte, DMSO parça çözünürlüğünü arttırır, bu nedenle yukarıda belirtildiği gibi önceden tercih edilen bir kristal sistemin DMSO toleransını kontrol etmek faydalı olacaktır.

Aşağıda özetlenen protokol, F2X Giriş Ekranı gibi 96 bileşik ekranlı tipik bir deneyi açıklayacaktır. Bunun için taze olarak kullanılmak üzere yaklaşık 250 kristalin zamanında hazırlanması gerekir. Islatmaların tüm 96 bileşikler için kopya olarak hazırlanması şiddetle tavsiye edilir. Daha sonra isabet tanımlaması için pan-veri yoğunluğu analizi (PanDDA) yaklaşımını kullanarak veri analizine yardımcı olacak ek mock-soak'ler hazırlamanız önerilir¹³. Mock-soaks, parçanın aynı kuluçka süresi boyunca ıslanmasıyla aynı ıslatma çözeltisini kullanarak protein kristalleri üzerinde ıslatma deneyleri olarak tanımlanır, ancak hiçbir parça yoktur. Islatma çözeltisi kristalizasyon durumuna eşitse, kristaller doğrudan kristalizasyon plakasından toplanabilir.

Robotik örnek değiştiricinin yeteneklerine bağlı olarak, farklı pak formatlarının kullanılması gerekebilir. Şu anda, HZB tarafından işletilen kiriş hattı BL14.1 için numunelerin Unipuck formatında hazırlanması, HZB tarafından işletilen beamline BL14.2 için örneklerin SPINE pak formatında hazırlanması gerekir. Bu protokolde, Unipuck biçiminde hazırlık varsayılır.

Protokol

1. ıslatma kristalleri

1. -20 °C dondurucudan eleme plakasını (burada bir F2X Giriş Ekranı plakası, Şekil 2)alın ve oda sıcaklığına önceden ısıtmak için yaklaşık 30 dakika boyunca tezgaha / masaya yerleştirin, böylece yoğuşma nemini önleyin.
2. Çalışma yerini iki adet yakından düzenlenmiş mikroskop ve gerekli tüm aletlerle düzenleyin (Şekil 3A). Malzemeler Malzeme Tablosundalistelenmiştir.
3. Islatılacak kristallerin transferi için uygun boyutta 3-4 ilmek seçin ve mikroskopların yakınlarına yerleştirin.
4. Cam spot plaka boşluklarını iyonize edilmiş veya damıtılmış su ile doldurun.
5. 5 mL ıslatma çözeltisi hazırlayın.
6. Önceden ısıtılmış eleme plakasının torbasını oda sıcaklığına kadar kesin.
7. Plakayı tezgaha/masaya yerleştirirken kapağı ve folyoyu eleme plakasından çıkarın.
8. Reaktif rezervuarında 5 mL ıslatma çözeltisini dekant.
9. 96 rezervuarın her birini 12 kanallı pipet kullanarak 40 μL ıslatma çözeltisi ile doldurun.
10. EasyAccess Çerçevesini eleme plakasının üzerine yerleştirin ve cihazın sol ve sağ tarafına kaydırarak birlikte verilen kelepçelerle sabitleyin.
    NOT: EasyAccess Frame, HZB¹⁴'te geliştirilen birden fazla kristali işlemek için özel bir cihazdır. Diğer kuyuları buharlaşmaya karşı korurken hareketli karoları kaydırarak her kuyuya kolay erişim sağlar.
11. Tarama plakasını (EasyAccess Çerçevesi dahil) ilk mikroskopun altına ve ikinci mikroskop altında ıslatılacak kristaller de dahil olmak üzere kristalizasyon plakasına yerleştirin.
12. EasyAccess Frame'in ilgili akrilik cam döşemesini bir parmakla veya birlikte verilen kalem aletiyle hareket ettirerek tarama plakasının A1'ini iyice açın.
13. Taze bir pipet ucu kullanarak rezervuardan kuyu (sol üst lens) içeren parçaya 0,4 μL ıslatma çözeltisi ekleyin. Mikroskoptan damlanın kurumuş parçayı kapsadığını kontrol edin, böylece çözülebilir.
    NOT: Alternatif olarak, bu adım EasyAccess Çerçevesinin montajından önce bir pipetleme robotu kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu şekilde tüm kuyuların ıslatma damlaları tek bir otomatik prosedüre yerlenebilir. Bununla birlikte, yazarlar, parçanın yavaşça ve kristalin varlığında çözünmesini sağlamak için ıslatma adımından hemen önce ıslatma çözeltisini eklemeyi önerir. Bu, kristalin yüksek parça konsantrasyonuna sahip bir düşüşe transfer sırasında ani bir şok yaşamasını önler.
14. İkinci mikroskop altında, kristalleşme plakasının sızdırmazlık folyosunu hedef kristalleri içeren kuyulardan birinde kesin.
15. Kristal değnek üzerine monte edilmiş uygun büyüklükte bir döngü kullanarak iki kristali ilk mikroskop altında tarama plakasının kuyu A1'ine aktarın.
16. Halkayı hazırlanan cam spot plakada yıkayın ve dokuya hafifçe dokunarak kurulayın. Islatma çözeltileri içeren parça ile çapraz kontaminasyonu önlemek için her transferden sonra bunu yapın.
17. Kristallerin düzgün yerleştirilmiş olup olmadığını kontrol etmek için mikroskobu kullanın.
18. Bir sonraki kuyuya geçin (örneğin, B1).
19. Her ıslatma damlası iki kristal içerene kadar tarama plakasının 96 kuyusunun tümüyle 1.13-1.18 adımlarını tekrarlayın.
20. Tarama plakasını (EasyAccess Çerçevesi dahil) mikroskop altından çıkarın ve tezgaha/masaya yerleştirin.
21. EasyAccess Çerçevesini eleme plakasından çıkarın.
22. Eleme plakasını sızdırmazlık folyosu ile kapatın ve kristallerin yetiştirildiği sırasıyla kristalizasyon inkübatörüne veya dolaba yerleştirin.
23. Optimize edilmiş ıslatma süresi için kuluçkaya yaslanın. Geceleme genellikle uygundur.
24. (isteğe bağlı) Yaklaşık 40 apo kristalinin hazırlanması (yani, sahte ıslatma)
    1. MRC 3 lensli 96 kuyulu kristalizasyon plakası alın ve iki sütunu 12 kanallı pipet kullanarak kuyu başına 40 μL ıslatma çözeltisi ile doldurun.
    2. EasyAccess Çerçevesini kristalizasyon plakasının üzerine yerleştirin ve cihazın sol ve sağ tarafına kaydırarak birlikte verilen kelepçelerle sabitleyin.
    3. Kuyu A1 akrilik cam karo açın.
    4. Kuyunun iki sol lensinin her birine 0,4 μL ıslatma çözeltisi yerleştirin.
    5. Her damlaya 2-3 kristal aktarın. Her transferden sonra, ilmek hazırlanan cam spot plakada yıkayın ve dokuya hafifçe dokunarak kurulayın.
    6. Bir sonraki kuyuya (örneğin, B1) geçin.
    7. Yaklaşık 40 kristal inkübasyona hazır olana kadar 1.24.4-1.24.6 adımlarını yineleyin.
    8. Kristalizasyon plakasını (EasyAccess Çerçevesi dahil) mikroskop altından tezgaha/masaya çıkarın ve EasyAccess Çerçevesini çıkarın.
    9. Kristalizasyon plakasını sızdırmazlık folyosu ile kapatın ve yukarıda belirtilen kristalizasyon inkübatörüne veya dolaba yerleştirin.
    10. Tarama plakası ile aynı zamanda kuluçkaya yatırın.

2. hasat kristalleri

1. Kuluçka plakalarını sırasıyla inkübatörden veya dolaptan çıkar.
2. Çalışma yerini bir mikroskop ve gerekli tüm aletlerle düzenleyin (Şekil 3B). Malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
3. 3 Unipuck kapaklı (örneğin, numune muhafazaları) bir Unipuck köpük dewar hazırlayın ve sıvı nitrojen (LN₂₎ile doldurun.
   NOT: LN₂ ile çalışmak için uygun güvenlik önlemlerine uyun (yani, güvenlik gözlüğü takın ve uygun koruyucu ekipman kullanın). LN₂ depolama kabında su yoğuşmasını önlemek için seans sırasında birkaç kez taze LN₂ almak en iyisidir. Aşağıdaki prosedürün tamamında, köpük dewar'daki LN₂ seviyesinin her zaman dewar'ın üst kenarına ulaştığından emin olun. Ayrıca LN_2'nin buzsuz olduğundan emin olun; LN_2'yi sık sık değiştirin (örneğin, her 45 dakikada bir) veya buz birikmeye başlarsa en son. Sonra, ikinci köpük dewar doldurun ve Unipucks'ı ona aktarın. Buzlu köpük dewar boşaltın ve fön makinesi ile kalan buz ve nemi çıkarın.
4. Folyoyu eleme plakasından çıkarın ve EasyAccess Çerçevesini üzerine yerleştirin.
5. İyi açıp açın A1.
6. LN_2'ye hızlı bir dikey hareketle daldırarak ve numuneyi uygun pak konumuna getirerek damladan iki kristal toplayın ve LN_2'de (tek tek) flaş soğutun. Örnek izleme sayfasında ilgili notları alın.
7. Kriyoproteksyon adımı (hedef kristaller için gerekirse). Bu durumda, 2.6 yerine bu adımı gerçekleştirin.
   1. Kuyunun sol alt lensine kriyo koruyucu dahil 0,4 μL ıslatma çözeltisi yerleştirin.
   2. Kristali döngüde tutarken sol alt lensteki çözeltiden yavaşça sol üst lensteki damladan monte edilmiş bir kristalle halkayı çekin ve ardından LN_2'deflaş soğutun. Bu şekilde iki kristal hasat edin.
      NOT: 2.6 ve 2.7. adımlarda kristalin döngüde olduğu ve havaya maruz kaldığı sürenin çok kısa tutulduğundan emin olun. Dalma (yani, LN₂dolgulu dewar'daki numunenin dikey damlası) mümkün olduğunca hızlı yapılmalıdır. Bu, yüksek numune kalitesi ve verilerdeki buz halkalarının önlenmesini sağlar. Aşağıdaki X-ışını ölçümleri için yinelenenlere öncelik vermek için örnekleri izleyin (örneğin, kristallerin hasarları olup olmadığını vb.) bunun için şablonu kullanın. Kristallerde ıslatma nedeniyle çatlaklar, "tüyler" veya başka kusurlar olsa bile, yine de kullanılabilirler ve her zaman hasat edilmelidirler. Kristallerin birkaç parçaya ayrılma ihtimaline karşı, en büyük / en iyi görünümlü parçalardan ikisi hasat edilmelidir. Şekil 5, bu tür kristallerin nasıl görünebileceğine dair bazı örnekler göstermektedir. Gösterilen tüm kristaller ilgili kampanyada hala yararlı veri kümeleri verdi¹¹, önemli morfolojik değişiklikler meydana gelse bile, tedaviyi ıslattıktan sonra kristalleri hasat etmeye değer olduğunun altını çizdi.
8. Bir sonraki kuyuya gidin ve üç pak da dolana kadar 2.5 - 2.6./2.7 adımlarını tekrarlayın.
9. Unipuck tabanlarını LN_2'deönceden soğutularak kapakların üzerine ekleyin.
10. Unipucks'ı bir nakliye savaş veya depolama dewar'ında depolama raflarında saklayın.
11. Tarama plakasının tüm kuyuları işlenene kadar önceki adımları tekrarlayın.
12. (isteğe bağlı) Sahte ıslatılmış kristaller hazırlanmışsa, önceden açıklandığı gibi benzer bir şekilde hasat edin.
    NOT: Tarama plakasının 96 koşulunun her biri için iki kristal flaş soğutmalı olabilirse, 14 Unipucks'ı doldurmak için 32 sahte ıslatılmış apo kristali için alan olacaktır.
13. Unipucks'ı ölçüme kadar LN_2'de saklayın.

3.Veri toplama

1. Unipucks'ı BL14.1 hattına aktarın. SPINE diskleri adım 2'de kullanılmışsa, bunları beamline BL14.2'ye aktarın.
2. Aşağıda verilen özel önerileri kullanarak kiriş hattında standart ölçümler gerçekleştirin. Tesis ve deney kontrol programı MXCuBE2 ile ilgili ayrıntılar daha önce^15,16. Şekil 4, BL14.1 ve BL14.2 kiriş çizgilerinin deneysel kulübelerinin iç kısmının yanı sıra BL14.1 beamline'daki MXCuBE2 kontrol yazılımının örnek bir ekran görüntüsünü göstermektedir.
   1. Zaman verimliliğini ve aktarım hızını en üst düzeye çıkarmak için test görüntülerinin koleksiyonunu atlayın. Numuneden dedektöre mesafe, daha önceki deneylerde belirlenen kristal sistemin üst çözünürlük sınırına uygun bir değere sabitlenecektir. Veri toplama stratejisi önceden optimize edilmiş değilse, görüntü başına 0,1 s pozlama süresine sahip her biri 0,2 derecelik 1800 görüntü toplayın.
   2. İdeal olarak, sahte ıslatılmış apo kristalleri kullanarak önceki deneylerde veri toplama stratejisini test edin. Daha yüksek simetri uzay grupları için, 1200 görüntü veya hatta 900 görüntü (sırasıyla 240° veya 180°), veri toplamanın başlangıç açısından bağımsız olarak iyi istatistiklerle eksiksiz veri kümeleri verecektir.
      NOT: Daha yüksek artıklık ve daha ince dilimleme üstün veri kalitesi sağlayabilir¹⁷. Bununla birlikte, burada önerilen bu "yeterli ama daha fazla değil" stratejisini kullanmak, kalite, veri toplama süresi ve daha sonra analiz için hesaplama gereksinimleri arasında mükemmel bir takastır. Açıklanan şekilde, BL14.1 ve BL14.2 kiriş hatlarında 24 saat içinde 200 veri toplama mümkündür. Bununla birlikte, örneklere öncelik verilmelidir.
   3. İlk olarak, 2.6./2.7 adımındaki önceliklendirmeye bağlı olarak parça koşulu başına bir örnek için kırınım veri kümeleri toplayın (örneğin, daha yüksek öncelikli yineleme için verileri toplayın).
   4. Veri toplamanın başarısız olduğu, kırınımların kaybolduğu veya şiddetli buz halkalarının oluştuğu 3.2.3'teki deneyler için, ilgili parça koşulunun ikinci yinelenen örneği için veri toplayın.
   5. Apo kristallerinin kırınım veri kümelerini toplayın (1.24 ve 2.12 adımlarına göre hazırlanmışsa).
   6. Her parça koşulunun kalan yinelemelerinin kırınım veri kümelerini toplayın.
   7. MXCuBE2 programında, CFS kampanyasının veri kümesi tanımlayıcılarını aşağıdaki desenle eşleştirin: --[ABCDEFGH][01][0123456789][ab] (örn. MyProtein-F2XEntry-B05a, burada "B05" kuyuyu (yani, ekrandaki parça koşulu) ve ilk yineleme için aşağıdaki "a" anlamına gelir.)

4.Veri işleme

1. CFS kampanyasının veri analizi için, otomatik iyileştirmeyi işlemek için çok katlı bir analizi kontrol etmek için web tabanlı bir çözüm olan FragMAXapp'ı ve CFS verilerinin PanDDA isabet değerlendirmesini^{kullanın 18} (Lima ve ark. FragMAXapp, yayınlanmamış veriler). HZB'de dağıtılan FragMAXapp sürümünde aşağıdaki programlar/boru hatları mevcuttur: XDSAPP¹⁹, Xia2-DIALS ve Xia2-XDS²⁰, fspipeline⁷, DIMPLE²¹, Phenix LigFit²², PanDDA^13,23. Otomatik arıtma için giriş olarak hedef proteinin iyi rafine edilmiş bir giriş modelini kullanın; aksi takdirde, kampanya sırasında toplanan yüksek çözünürlüklü sahte ıslatılmış bir kristalin titiz bir şekilde iyileştirilmesini gerçekleştirin.
   NOT: isabet tanımlama için önemli bir öğe PanDDA'dır. Ayrıntılar ilgili yayınlarda açıklanmıştır^13,23. Kısacası PanDDA, CFS kampanyasındaki bir veri kümesinin elektron yoğunluk haritalarını otomatik olarak hesaplar. Bunlar daha sonra bağlayıcı olmayan parça koşulları olarak kabul edilir ve sözde ground state modelini oluşturmak için ortalamalanır. Yer durumu modeli daha sonra voksel ilişkili Z-skorları kullanılarak her elektron yoğunluk haritası ile zemin durumu haritası arasında yerel tutarsızlıklar elde etmek için kullanılır. Daha sonra, yüksek Z puanlı alanlar için, ilgili haritadan zemin durumu yoğunluğunun ince ayarlı olarak çıkarılmasıyla PanDDA haritası oluşturulur. Bu, parça bağlama olaylarının görünürlüğünü büyük ölçüde artırır.
2. PanDDA'nın sonucunu en üst düzeye çıkarmak için iki adımlı bir yaklaşım kullanın. İlk olarak, standart ayarlarla bir PanDDA çalıştırması (pandda.analysis) gerçekleştirme. Sahte ıslatılmış kristaller toplanmış olsa bile, mevcut tüm verilerden PanDDA tarafından toprak durumu modelinin tarafsız bir şekilde üretilmesini sağlamak için kimlikleri bir parametre olarak dahil edilmeyecaktır (yine de mümkündür). Daha sonra, çıktı verileri kullanıcı tarafından Coot^24'tekiPanDDA incelemesi ile değerlendirilir. Burada, nispeten yüksek güvene sahip isabetler not edilmeli ve ilk adımı sonuçlanmalıdır.
3. İkinci olarak, --exclude_from_characterisation="<-of-bound-dataset-ids>" komut satırı seçeneği aracılığıyla zemin durumu modelinden ön isabetleri (ilk adımda belirlenir) hariç tutarak pandda.analysis adımını yeniden çalıştırın. Daha fazla ayrıntı PanDDA yardım sayfalarında (https://pandda.bitbucket.io/) açıklanmıştır. Bu şekilde, açık isabetler olan ve bu nedenle dahil edilirse zemin durumu modelini gizleyecek veri kümeleri göz ardı edilir. Bu, gelişmiş bir zemin durumu modeline ve böylece genel olarak iyileştirilmiş sonuçlara yol açar. Son olarak, isabet tanımlamasını tamamlamak için kapsamlı bir PanDDA incelemesi gerçekleştirilir.
   NOT: FragMAXapp ayrıca modellenmiş ilişkili durumları kaydetmek veya PDB gönderimi için veri hazırlamak için bir çıktı seçeneği içerir, daha fazla ayrıntı için FragMAX web sayfalarına bakın (https://fragmax.github.io/).

Sonuçlar

F2X-Entry Screen^11'indaha önce bildirilen doğrulama kampanyalarının bir parçası olarak, MAX IV'teki BioMAX beamline'da üç kampanya ve HZB'deki BEAMLINE BL14.1'de bir kampanya yürütüldü. İkinci kampanyada, DMSO içermeyen bir ıslatma koşulu kullanan belirli bir F2X Giriş Ekranı koşulları kümesi, maya Aar2'nin protein-protein kompleksine ve maya Prp8'in (AR) RNaseH benzeri etki alanına karşı tarandı. Seçilen koşullar kümesi, F2X Giriş Ekranı'nın daha önceki bir kampanyasında, DMSO¹¹içeren bir ıslatma durumunda AR'ye karşı bulunan isabetleri içerir (yani, HZB'de gerçekleştirilen kampanyada bu isabetler DMSO'nun yokluğunda yeniden tarandı). Şekil 7, verileri işleme için XDSAPP'in FragMAXapp kombinasyonu, otomatik iyileştirme için fspipeline ve PanDDA kullanarak daha sonra isabet bulma ile analiz ettikten sonra elde edilen isabetlere genel bir bakış göstermektedir.

Şekil 1: Helmholtz-Zentrum Berlin'deki özel ortama odaklanarak kristalografik parça tarama (CFS) deneyinin iş akışının şematik gösterimi.

Şekil 2: F2X Giriş Ekranının formülasyonu ve paketlenmesi. 96 bileşik ekran, folyo ve vakumla kapatılmış 3 lensli 96 kuyulu MRC düşük profilli bir plakada mevcuttur. Ekranın 96 bileşiği, her kuyunun üç lensinden ikisinde DMSO çözeltilerinden kurutular. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: HZB hazırlık laboratuvarında CFS tezgahının fotoğrafı. A) ıslatma ve B) kristal hasadı için gerekli aletlerin montajları görüntülenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Veri toplama uç istasyonları ve kontrol yazılımı. A) HZB-MX kiriş çizgilerinin deneysel mandalının fotoğrafı BL14.1 (solda) ve BL14.2 (sağda)¹⁵. B) Kırınım verisi toplama için^BL14.1'de kullanılan MXCuBE2 deney kontrol arayüzü 16'nın ekran görüntüsü. BL14.2'de çok benzer bir arayüz kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.  

Şekil 5: Veri toplamadan önce kriyojenik ortamda bazı kristal örneklerin fotoğrafik anlık görüntüleri. Bu, parça ıslatma ve kristal hasadını gerçekleştirdikten sonra kristallerin morfolojilerinin değişkenliğini göstermektedir. Fotoğraflar, F2X-Entry Screen doğrulama^11'inbir parçası olarak orada toplanan AR örnekleri için BioMAX ışın hattında (MAX IV senkrotron, Lund, İsveç) çekildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Uygun veri analizi için HZB'ye yüklenen FragMaxApp^18'in ekran görüntüsü. Lima ve ark., FragMAXapp, yayınlanmamış veriler hakkında daha fazla bilgi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: CFS kampanyası F2X-Entry ve AR (DMSO olmadan) sonuçlarının özeti. AR protein kompleksi çizgi film görünümünde, Aar2 gri renkte ve PRP8'in RNaseH benzeri etki alanı mavi renkte gösterilmiştir. Kampanyanın parça isabetleri element renklerinde (C - sarı, O - kırmızı, N - mavi, S - turuncu, Cl - açık camgöbeği) renklidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Bilgi. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız. 

Tartışma

Başarılı bir CFS kampanyası için, açıklanan önkoşullara uymak çok önemlidir (bkz. Giriş). Birçok iyi dağınık kristalin tekrarlanabilir büyümesi için güvenilir bir kristalizasyon sistemine ve otomatik arıtma için giriş apo modeli olarak iyi rafine edilmiş bir yapıya ihtiyaç vardır. Proteindeki hedef bölgenin (aktif site veya arayüz alanı) kristal kafesteki parçalar için erişilebilir olup olmadığını kontrol etmek de önemlidir. Islatma kalitesinin önemli ölçüde bozulmamasını sağlamak için ıslatma koşullarını önceden optimize etmek çok önemlidir. Bu yönleri ihmal etmek büyük olasılıkla sınırlı bir kullanıma sahip olacak ve en kötü durumda tüm deneyin tekrarlanmasını gerektirecek bir yetersiz deneye yol açacaktır.

Yukarıda açıklanan protokol, standart bir CFS kampanyası sırasında izlenen yordamları özetlemektedir. Tüm önkoşullar karşılanırsa, ıslatılmış kristallerin en az% 90'ı bir kırınım deneyinde yüksek çözünürlüğe kırınım göstermelidir. Bu durumda, ıslatma süreleri birkaç saat hatta dakikaya kısaltılabilir. Parçaların çoğunun iyi çözünürlüğü nedeniyle, bu iyi doluluk değerleri elde etmek için yeterli olmalıdır. Ayrıca, tipik bir CFS kampanyası kabaca% 10 veya daha yüksek bir isabet oranına neden olacaktır. F2X-Entry Screen doğrulama kampanyaları için¹¹ ve aynı kütüphaneye sahip devam eden kullanıcı kampanyaları daha da yüksek isabet oranları gözlenmiştir (%20 ve üzeri veriler gösterilmez).

Kristalografik parça taramasının genel bir uyarısı, kristalografik temas alanlarının varlığıdır. Bunlar bilinen a priori etkin siteleri tıkayabilir (taramadan önce kontrol edilecek, yukarıya bakın) veya bu iletişim siteleri genellikle parçaların bağlanabileceği cepler ve sıcak noktalar sağlar. Bu tür parça vuruşları kristalleşme kafesinin eserleri olacak ve muhtemelen çözeltideki proteine bağlanmayacaktır. Bu olaylar, ıslatma deneylerinde, ortak kristalizasyon deneylerinden daha sık meydana gelme eğilimindedir (muhtemelen ıslatma deneylerinde kullanılan daha yüksek parça konsantrasyonları nedeniyle). Bununla birlikte, önceki deneyimlere göre, genellikle elde edilen isabetlerin sadece küçük bir kısmını oluştururlar. Örneğin, Endothiapepsin (EP) ve Prp^8RNaseH ve Aar2'nin (AR) spliceosomal protein-protein kompleksini kullanan F2X Giriş Ekranı doğrulama kampanyasında, isabetlerin çoğu umut verici sitelerde meydana geldi¹¹. EP için, gözlemlenen 37 bağlama olayının 27'si aktif bölgede (yani, bu proteazın peptit yarığı) bulundu. 10 uzaktan bağlama olayı, iki solvent açığa çıkan bağlama olayını ve sekiz kristal temas bağlama olayını (beş benzersiz isabete karşılık gelen) içerir. Bu kristal temas isabetleri hariç olmak, AP kampanyası için genel olarak %24'lük benzersiz isabet oranını yansıtmaya devam edecektir. Bilinen bir aktif bölgenin (kristal temas bağlayıcıları hariç) uzak bağlama olaylarının da potansiyel olarak ilginç olabileceğini fark etmek önemlidir (örneğin, yeni sıcak noktalar veya proteinin allosterik bölgeleri ortaya çıkar). AR kampanyası için (aynı yayında), gözlemlenen 23 bağlayıcı olayın, yedisi kristal kontaktlarda, biri iki proteinin doğrudan arayüzünde, yedisi daha büyük biyolojik bağlamın diğer bağlayıcı ortaklarıyla bilinen protein-protein etkileşim alanlarında (dolayısıyla spliceosome'ın farklı montaj aşamaları) bulundu, sekiz bağlayıcı olay, HENÜZ bilinmeyen işlevin AR'sinde iki sıcak nokta ve prp8^RnaseH'ninsolvent maruz kalan yüzeyinde olduğunu ortaya çıkardı. Bu nedenle, kristal kontaklardaki olaylar ve Prp8^RnaseH singleton hariç, potansiyel olarak yararlı bağlama olaylarının sayısı 15'tir (14 benzersiz isabete karşılık gelir) böylece% 15,6'lık bir isabet oranıdır. Bu isabetler, protein-protein etkileşim modülatörlerinin tasarımı veya keşfedilen iki Aar2 sıcak noktasını keşfetmeyi amaçlayan takım bileşikleri için başlangıç noktaları olabilir. Birlikte ele alındığında, aynı zamanda yürütülen kullanıcı kampanyaları doğrultusunda, genellikle kristalografik parça taramasındaki isabetlerin sadece küçük bir kısmı eser olarak göz ardı edilmelidir. Ancak, bu da büyük ölçüde hedefe bağımlı olacaktır.

Vuruş oranı önemli ölçüde daha düşükse, bu hedef proteinle ilgili aşağıdaki sorunlardan birini gösterebilir. Örneğin, viral sistein proteazlarına karşı bir CFS kampanyasında sadece% 3'lik bir isabet oranı gözlenmiştir (veriler gösterilmemektedir). Kullanılan proteinin aktif bölgesinde muhtemelen kimyasal olarak modifiye edildiği ortaya çıktı. Böyle bir durumda, farklı bir protein hazırlığı sorunu çözebilir. Kristaller çok DMSO intoleransı varsa, sonuçlar bir dereceye kadar farklı olsa da, F2X Giriş Ekranı DMSO olmadan da kullanılabilir. DMSO'nun varlığında elde edilen isabetlerin çoğu da yokluğunda görünecektir. DMSO'nun yokluğunda gözlemlenemeyen bazı isabetler de olacaktır, ancak varlığında gözlemlenebilirler. Ve son olarak, sadece DMSO'nun yokluğunda ortaya çıkanlar olacak.

En şiddetli zorluk, protein madde bağlanması üzerine indüklenmiş bir hareket geçirirse ortaya çıkar. Büyük olasılıkla, kristal kafes protein hareketini tolere etmeyecek ve kristaller parçalanacaktır. Böyle bir durumda, tek seçenek proteinin ve parçaların birlikte kristalleşmesine başvurmaktır. Ancak bu, yeni kristal formlarına yol açabilir. Bu nedenle, tüm sürecin otomasyonunun çoğu artık verimli bir şekilde çalışmayacak. Neyse ki, şimdiye kadar HZB'de yürütülen çoğu CFS kampanyasında, bu tür bir sorunla karşılaşılamamıştır. Bir parçanın zayıf bağlanması, özellikle kristalize konformasyon kristal paketleme kuvvetleri tarafından stabilize edilirse, bir protein hareketini teşvik etmek için yeterli enerji sağlamayabilir.

Yazarların şimdiye kadar karşılaştığı yöntemin bir başka ciddi sınırlaması, kristalizasyon kokteylinin (ve dolayısıyla ıslatma çözeltisinin) uçucu bileşikler içermesidir. Daha sonra tüm kristal işlemeyi anlamlı bir şekilde gerçekleştirmek imkansız hale gelir.

Farklı proteinler daha büyük veya daha az ölçüde ilaçlanabilir siteler içerebilir. Örneğin, protein-protein etkileşimleri genellikle hedeflen daha zor olan genişletilmiş düz yüzeyler tarafından aracılık edilir. Bu nedenle parça bağlama isabet oranı büyük olasılıkla proteinin moleküler yüzeyinin yapısına bağlı olacaktır. Aşırı bir durumda, bir protein parça bağlama için hedef bölge olarak hizmet veren uygun yüzey sıcak noktaları içermeyebilir. Bu nedenle, titizlikle gerçekleştirilen bir deneye rağmen, taramadan hiçbir parça isabeti sonuçlanmayacaktır. Ancak, yazarlar şimdiye kadar böyle bir durumla karşılaşmadı.

Prensip olarak, yukarıda belirtilen protokol kullanılarak, bir CFS kampanyasının kristal ıslatma ve hasat kısmı, kristal işleme için donatılmış herhangi bir laboratuvarda gerçekleştirilebilir. Bu, HZB'deki metodolojiyi diğer CFS tesislerinden ayırır ve bazı durumlarda bir avantaj olabilir. Örneğin, kristaller başka bir yerde kolayca yeniden üretilemezse veya deneycilerin seyahati sınırlıysa (örneğin, dünya çapında bir pandemi durumunda), HZB'deki kullanıcılara bu nedenle tüm ekipman (paklar, aletler, EasyAccess Frame, numune tutucular vb.) taşınabilir bir set olarak sağlanır.

Bununla birlikte, çok sayıda numune tutucu ve kriyojenik depolama kapasitesi gereksinimleri, özel CFS tesislerinde hala daha rahat karşılanmaktadır. Ayrıca, birçok kırınım veri setinin toplanması ihtiyacı, bu tesislerin yüksek numune verimine yönelik kiriş hatlarına yakın bir şekilde yerelleştirilmesini şiddetle savunur. Buna örnek olarak Diamond Light Source'daki I04-1 kiriş hatları ve^{İngiltere'deki}ilgili XChem tesisi 8^,25, Fransa'daki ESRF'deki MASSIF kiriş hatları^{26 veya İsveç'teki} MAX IV'teki BioMAX beamline'daki FragMAX tesisi^18.

Gelecekte, cfs deneylerinin tamamen kristal işlemeye gerek kalmadan tasarlanması öngörülebilir. Bu yöndeki ilk gelişmeler bildirilmiştir. Örneğin, hem kristal içeren çözeltilerin hem de parça çözeltilerinin doğrudan ağ tipi numune tutucuları üzerinde karıştırılmasına izin vererek akustik sıvı transferi^{ile 27}. XFEL tabanlı ligand taraması için başka bir yaklaşım kullanıldı. İlke kanıtı deneyinde, toplu olarak kristal bir bulamacı hazırlandı ve silikon sabit hedef çip²⁸üzerinde ıslatma ve kırınım veri toplama yapıldı. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar hala geliştirilmektedir ve çok çeşitli protein hedeflerine uygulanmaktan veya rutin olarak CFS tesisleri için uygulanabilir olmaktan uzaktır.

Bu çalışmadaki protokolle, CFS kampanyalarını HZB'de (ve başka yerlerde) doğrudan gerçekleştirmeye yönelik ayrıntılı talimatlar özetlenmiş ve genel rehberlik ve bu tür deneylerin başarı şansı daha yüksek olan hazırlanması ve yürütülmesinde yararlı uygulamalı ipuçları verilmiştir. Sonuç olarak, CFS taramasında daha iyi oranlar ve başarı oranları, takım bileşiklerinin veya ilaç adaylarının aşağı akış gelişimi için etkili bir başlangıç noktası sağlamaya büyük ölçüde katkıda bulunur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 ve mikro; L pipet	Eppendorf	EP3123000012
12 kanallı pipet, 100 & mikro; L	Eppendorf	EP4861000791
Fön makinesi	TH-Geyer	9.106 788
Kristal içeren kristalizasyon plakaları			Islatılacak kristaller içerir
Kristalizasyon inkübatörü			Kristalizasyon deneyi için sabit sıcaklık sağlar, HZB'de: 20 derece; C
Farklı açıklık boyutlarında Çift Kalınlıklı MicroLoops (LD)	MiTeGen	çeşitli, örneğin M5-L18SP-75LD	Protokol için gereken uygun boyutta 250 döngü, HZB  tarafından sağlanabilir;
EasyAccess Çerçeve	HZB		EasyAccess Çerçeve, HZB'de geliştirilen, birden fazla kristali işlemek için özel bir cihazdır (Barthel ve diğerleri, 2021).
F2X Giriş Ekran plakası	HZB		Geliştirilen F2X Giriş Ekranı (Wollenhaupt ve diğerleri, 2020)
Glas spot plaka	VWR	MARI1406506
Sıvı nitrojen			az doldurulmuş 5 L kutu
Sıvı nitrojen depolama kabı
kristal çubuk	MiTeGen	M-R-1013198
Mikroskoplar	Leica	n.a.MRC
3 lensli 96 kuyulu düşük profilli kristalizasyon plakası	SwissCI	3W96TLP-UVP	Sahte ıslatılmış kristaller için (isteğe bağlı)
Reaktif rezervuarı	Carl Roth	EKT6.1	25 ml hacim
Numune izleme şablonu			https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking. xlsx
Neşter	B. Braun	BA825SU
Mikrotitre plakaları için sızdırmazlık folyosu	GreinerBioOne	676070
Raflı disk nakliye bastonları (Unipucks için)	MiTeGen	M-CP-111-065	Alüminyumdan yapılmış 2 baston; HZB
Islatma çözümü ile sağlanabilir			En az 5 ml gereklidir
Kriyo koruyucu, 150 ve mikro içeren ıslatma solüsyonu; L			Yalnızca ıslatma solüsyonu zaten kriyo-koruyucu değilse gereklidir
Dokular	Roth (Kimberly Clark Professional)	AA64.1
Transport dewar (Whartington dry shipper)	MiTeGen	TW-CX100	2 unipuck bastonunun saklanması için 2 seyahat dewarları, alternatif olarak VHC35 veya benzeri tipte bir depolama dewarı kullanılabilir.
MiTeGen	M-CP-111-022	kapaklı Unipuck köpük dewarlar	özellikle protokolde açıklanan unipuck kullanımı için özellikle uygun iki köpük dewar SPINE diskleri kullanılıyorsa, farklı köpük dewarların uygulanması gerekebilir.
Unipuck başlangıç seti	MiTeGen	M-CP-UPSK001	HZB
Unipucks	tarafından sağlanabilir MiTeGen	M-CP-111-021	14 unipucks; HZB tarafından sağlanabilir