Lipid nanopartikülleri mRNA ve DNA kapsülleme için mikroakışkan karıştırma platformu yaklaşımı kullanılarak geliştirilmiştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mikroakışkan Karıştırma Platformu Kullanarak Gen Teslimatı için Lipid Nanopartiküllerinin Formülei ve Karakterizasyonsu
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Lipid bazlı ilaç taşıyıcıları, küçük boyutları, biyouyumlulukları ve yüksek kapsülleme verimlilikleri nedeniyle klinik ve ticari olarak mevcut doğum sistemleri için kullanılmıştır. Nükleik asitleri kapsüllemek için lipid nanopartiküllerinin (LNP) kullanılması, RNA veya DNA'yı bozulmaya karşı korurken hücresel alımı teşvik etmek için avantajlıdır. LNP'ler genellikle iyotlu lipid, yardımcı lipid, kolesterol ve polietilen glikol (PEG) konjuge lipid dahil olmak üzere birden fazla lipit bileşeni içerir. LNP'ler, düşük pH'da katyonik olan ve negatif yüklü RNA veya DNA ile komplekslenme sağlayan iyonizlenebilir lipid varlığı nedeniyle nükleik asitleri kolayca kapsülleyebilir. Burada LNP'ler, lipid bileşenlerinin organik bir fazda ve nükleik asit bileşeninin sulu bir fazda hızlı bir şekilde karıştırılması kullanılarak haberci RNA (mRNA) veya plazmid DNA'nın (pDNA) kapsüllenerek oluşturulur. Bu karıştırma, laminar akışı korurken nanopartikül kendi kendine montajına izin vererek hassas bir mikroakışkan karıştırma platformu kullanılarak gerçekleştirilir. Hidrodinamik boyut ve polidisperite dinamik ışık saçılımı (DLS) kullanılarak ölçülür. LNP üzerindeki etkili yüzey yükü, zeta potansiyeli ölçülerek belirlenir. Kapsülleme verimliliği, tuzaklanmış nükleik asidi ölçmek için floresan bir boya kullanılarak karakterize edilir. Temsili sonuçlar, bu yöntemin tekrarlanabilirliğini ve farklı formülasyon ve işlem parametrelerinin geliştirilen LNP'ler üzerindeki etkisini göstermektedir.
Giriş
İlaç taşıyıcıları, düşük sitotoksiklik, artan biyoyararlanlık ve gelişmiş stabilite1,2,3dahil olmak üzere tipik elverişli özelliklere sahip bir terapötik korumak ve sunmak için kullanılır. Polimerik nanopartiküller, miseller ve lipid bazlı parçacıklar daha önce nükleik asit kapsülleme ve teslimi için araştırılmıştır4,5,6,7. Lipitler, yüksek stabilite ile biyouyumlu oldukları için lipozomlar ve lipid nanopartiküller de dahil olmak üzere farklı nanoka....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Şekil 1 'de genel işlemin şeması verilmiştir.
1. Tamponların hazırlanması
NOT: Tamponların steril filtrelanması, nükleik asit ve LNP kalitesini etkileyebilecek partikülleri çıkarmak için burada şiddetle tavsiye edilir.
- Fosfat Tamponlu Tuzlu (PBS)
- Nükleaz içermeyen suda 8 mM Na2HPO4,2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl ve 2,7 mM KCl kullanarak 1x PBS hazırlayın ve pH'ı 7,4'e ayarlayın.
- 0,22 μm gözenek boyutunda bir filtre kullanarak vakum filtrasyonu ile sterilize edin.
- Sitrat Arabelleği
- Nükleo....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tekniğin tekrarlanabilirliğini göstermek için ayrı günlerde aynı lipit formülasyonuna ve 6 N/P oranına sahip birden fazla LNP grubu geliştirilmiştir. Toplu iş 1 ve 2, benzer polidispersiteye sahip boyut dağılımlarının çakışmasına neden oldu (Şekil 2A) İki farklı parti arasındaki boyut veya kapsülleme verimliliğinde önemli bir fark gözlenmedi (Şekil 2B). Kapsülleme verimliliği her parti için yüksekti (%>98,5) ve boyutlar 77 nm .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Tekrarlanabilirlik, hız ve düşük hacimli tarama, diğer mevcut yöntemlere (örneğin, lipid film hidrasyon ve etanol enjeksiyonu) kıyasla LNP'leri oluşturmak için mikroakışkan karıştırma kullanmanın önemli avantajlarıdır. Bu yöntemin tekrarlanabilirliğini, farklı LNP partileriyle gözlenen kapsülleme verimliliği veya partikül boyutu üzerinde hiçbir etkisi olmadan gösterdik. Bu, LNP'ler de dahil olmak üzere herhangi bir terapötik tedavinin klinik olarak kullanılabilir hale gelmesi için gerekli bir kriterdir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Tüm yazarlar Sanofi'nin çalışanlarıdır. Yazarlar, çıkar çatışması veya rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger ve Philip Zakas'a LNP gelişimine yönelik rehberlikleri ve katkıları için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-metoksipolietilen glikol-2000 (C-14 PEG) | Avanti Polar Lipidler | 880151P | |
| 10 & mikro; l Dereceli Filtre İpuçları (RNase-, DNase-, DNA içermez) | ABD Bilimsel | 1121-3810 | |
| 1000 & l Dereceli Filtre Uçları (RNase-, DNase-, DNA içermez) | USA Scientific | 1111-2831 | |
| 20 & l Eğimli Filtre Uçları (RNase-, DNase-, DNA içermez) | USA Scientific | 1120-1810 | |
| 200 & mikro; l Granül Filtre Uçları (RNase-, DNase-, DNA içermez) | USA Scientific | 1120-8810 | |
| 3β-Hidroksi-5-kolesten, 5-Kolesten-3β-ol (Kolesterol) | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| BD Slip Tip Steril Şırıngalar (1 ml şırınga) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Slip Tip Steril Şırıngalar (3 ml şırınga) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-436 | |
| BD Vacutainer Genel Kullanım Şırınga İğneleri (BD Künt Dolgu İğnesi 18G) | Thermo Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Tezgah Üstü Santrifüj | Beckman coulter | ||
| Siyah 96 kuyulu plakalar | Thermo Fisher Scientific | 14-245-177 | |
| BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA içermeyen mikrosantrifüj tüpleri (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 14-380-813 | |
| Sitrik Asit | Fisher Scientific | 02-002-611 | |
| Corning 500ml Vakum Filtresi / Saklama Şişesi Sistemi, 0.22 um gözenekli | Corning | 430769 | |
| Tek kullanımlık katlanmış kılcal hücreler | Malvern | DTS1070 | |
| Etil Alkol, Saf 200 geçirmez | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Fisher Marka Yarı Mikro Küvet | Termo Fisher Scientific | 14955127 | |
| Invitrogen Konik Tüpler (15 mL) (DNase-RNaz içermez) | Thermo Fisher Scientific | AM12500 | |
| MilliporeSigma Amicon Ultra Santrifüj Filtre Üniteleri | Thermo Fisher Scientific | UFC901024 | |
| NanoAssemblr Tezgah Üstü | Hassas Nanyosystems | ||
| Nükleaz içermeyen su | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
| Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Test Kiti | Thermo Fisher Scientific | P7589 | |
| Quant-iT RiboGreen RNA Test Kiti | Thermo Fisher Scientific | R11490 | |
| Sodyum Klorür | Fisher Scientific | 02-004-036 | |
| Sodyum Sitrat, Dihidrat, granül | Fisher Scientific | 02-004-056 | |
| SpectraMax i3x | Moleküler Cihazlar | ||
| Zetasizer Nano | Malvern |
Kaynaklar
- Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).
- Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
