Sendromla İlişkili Nörolojik Açıkların Aşağı Akış Modellemesi için Turner Sendromundan İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerin (45XO) Fetal Hücrelerinin Üretimi

Nivedha Veerasubramanian; Vaishnavi Karthikeyan; Sridevi Hegde; Anandh Dhanushkodi; Shagufta Parveen

doi:10.3791/62240

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Sendromla İlişkili Nörolojik Açıkların Aşağı Akış Modellemesi için Turner Sendromundan İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerin (45XO) Fetal Hücrelerinin Üretimi

2.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62240

⸱

4 Aralık 2021

Nivedha Veerasubramanian^*¹ , Vaishnavi Karthikeyan^*¹ , Sridevi Hegde² , Anandh Dhanushkodi¹ , Shagufta Parveen¹

¹Manipal Institute of Regenerative Medicine, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Karnataka, India-576104, ²Department of Medical Genetics, Manipal Hospitals

^* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, epizomal plazmidlerin nükleofeksiyon ile verilmesi yoluyla fetal doku fibroblastlarından entegrasyonsuz iPSC'lerin üretilmesini ve ardından iPSC karakterizasyonu ve nöronal farklılaşma için kullanılan yöntemlerin tanımlanmasını açıklar.

Özet

Kromozomal aneuploidiler merkezi sinir sistemi malformasyonları ve fetal ölüm de dahil olmak üzere şiddetli konjenital malformasyonlara neden olur. Prenatal genetik tarama tamamen tanısaldır ve hastalık mekanizmasını aydınlatmaz. Aneuploid fetüslerden gelen hücreler kromozomal aneuploidi taşıyan değerli biyolojik malzeme olmasına rağmen, bu hücreler kısa ömürlüdür ve aşağı akış araştırma deneyleri için kullanımlarını sınırlar. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) modellerinin üretilmesi, aneuploid özelliklerinin sürekli korunması için hücre hazırlamanın etkili bir yöntemidir. Embriyonik gelişimi anımsatan özel hücrelere kendi kendini yeniler ve ayırt ederler. Bu nedenle, iPSC'ler erken gelişim olaylarını incelemek için mükemmel araçlar olarak hizmet vermektedir. Turner sendromu (TS), tamamen veya kısmen eksik bir X kromozomu ile ilişkili nadir bir durumdur. Sendrom infertilite, kısa boy, endokrin, metabolik, otoimmün ve kardiyovasküler bozukluklar ve nöroknasitif kusurlar ile karakterizedir. Aşağıdaki protokol, fibroblastların TS (45XO) fetal dokudan izolasyonu ve kültleştirilmesini, epizomal yeniden programlanan plazmidlerin nükleofeksiyon ve ardından niteleme yoluyla entegrasyonsuz TSiPSC'lerin üretilmesini açıklamaktadır. Yeniden programlanan TSiPSC'ler başlangıçta canlı hücre alkali fosfataz boyama ve ardından pluripotency biyobelirteçler için kapsamlı problama ile tarandı. Seçilen koloniler mekanik olarak parçalandı, birkaç kez geçirildi ve daha fazla deney için kararlı kendini yenileyen hücreler kullanıldı. Hücreler pluripotency transkripsiyon faktörlerini ifade etti OCT4, NANOG, SOX2, hücre yüzey belirteçleri SSEA 4 ve TRA1-81 pluripotent kök hücrelere özgüdür. Orijinal 45XO karyotip, yeniden programlama sonrası tutuldu. TSiPSC'ler embriyoid cisimleri oluşturabildi ve endoderm, mezoderm ve ektoderm hücrelerine dönüşerek soyuna özgü biyobelirteçlere ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRIKÜLER AĞIR CHAINα/β), (βIII TUBULIN)) hücrelerine farklılaştı. Eksojen epizomal plazmidler kendiliğinden kaybedildi ve hücrelerde 15. Bu TSiPSC'ler Turner sendromu ile ilişkili nörokingtif açıklara neden olan kusurlu moleküler ve hücresel nörogelişim modellemek için değerli bir hücresel kaynaktır.

Giriş

Aneuploidiler insanlarda doğum kusurlarına/konjenital malformasyonlara ve gebelik kaybına yol açar. Gebelik kayıplarından elde edilen örneklerin ~%50-%70'inde sitogenetik anormallikler görülür. Gebelikte erken kaybedilen aneuploid embriyolar, insan embriyogenezini yakından temsil eden başka modeller geliştirme ihtiyacını artıran deneysel analizler için kolayca elde edilemez. Genetik bozukluk tanısı alan hücrelerden elde edilen indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler), temsili genetik düzensizliklerive fetal gelişim 1 , 2^,³^,⁴üzerindeki sonuçları modellemek iç....