Yöntem makalesi

Umut Verici Bir İlaç Dağıtım Sistemi Olarak Faz Değişimli Dimetildioktadeilamonyum Kabuklu Mikro Damlacıklar: Memeli Tümör Hücrelerinin 3D Sferoidleri Üzerine Sonuçlar

DOI:

10.3791/62255

⸱

14 Mart 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical Sciences and Technologies, University of Rome Tor Vergata, 2Department of Molecular Medicine, Sapienza University of Rome

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir dimetildioktadesilamonyum bromür kabuğu ile geliştirilen dekafloropentan mikro damlacıklar, olağanüstü bir kolloidal stabilite ve aktraktif bir biyoarayüz sergiledi. DDAB-MD'lerin, insan üçlü negatif meme kanserine karşı Doksorubisin'in gelişmiş alımı ve antitümör aktivitesi ile birlikte plazma membranlarına yüksek afinite ile karakterize edilen etkili ilaç rezervuarları olduğu kanıtlanmıştır (MDA-MB-231) 3D modeli.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geniş teranostik senaryoda faz değişimli perflorokarbon mikro damlacıkların (MD'ler) önemli ölçüde iyileştirilmesi, MD'lerin bileşiminin sentez verimliliği, stabilite ve ilaç verme kabiliyeti açısından optimizasyonundan geçer. Bu amaçla, bir dimetildioktadesilamonyum bromür (DDAB) katyonik yüzey aktif madde kabuğu ile stabilize edilmiş dekafloropentan (DFP) MD'ler tasarlanmıştır. Darbeli yüksek güçlü insonasyon ile birkaç saniye içinde yüksek konsantrasyonda DDAB-MD'ler kolayca elde edildi ve bu da düşük polidispers 1 μm boyutlu damlacıklar ile sonuçlandı. DDAB kabuğunun uzun, doymuş hidrokarbon zincirleri ile birlikte yüksek pozitif ζ potansiyeli, damlacığı ve içindeki ilaç yükünü stabilize etmek için anahtar faktörlerdir. DDAB kabuğunun hücre plazma membranı ile yüksek afinitesi, tümör hücresi arayüzündeki ilaç konsantrasyonunu artırarak ve alımı artırarak lokalize kemoterapötiklerin verilmesine izin verir. Bu, DDAB-MD'leri çok düşük ilaç dozlarında yüksek antitümör aktivitesi sergileyen ilgili bir ilaç dağıtım aracına dönüştürecektir.

Bu çalışmada, böyle bir yaklaşımın etkinliğinin, doksorubisinin memeli tümör hücrelerinin 3D sferoidlerine (MDA-MB-231) karşı etkisini önemli ölçüde iyileştirdiği gösterilmiştir. Çok hücreli tümör sferoidleri (yani, küresel bir şekilde yoğun şekilde paketlenmiş hücreler) şeklinde geliştirilen üç boyutlu (3D) hücre kültürlerinin kullanımı, 2D hücre kültürlerine kıyasla çok sayıda avantaja sahiptir: geleneksel in vitro çalışmalar ile hayvan testleri arasındaki boşluğu doldurma potansiyeline sahip olmasının yanı sıra, daha öngörücü in vitro gerçekleştirme yeteneğini geliştirecektir klinik öncesi ilaç geliştirme için tarama testleri veya endikasyon dışı ilaçların potansiyelini ve yeni ortak hedefleme stratejilerini değerlendirin.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek antitümör etkinliği sağlayabilen ve yan etkileri azaltabilen ilaç dağıtım vektörleri, ciddi bir kimyasal-farmasötik zorluk olmaya devam ederken birincil hedeflerdir 1,2. Bugüne kadar, ilerlemeleri ilk başta yetersiz yerinde ilaç salınımı ve kritik düzeyde spesifik olmayan toksisite 3,4,5 ile sınırlıdır. Son yıllarda, lipozomlar, polimerik miseller, polimeromlar 6,7,8,9,10 dahil olmak üzere antikanser ajanların uygulanmasını iyileştirmek için çeşitli ilaç dağıtım sistemleri uygulanmıştır. Bu sistemler, sağlıklı organ ve dokulardaki dağılımı ve birikimi azaltırken, ilaçların dolaşım süresini ve seçiciliğini artırmada potansiyel göstermektedir. Her neyse, antrasiklinler gibi antineoplastik kemoterapi ilaçlarının kapsüllenmiş formülasyonları, ilaç içselleştirme verimliliğinin önemli ölçüde azalmasına yol açmıştır. Son zamanlarda, mikro kabarcıklar11, mikro damlacıklar, hibrit altın nanopartiküller12, nano-hidrojeller13, PLGA iskeleleri ve mezogözenekli platformlar14 gibi uyaranlara duyarlı mikron ve mikron altı taşıyıcılar, doksorubisin (Dox) ve dosetaksel kullanarak tümör inhibitör etkileri hedefleme ve uygulamadaki yüksek çok yönlülükleri nedeniyle farmakolojik ilgi görmektedir. Bu taşıyıcıları multimodal görevler (yani kemoterapötik, fototermal ve gen sinerjik yaklaşımlar) ve moleküler görüntüleme15 için verimli antikanser askerlerine dönüştürmek için yapılan öncü deneyler, kişiselleştirilmiş teranostik nanotıbbın yolunu açmıştır.

Bu senaryoda, faz değişimli perflorokarbon mikro damlacıklar (MD'ler), yüksek ilaç kargo yüklemesini, biyolojik engelleri ele alan MD kabuğunun kimyasal çok yönlülüğünü, kolloidal stabiliteyi ve sentez verimliliğini bir araya getirmek için sundukları temel fırsat aracılığıyla değerlendirilmiştir11,12. Ek bir varlık olarak, perflorokarbon (PFC) çekirdeğinin akustik veya optik buharlaşması ile desteklenen MD'lerin ekojenitesi, yerinde görüntüleme ve umut verici terapötik etkinlik elde edilmesini sağlar. Ayrıca, iyonlaştırıcı parçacık demetlerinin enerji salınımı ile elde edilen MD'lerin çekirdek buharlaşması, ışın izleme ve radyasyon dozimetrisi için kullanılabilir.

Bu çalışma, çoklu kullanılabilir bir dimetildioktadezilamiyum bromür (DDAB) katyonik yüzey aktif madde kabuğu ile stabilize edilmiş dekafloropentan (DFP) mikro damlacıklarının geliştirilmesi amaçlanmıştır. DDAB kabuklu MD'ler hem fiziko-kimyasal hem de biyolojik beklentileri karşılar. DFP bazlı mikro damlacıkların, biyouyumlu ve stabil perflorokarbon MD'ler16 elde etmek için değerli faz değiştiren kontrast maddeleri olduğu gösterilmiştir. DDAB kristal jel, uzun zincirleri fizyolojik sıcaklıkta doyurur, hidrofobik çekirdeğe derinlemesine nüfuz eder, damlacığı ve içindeki ilaç yükünü stabilize eder. Ayrıca, su arayüzündeki yüksek pozitif ζ potansiyeli, MD'lerin kolloidal stabilitesini arttırır. DDAB kabuk yüzeyinin biyolojik çekiciliği, memeli hücrelerini zar zor etkileyen konsantrasyonlarda bakteri ve mantarların ölümüne neden olma ve plazma zarlarını, negatif yüklü antijenik proteinleri, nükleotidleri, DNA'yı veya nanopartikülleri bağlama yeteneğinde yatmaktadır. Yukarıda belirtilen özellikler, memeli hücreleri içinde dikkate değer bir immünoadjuvan, gen terapisi ve antitümör etkisi oluşturmak için kullanılabilir17.

Burada açıklanan dox yüklü DDAB-MD'ler (Dox@DDAB-MD'ler), oldukça agresif, invaziv ve kötü farklılaşmış üçlü negatif meme kanseri hücrelerine karşı ilaç salınımını teşvik eder. Tek adımlı bir formülasyonda yüksek Dox yükleme verimliliği ile dar bir boyut dağılımına sahip kararlı ve yüksek yoğunluklu DDAB-MD'ler elde etmek için yüksek güçlü prob sonlamasına dayalı basit ve hızlı bir protokol aşağıda açıklanmıştır. Bu özellikler, mikroakışkan cihazlar ve yüksek parçalayıcılı homojenizatörler gibi diğer hazırlama yöntemleri için bile rekabetçidir16.

Etkili ilaç dağıtım vektörlerinin tasarlanmasındaki diğer önemli sınırlayıcı konu, bir ilacın aktivitesinin, tek katmanlı hücre modelleri tarafından dikkate alınamayan, gerçek bir biyolojik hedefte elde edilebilen çeşitli parametrelerin (örneğin, absorpsiyon, dağılım, konsantrasyonlar) bir fonksiyonu olmasıdır18. Bu nedenle, yeni antitümör formülasyonlarının gelişim tarihi, ne yazık ki hayvanlarda klinik öncesi modeller düzeyinde etkisiz olduğu sonuçlanan in vitro çalışmalarla doludur19.

Özellikle, hücre kültürlerinden in vivo ve ex vivo çalışmalardan daha karmaşık ve güvenilir bir sisteme geçme ihtiyacı, 2D kültürler üzerindeki farmakolojik çalışmaların doğal sınırlamaları ile bağlantılıdır. Bu bağlamda, 2D tek katmanlardan daha karmaşık yapıların morfolojisini, aktivitesini ve fizyolojik tepkisini simüle eden sferoidler, organoidler, çip üzerinde organ gibi in vitro 3D sistemler dahil edilmiştir20. Klinik öncesi bir bakış açısına göre, hücresel mikro çevreyi taklit eden 3D hücre modelleri, geleneksel tek katmanlı kültürlerin etkili olmadığı fizyolojik olarak daha uygun bir çerçevede karmaşık biyolojiyi daha iyi anlama imkanı sunar21,22.

DDAB-MD'lerin insan meme kanseri hücrelerinin hücre zarı ile etkileşime girebileceğini, çok düşük (nanomolar) Dox konsantrasyonunda ilaç içselleştirmesini ve hücre ölümünü destekleyebileceğini kanıtladıktan sonra, bu tür bir metodolojinin memeli tümör hücrelerinin 3D sferoidlerine karşı etkinliği test edilmiştir, MDA-MB-231, test edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Tüm reaktifler ve aletler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Mikro damlacıkların üretilmesi ve karakterize edilmesi

  1. Dox yüklü DDAB-MD'leri hazırlama
    1. 10 mM'lik bir nihai konsantrasyon ve 1 mL'lik bir nihai hacim elde etmek için DDAB tozunu etanol içinde çözün. 2 mg Dox tozunu etanol içinde çözerek 1 mL Dox stok çözeltisi hazırlayın.
      DİKKAT: Dox'un akut oral toksisite, kategori 4 ve kanserojenlik, kategori 1B'ye sahip olduğu bilinmektedir. Sadece eldiven ve sağlık maskesi ile çeker ocak altında kullanın.
    2. 15 mL'lik plastik dereceli santrifüj tüpünde 300 μL DDAB çözeltisine (yağ fazı) 250 μL DFP ekleyin.




    4. figure-protocol-1




  2. figure-protocol-2

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dox@DDAB-MD'ler, Şekil 1'de şematik olarak açıklandığı gibi protokole (Bölüm 1) göre geliştirilmiştir. Elde edilen MD'ler, DFP çekirdeğini kapsülleyen tek katmanlı bir DDAB'den yapılmıştır (Şekil 1A). DDAB'ın katyonik yükü ve sonikasyon prosedürü, DFP ve su arayüzünde23 yığılmış DDAB çok katmanlı katmanların oluşumunu önler.

CLSM mikrografı (Şekil 1B), ortalama çap...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antrasiklinlerin antitümör ilaçlar olarak etkinliğini arttırmak için bu çalışma, kemoterapötik ilaç doksorubisin (Dox) ile kapsüllenen DDAB kabuklu PFC damlacıklarının oluşumunu ve yüksek agresif üçlü negatif meme kanseri hücreleri MDA-MB-231 ile etkileşime giren bu formülasyonun etkisini sunmaktadır.

DOX@DDAB-MD'lerin oluşturulması
Dox yüklü MD'ler, son derece hızlı, iyi tekrarlanabilir, kullanıcı dostu ve verimli bir protokol ile insonasy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması: Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

İnsan/Hayvan Hakları: Bu makale, yazarlardan herhangi biri tarafından insan veya hayvan deneklerle yapılan herhangi bir çalışmayı içermemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, AMPHORA (766456) hibe sözleşmesi kapsamında Avrupa Birliği Horizon 2020 araştırma ve yenilik programından fon almıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
&mikro;-Petri kabıIbidi8115635mm yükseklikte, IbiTreat
1,1,1,2,3,4,4,5,5,5-DekafloropentanSigma-Aldrich138495-42-8b.p. 55° C
12 oyuklu kültür plakasıCorning
15 ml santrifüj tüpüFalcon89039-664
3D-Petri kapları 12:256Mikro dokular (Sigma-Aldrich)Z764000-6EAKüçük
3D-Petri kapları 12:81Mikro dokular (Sigma-Aldrich)Z764019-6EABüyük
%5 CO2 kültür inkübatörü, 37 derece; CThermo ScienificHERAcell 150i
50 ml santrifüj tüpüFalcon352070
Biyolojik güvenlik kabini, II seviye
CalceinSigma-Aldrich
Calcein-Sigma-Aldrich148504-34-1Instruments'ta
4mM
Santrifüj Hettich Universal 320RHettich Lab. Teknolojisi
DAPISIgma-Aldrich
Dimetildioktadesilamonyum bromür tozuSigma-Aldrich3700-67-2
DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı)Corning15-013-CV
Doksorubisin hidroklorürSigma-Aldrich25316-40-9
DPBS (Dulbecco'nun Modifiye PBS'si)Corning21-030-CVpH 7,4
Etanol %70Sigma-Aldrich
EZ-C1 dijital ecliplseNikon Instruments Silverversiyon 3.91
Fetal Sığır Serumu (FBS)Corning35-079-CV
Gonyometre BI-200SMBrookhaven Instruments Corporations
Lazer Ar+ Spectra Fizik Lazer
He-NeMelles-Griot
L-GlutaminCorning25-005-CI
Mikroskop Nikon Eclipse TiNikon Instruments
MDA-MB 231 hücre hattıATCC
Microsoft ExcelMicrosoft
Mikroplaka okuyucu SparkTecan grup
NanoZetaSizer ZSMalvern Instruments LTD
Neubauer geliştirilmiş hazne718605
NIS Elements yazılımıNikon InstrumentsAR 4.30
Kalem / StreptoCorning30-002-CI
Fotokorelatör BI-9000 ATBrookhaven Instruments Corporations62927-1
Fotometre HC120Brookhaven Instruments CorporationsN° 1275
Pipetatörler ve uçlar, çeşitli boyutlardaGilson
Propidium İyodürSIgma-Aldrich
Serolojik pipetler, çeşitli boyutlardaCorning
Katı hal lazeriSuwtech LazerN° 22368
T25 ŞişelerSarstedt83.3910.002
T75 ŞişelerSarstedt83.3911.002
Tripsin/EDTA %0.05EuroCloneECB3052D
Vibra-Cell VCX-400Sonics & Malzemeler, inc
Su banyosu37 derece; Ç
DMSO cam sCMOS Andor Zyla 4.2 Andor stok çözümü

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aryal, S., Park, H., Leary, J. F., Key, J. Top-down fabrication-based nano/microparticles for molecular imaging and drug delivery. International Journal of Nanomedicine. 14, 6631-6644 (2019).
  2. Peng, Y., et al. Research and development of drug delivery systems based on drug transporter and nano-formulation. Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 15, 220-236 (2020).
  3. Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: Where they stand. Cell Death and Disease. 3, 411(2012).
  4. Raj, S., Franco, V. I., Lipshultz, S. E. Anthracycline-induced cardiotoxicity: A review of pathophysiology, diagnosis, and treatment. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16, 315(2014).
  5. Iyer, A. K., Singh, A., Ganta, S., Amiji, M. M. Role of integrated cancer nanomedicine in overcoming drug resistance. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 1784-1802 (2013).
  6. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nature Biotechnology. 33, 941-951 (2015).
  7. Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: An emerging treatment modality for cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 7, 771-782 (2008).
  8. Lammers, T., Hennink, W. E., Storm, G. Tumour-targeted nanomedicines: Principles and practice. British Journal of Cancer. 99, 392-397 (2008).
  9. Couvreur, P., et al. Polycyanoacrylate nanocapsules as potential lysosomotropic carriers: preparation, morphological and sorptive properties. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 31, 331-332 (1979).
  10. Yordanov, G. G., Dushkin, C. D. Preparation of poly(butylcyanoacrylate) drug carriers by nanoprecipitation using a pre-synthesized polymer and different colloidal stabilizers. Colloid and Polymer Science. 288, 1019-1026 (2010).
  11. Kooiman, K., Vos, H. J., Versluis, M., De Jong, N. Acoustic behavior of microbubbles and implications for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 72, 28-48 (2014).
  12. Fasolato, C., et al. Antifolate SERS-active nanovectors: Quantitative drug nanostructuring and selective cell targeting for effective theranostics. Nanoscale. 11, 15224-15233 (2019).
  13. Cerroni, B., et al. Temperature-tunable nanoparticles for selective biointerface. Biomacromolecules. 16, 1753-1760 (2015).
  14. Chronopoulou, L., et al. PLGA based particles as "drug reservoir" for antitumor drug delivery: characterization and cytotoxicity studies. Colloids Surfaces B: Biointerfaces. 180, 495-502 (2019).
  15. Calderó, G., Paradossi, G. Ultrasound/radiation-responsive emulsions. Current Opinion in Colloid and Interface Science. 49, 118-132 (2020).
  16. Capece, S., et al. Complex interfaces in 'phase-change' contrast agents. Physical Chemistry Chemical Physics. 18, 8378-8388 (2016).
  17. Mielczarek, L., et al. In the triple-negative breast cancer MDA-MB-231 cell line, sulforaphane enhances the intracellular accumulation and anticancer action of doxorubicin encapsulated in liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 558, 311-318 (2019).
  18. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230, 16-26 (2015).
  19. Heinonen, T. Better science with human cell-based organ and tissue models. Alternatives to Laboratory Animals. 43, 29-38 (2015).
  20. Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. 3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 29-41 (2014).
  21. Astashkina, A., Grainger, D. W. Critical analysis of 3-D organoid in vitro cell culture models for high-throughput drug candidate toxicity assessments. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 1-18 (2014).
  22. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
  23. Feitosa, E., Karlsson, G., Edwards, K. Unilamellar vesicles obtained by simply mixing dioctadecyldimethylammonium chloride and bromide with water. Chemistry and Physics of Lipids. 140, 66-74 (2006).
  24. Cancerrxgene. Doxorubicin IC50. Genomics of drug sensitivity in cancer. , Available from: https://www.cancerrxgene.org/compound/Doxorubicin/133/overview/ic50 (2020).
  25. Boo, L., et al. Phenotypic and microRNA transcriptomic profiling of the MDA-MB-231 spheroid-enriched CSCs with comparison of MCF- 7 microRNA profiling dataset. PeerJ. 2017, 1-27 (2017).
  26. Domenici, F., Castellano, C., Dell'unto, F., Congiu, A. Temperature-dependent structural changes on DDAB surfactant assemblies evidenced by energy dispersive X-ray diffraction and dynamic light scattering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 95, 170-177 (2012).
  27. Choosakoonkriang, S., et al. Infrared spectroscopic characterization of the interaction of cationic lipids with plasmid DNA. Journal of Biological Chemistry. 276, 8037-8043 (2001).
  28. Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
  29. Lentacker, I., Geers, B., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Design and evaluation of doxorubicin-containing microbubbles for ultrasound-triggered doxorubicin delivery: Cytotoxicity and mechanisms involved. Molecular Therapy. 18, 101-108 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Faz De i tiren Mikrodamlac klarDimetildioktadesilamonyum KabukPerflorokarbon Mikrodamlac klar3 Boyutlu T m r SferoidleriDoksorubisin letimiok H creli T m r SferoidleriKatyonik S rfaktanPreklinik la Geli tirme
Video yakında

İlgili makaleler