Minimum numune ancak maksimum otomasyon modunda NMR tabanlı parça taraması

Summary

NMR ile fragman tabanlı tarama, küçük molekül bağlayıcılarını biyomakromoleküllere (DNA, RNA veya proteinler) hızlı bir şekilde tanımlamak için sağlam bir yöntemdir. Otomasyon tabanlı numune hazırlama, NMR deneyleri ve elde etme koşulları ve analiz iş akışlarını açıklayan protokoller sunulmaktadır. Bu teknik, tespit için hem ¹H hem de ¹⁹F NMR-aktif çekirdeklerin optimum şekilde kullanılmasına izin verir.

Abstract

Fragman tabanlı tarama (FBS), hem akademide hem de endüstride ilaç keşif sürecinde iyi doğrulanmış ve kabul görmüş bir kavramdır. NMR tabanlı fragman taramasının en büyük avantajı, sadece 7-8 afinite büyüklüğünün üzerindeki bağlayıcıları tespit etmekle kalmayıp, aynı zamanda parçaların saflığını ve kimyasal kalitesini izlemek ve böylece yüksek kaliteli isabetler ve minimum yanlış pozitifler veya yanlış negatifler üretmek için de yeteneğidir. FBS içindeki bir ön koşul, parça kütüphanesinin ilk ve periyodik kalite kontrolünü yapmak, ilgili tamponlardaki parçaların çözünürlüğünü ve kimyasal bütünlüğünü belirlemek ve çeşitli makromolekül hedef sınıflarını (proteinler / RNA / DNA) barındırmak için çeşitli iskeleleri kapsayacak şekilde çoklu kütüphaneler oluşturmaktır. Ayrıca, numune miktarları, biyolojik yapı/fragman-uzay düzeyinde, koşul-uzayda (tampon, katkı maddeleri, iyonlar, pH ve sıcaklık) ve ligand-uzayda (ligand analogları, ligand konsantrasyonu) elde etme ve analiz hızı açısından kapsamlı bir NMR tabanlı tarama protokolü optimizasyonu gereklidir. En azından akademide, bu tarama çabaları şimdiye kadar çok sınırlı bir şekilde manuel olarak gerçekleştirilmiş ve bu da sadece ilaç geliştirme sürecinde değil, aynı zamanda kimyasal prob geliştirme bağlamında da tarama altyapısının sınırlı mevcudiyetine yol açmıştır. Gereksinimlerin ekonomik olarak karşılanabilmesi için gelişmiş iş akışları sunulmaktadır. Sıvı numune toplamanın sıcaklık kontrollü bir şekilde NMR tüplerine otomatik bir şekilde doldurulabildiği en son teknoloji ürünü gelişmiş donanımdan yararlanırlar. ¹H / ¹⁹F NMR ligand bazlı spektrumlar daha sonra belirli bir sıcaklıkta toplanır. Yüksek verimli numune değiştirici (HT numune değiştirici), sıcaklık kontrollü bloklarda 500'den fazla numuneyi işleyebilir. Bu, gelişmiş yazılım araçlarıyla birlikte veri toplama ve analizini hızlandırır. Ayrıca, tarama rutinlerinin protein ve RNA örnekleri üzerinde uygulanması, biyomakromoleküler araştırmalarda geniş bir kullanıcı tabanı için belirlenmiş protokollerin farkında olmak için açıklanmaktadır.

Introduction

Fragman bazlı tarama, proteinler, DNA ve RNA dahil olmak üzere makromoleküler hedeflere zayıf bağlanma gösteren oldukça basit ve düşük moleküler ağırlıklı molekülleri (MW <250 Da) tanımlamak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Birincil ekranlardan gelen ilk isabetler, isabetlerin ticari olarak temin edilebilen daha büyük analoglarının ikincil bir ekranını yürütmek ve daha sonra kimya tabanlı parça büyümesi veya bağlantı stratejilerini kullanmak için temel oluşturur. Başarılı bir fragman tabanlı ilaç keşif (FBDD) platformu için, genel olarak, zayıf isabetleri tespit etmek ve karakterize etmek için sağlam bir biyofiziksel yöntem, bir parça kütüphanesi, bir biyomoleküler hedef ve takip kimyası için bir strateji gereklidir. İlaç keşif kampanyalarında yaygın olarak uygulanan dört biyofiziksel yöntem, termal kayma testleri, yüzey plazmon rezonansı (SPR), kristalografi ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisidir (NMR).

NMR spektroskopisi, FBDD'nin farklı aşamalarında çeşitli roller göstermiştir. Optimize edilmiş bir tampon sistemde çözünmüş bir fragman kütüphanesindeki parçaların kimyasal saflığını ve çözünürlüğünü sağlamanın yanı sıra, ligand gözlemlenen NMR deneyleri, düşük afiniteli bir hedefe parça bağlanmasını tespit edebilir ve hedef gözlemlenen NMR deneyleri, parçanın bağlanma epitopunu tanımlayabilir, böylece ayrıntılı yapı-aktivite ilişkisi çalışmalarına olanak tanır. Epitop haritalamasında, NMR tabanlı kimyasal kayma değişiklikleri sadece ortosterik bağlanma bölgelerini değil, aynı zamanda şifreli olabilecek ve sadece biyomoleküler hedefin uyarılmış konformasyonel durumlarında erişilebilen allosterik bölgeleri de tanımlamakla kalmaz. Biyomoleküler hedef zaten endojen bir ligandı bağlarsa, tanımlanan fragman vuruşları, NMR tabanlı rekabet deneyleri yapılarak kolayca allosterik veya ortosterik olarak sınıflandırılabilir. Ligand-hedef etkileşiminin ayrışma sabitinin (K_D) belirlenmesi, FBDD sürecinde önemli bir husustur. NMR bazlı kimyasal kayma titrasyonları, ligand veya gözlemlenen hedef, K_D'yi belirlemek için kolayca gerçekleştirilebilir. NMR'nin en büyük avantajı, etkileşim çalışmalarının çözelti içinde ve fizyolojik koşullara yakın bir yerde yapılmasıdır. Böylece, hedefi ile ligand / fragman etkileşiminin analizi için tüm konformasyonel durumlar araştırılabilir. Ayrıca, NMR tabanlı yaklaşımlar sadece iyi katlanmış çözünür proteinlerin taranmasıyla sınırlı değildir, aynı zamanda DNA, RNA, membrana bağlı ve içsel olarak düzensiz proteinler¹ dahil olmak üzere daha büyük hedef alanı barındırmak için de uygulanmaktadır.

Parça kütüphaneleri FBDD sürecinin vazgeçilmez bir parçasıdır. Genel olarak, fragmanlar, sonunda biyolojik bir hedef için geliştirilen yeni inhibitörün bir parçası (altyapısı) haline gelen ilk öncüller olarak hareket eder. Bazı ilaçların (Venetoclax², Vemurafenib³, Erdafitinib⁴, Pexidartnib⁵) fragman olarak başladığı ve günümüzde kliniklerde başarıyla kullanıldığı bildirilmiştir. Tipik olarak, fragmanlar yüksek sulu çözünürlük ve stabiliteye sahip düşük moleküler ağırlıklı (<250 Da) organik moleküllerdir. Tipik olarak birkaç yüz parça içeren özenle hazırlanmış bir parça kütüphanesi, kimyasal alanın verimli bir şekilde araştırılmasını vaat edebilir. Parça kütüphanelerinin genel bileşimi fazla mesai içinde evrimleşmiştir ve çoğu zaman bilinen ilaçların daha küçük parçalara ayrılmasıyla veya hesaplamalı olarak tasarlanmasıyla türetilmiştir. Bu çeşitli parça kütüphaneleri esas olarak düz aromatik veya heteroatomlar içerir ve 5 6'nın Lipinski Kuralına veya 3 ^7'nin mevcut ticari eğilim Kuralına uyar, ancak reaktif gruplardan kaçının. Bazı parça kütüphaneleri de yüksek oranda çözünür metabolitlerden, doğal ürünlerden ve veya bunların türevlerinden türetilmiş veya bunlardan oluşmuştur⁸. Parça kütüphanelerinin çoğunun ortaya koyduğu genel bir zorluk, aşağı akış kimyasının kolaylığıdır.

Frankfurt Goethe Üniversitesi'ndeki Biyomoleküler Manyetik Rezonans Merkezi (BMRZ), biyokimyasal ve biyomedikal araştırmaların tüm alanlarından tüm Avrupalı araştırmacılar için yapısal araştırma altyapıları konsorsiyumu olan iNEXT-Discovery'nin (Transformeral research-Discovery için NMR, EM ve X-ışınları için altyapı) ortağıdır. iNEXT'in 2019 yılında sona eren bir önceki girişimi kapsamında, geniş bir kimyasal alanı kapsayan "minimum parça ve maksimum çeşitlilik" hedefiyle 768 parçadan oluşan bir fragman kütüphanesi hazırlanmıştı. Ayrıca, diğer parça kütüphanelerinden farklı olarak, iNEXT parça kütüphanesi de karmaşık, yüksek afiniteli ligandların aşağı akış sentezini kolaylaştırmak amacıyla "hazır parçalar" kavramına dayanarak tasarlanmıştır ve bundan böyle kurum içi kütüphane olarak bilinir (Diamond, Structural Genomic Consortium ve iNEXT).

FBDD'nin NMR tarafından kurulması insan gücü, bilgi ve enstrümantasyon gerektirir. BMRZ'de, NMR tarafından parça taramasına teknik yardımı desteklemek için optimize edilmiş iş akışları geliştirilmiştir. Bunlar arasında parça kütüphanesi ^9'un kalite kontrolü ve çözünürlük değerlendirmesi, seçilen hedefler için tampon optimizasyonu, ¹H veya ¹⁹F- gözlemlenen 1D-ligand tabanlı tarama, ortosterik ve allosterik bağlanma arasında ayrım yapmak için rekabet deneyleri, epitop haritalaması için 2D tabanlı hedef gözlemlenen NMR deneyleri ve ilk parça isabetlerinin ikincil türev setiyle etkileşimi karakterize etmek için yer almaktadır. BMRZ, daha önce literatür ^10,11'de de tartışıldığı gibi, küçük molekül-protein etkileşimlerinin analizi için otomatik rutinler oluşturmuştur ve NMR tabanlı fragman taraması için gerekli tüm otomatik altyapıya sahiptir. Çok çeşitli afinite rejimlerindeki parçaları tanımlamak için doygunluk transfer farkı NMR (STD-NMR), su-ligandı (waterLOGSY) ve Carr-Purcell-Meiboom-Gill tabanlı (CPMG tabanlı) gevşeme deneylerinin yanı sıra ilaç keşfi için son teknoloji ürünü otomatik NMR enstrümantasyonu ve yazılımı uygulamıştır. NMR bazlı fragman taraması proteinler için iyi kurulmuş olsa da, bu yaklaşım RNA ve DNA ile etkileşime giren yeni ligandları bulmak için daha az yaygın olarak kullanılmaktadır. BMRZ, küçük molekül-RNA / DNA etkileşimlerinin tanımlanmasını sağlayan yeni protokoller için kavram kanıtı oluşturmuştur. Bu katkının ilerleyen bölümlerinde, protein ve RNA örnekleri üzerinde tarama rutinlerinin uygulanmasının, biyomakromoleküler araştırmalarda geniş bir kullanıcı tabanı için belirlenmiş protokollerin farkında olduğu bildirilmektedir.

Protocol

1. Parça kütüphanesi

1. Şirket içi parça kütüphanesi
   NOT: iNEXT'in ortak araştırma faaliyetlerinden biri çerçevesinde, sağlam ve aşağı akış kimya dostu birinci nesil parça kütüphanesi geliştirildi¹² ve daha sonra Enamine ile işbirliği içinde ikinci nesil kütüphane bir araya getirildi ve DSI (Diamond-SGC-iNEXT) - hazır parça kütüphanesi (bundan böyle "Kurum içi kütüphane" olarak adlandırılacak) olarak biliniyor. Bu kütüphane tarama amacıyla BMRZ'de kullanıma sunulabilir.
   1. Daha önce bildirilen NMR tabanlı protokol^9'u kullanarak parça kitaplığını bütünlüğü ve çözünürlüğü açısından değerlendirin.
      NOT: Kurum içi kütüphane çok yüksek kimyasal çeşitliliğe sahip 768 parçadan oluşmaktadır (>200 Singleton). Taramanın parça karışımlarında yapılması, tarama kampanyasını önemli ölçüde hızlandırabilir; Bununla birlikte, bir karışımdaki parçaların sayısı, ¹H-NMR spektrumundaki sinyal çakışması nedeniyle sınırlıdır. Şirket içi kütüphane tarafından sunulan daha yüksek kimyasal çeşitlilik, ¹H gözlemlenen NMR spektrumlarında önemli bir kimyasal kayma çakışması olmadan 12 farklı parça içeren karışımların hazırlanmasına izin verir.
   2. 768 parça içindeki 103 parça bir flor atomuna sahiptir. ¹⁹F tarama amacıyla, bir flor grubuna sahip 103 parçanın tümünü, minimum ¹⁹F kimyasal kayma örtüşmesine dayanarak 5 karışıma bölün. ¹⁹F taramada sinyal çakışmasını en aza indirmek için, maksimum parça sayısına ve minimum sinyal örtüşmesine sahip karışımlar tasarlamak için tek bileşik ölçümlerinden kimyasal kayma bilgilerini kullanın. Her karışım, parçaların açık bir şekilde atanmasına izin veren farklı ¹⁹F kimyasal kaymalara sahip 20-21 parçaya sahiptir.
2. Kullanıcı tanımlı/sağlanan parça kitaplığı
   1. Kullanıcı tarafından tanımlanan veya sağlanan parça kütüphanesi ile tarama kampanyaları gerçekleştirmek; ancak, aşağıdaki adımların tarama kampanyasından önce gelmesi gerekir.
   2. Kullanıcı tarafından önceden belirtilmemişse, parçaların NMR tabanlı kalite kontrolünü gerçekleştirin (BMRZ'de bunun için gelişmiş yazılım araçları kullanılır; ⁹, Bölüm 6.1.1).
   3. Kullanmadan önce biyomoleküler hedef, yapı bütünlüğü ve fragmanların konsantrasyonu için parçaların tercih edilen tampondaki çözünürlüğünü kontrol edin.
   4. Karışımı, hem NMR spektrumlarındaki sinyal çakışmasını hem de ölçüm süresini azaltacak şekilde tasarlayın.
   5. Karışımları adım 4.2'ye göre tasarlayın.
   6. Kitaplığın tamamı yerine tek parçaları veya karışımların bir alt kümesini görüntüleyin.

2. Numune hazırlama

NOT: NMR'nin yüksek verimli taraması, numune hazırlama için bir pipetleme robotu kullanır. NMR spektrumları, aynı zamanda proteinlerin, RNA'ların ve DNA'nın sinyal alımının birkaç günü boyunca stabiliteleri sıcaklık dalgalanmalarına karşı son derece hassastır ve bu nedenle sıcaklık kontrollü otomatik sistemler, pipetlenen numunelerin stabilitesini büyük ölçüde kolaylaştıracaktır. Bu amaçla, 4 ila 40 °C arasında çalışan ek bir eklenti cihaz, NMR numunelerinin sıcaklık kontrollü bir ortamda sıvı elleçlemesi için pipetleme robotuna bağlanır.

1. Ligand karışımı hazırlama
   1. Bir numune hazırlama robotu kullanarak NMR ölçümleri için elek numuneleri hazırlayın. Robotun esnek konfigürasyonu, çok çeşitli uygulamalara izin verir (örneğin, numunelerin NMR tüplerinden depolama kaplarına geri kazanılması veya genel sıvı elleçleme görevleri). Farklı çaplarda (1.7, 2.0, 2.5, 3.0 ve 5.0 mm) NMR tüpleri kullanılabilir. Gelişmiş kontrol yazılımı ile birlikte numune robot sistemi, her bir konteyner tipi için atanan barkodu okur ve sıvı dolum protokolünü en iyi şekilde uygular.
   2. Şirket içi kütüphane ligand karışımlarının hazırlanması için barkodlu şişeler kullanın. Barkodlu şişeler, numunelerin en yüksek düzeyde güvenilirliğini ve optimum izlenebilirliğini garanti eder.
   3. 768 bileşiği 96 delikli formatta 8 plakaya dağıtın. Her bir parçanın stok konsantrasyonu d 6-DMSO/D₂O (9:1) cinsinden 50 mM'dir. Toplamda, her biri 12 parça içeren 64 karışım hazırlayın. Bir karışımdaki her bir parçanın nihai konsantrasyonu 4.2 mM'dir.
      NOT: Pipetleme robotu, çeşitli geometrilere (kriyo veya otomatik numune alma şişeleri, yuvarlak veya kare derinliğinde 96 delikli plakalar, barkodlu standart şişeler, mikrosantrifüj tüpleri) sahip çeşitli konteyner türlerini barındırabilir ve çeşitli NMR tüplerine ve raflarına sıvı transferinin verimli bir şekilde gerçekleştirilmesine yardımcı olur.

Resim 1: (A) BMRZ'de kurulan yüksek verimli NMR numune hazırlama ve NMR tüpü dolum robotu. (B) BMRZ tesisinde 600 MHz spektrometreye monte edilmiş bireysel sıcaklık kontrollü raflara sahip yüksek verimli numune değiştirici. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

2. Tarama numunesi hazırlama boş (referans ligand spektrumu) ve hedef ile (hedef varlığında ligand)
   1. NMR tarama numunelerinin hazırlanması için, hedef biyomolekülün (protein / RNA / DNA) ve ligand karışımının varlığında, standart NMR tüplerinin Bruker NMR portföyünden seçilen 3 mm NMR HT numune değiştirici tüpleri kullanın.
   2. Biyomoleküler hedefi (örneğin, ¹H Tarama: 10 μM RNA veya Protein) tanımlanmış bir tarama tamponunda manuel olarak veya pipetleme robotunu kullanarak 3 mm NMR tüpüne (son hacim 200 μL) aktarın.
   3. Robotik sistemi kullanarak bir sonraki adımda ligand karışımının 10 μL'sini (örneğin, ¹H Eleme) hedef biyomolekülü içeren barkodlu 3 mm NMR tüplerine aktarın ve kontrol yazılımının dahili protokolünü kullanarak karıştırın.
      NOT: NMR tüpünün barkod numarası, elde edilen NMR veri kümesine uygun ve otomatik olarak dahil edilir, böylece herhangi bir karıştırma olmadan kimlik odaklı iş akışı sağlanır. Pipetleme robotu sıcaklık kontrol aksesuarı, hazırlanan numunelerin NMR tüplerinde sabit sıcaklık altında tutulmasını sağlar.
3. Şirket içi tanımlanmış koşullar ve parametreler
   1. RNA ve proteinin şirket içi fragman kütüphanesine karşı taranması için en uygun tampon koşullarını oluşturun. BMRZ'deki RNA için aşağıdaki koşullu numune kullanılır: 25 mM KPi, 50 mM KCl, pH 6.2. Mg²⁺ isteğe bağlıdır.
   2. Proteinler çözelti koşulları için son derece hassastır; Tercih edilen hedef için en uygun tamponları kullanın. Bu tamponların her biri için, analiz için boş olarak hizmet etmek üzere ligandların ek referans spektrumlarını elde edin.
4. Kullanıcı tarafından belirlenen koşullar
   NOT: Şirket içi oluşturulan koşulların potansiyel bir kullanıcıdan taranacak hedefler için uygun olmadığı durumlarda, aşağıdaki adımlar uygulanmalıdır.
   1. Ligand gözlemlenen tarama deneylerinin gerçekleştirilmesinde ve analiz edilmesinde tamponun bileşenlerinden minimum parazit sağlamak için tamponun ¹H-NMR'sini tek başına gerçekleştirin. Müdahale eden bileşenler, uygun şekilde deuterated eşdeğerleriyle değiştirilebilir.
5. Numune üretimindeki sınırlamalar (hedef miktarlar)/koşullar ve kullanılabilirlik
   NOT: Bazı biyomakromoleküllerin izolasyonu veya rekombinant üretimi, bazı durumlarda zorlayıcı olabilir ve başarılı bir ilaç tarama kampanyası yürütmek için hedefin sınırlı kullanılabilirliğine neden olabilir. Hedeflerin sınırlı veya sınırsız kullanılabilirliği durumunda, başarılı bir NMR tabanlı parça taraması yapmak için aşağıdaki alternatifler kullanılabilir.
   1. Sınırlıysa, ¹⁹F-NMR tabanlı tarama kullanın. Tipik florlu ligandlar tek bir ¹⁹F sinyaline sahiptir; Bu nedenle, herhangi bir sinyal çakışması olmadan 25-30 parçalı kokteyller kullanın. Analiz edilecek daha az sinyal vardır, arabellek bileşenlerinden sinyal paraziti yoktur ve isabet tanımlaması için güvenilecek daha az sinyal vardır.
   2. Sınırsızsa, ¹H-NMR gibi daha büyük ekranlar kullanın. Daha büyük parça kütüphanesi taranabilir. Tipik olarak, fragmanlar birden fazla protondan oluşur, bu da analiz için güvenilecek daha fazla sinyal anlamına gelir.

3. NMR edinme koşulları

1. Şirket içi genel olarak tanımlanmış koşullar
   1. HT numune değiştirici ile donatılmış spektrometre (Otomasyon)
      1. Yüksek verimli tarama için, yalnızca HT numune değiştirici kullanılarak ölçülebilen 96 delikli plakalar kullanın. HT numune değiştirici ayrıca her rafı ayrı ayrı temperleme imkanı sunar.
      2. Optimum sinyal-gürültü için, helyum veya azot soğutmalı kriyojenik problu bir spektrometre kullanın. Otomasyon için otomatik ayarlama ve eşleştirme modülü (ATM) gereklidir.
   2. Parametre kümeleri ve darbe dizileri
      NOT: Birçok NMR deneyi bağlanma olaylarını karakterize edebilir. İsabet tanımlama, deneme kurulumuna bağlı olarak değişir. Aşağıdaki deneyler BMRZ tarama kampanyalarında rutin olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, kullanıcı tanımlı tarama kampanyaları için ve kullanıcı özelliklerine göre değişiklikler yapılabilir.
      1. TopSpin yazılımını kullanıyorsanız, ligand tabanlı deneyler için parametre kümesini ekleyin: SCREEN_STD, SCREEN_T1R, SCREEN_T2, SCREEN_WLOGSY. Parametre seti gerekli tüm parametreleri ve darbe dizilerini içerir: STD: stddiffesgp.3; T_1ρ: t1rho_esgp2d; T₂: cpmg_esgp2d; ve waterLOGSY: ephogsygpno.2.
      2. Listelenen tüm deneyler için, su bastırma olarak uyarma heykeli^13'ü kullanın. Bir referans için, 1D uyarma heykeli (zgesgp) kullanın. Taramaların sayısı, sistemin hassasiyetine (manyetik alan kuvveti ve prob kafası), numune konsantrasyonuna ve deneyin seçimine bağlıdır. Bir öneri: NS = 64 ile 1D, NS = 128 ile T_1ρ ve T₂ , NS = 256 ile STD ve NS = 384 veya 512 ile waterLOGSY.
      3. ¹⁹F taraması için hem 1D hem de T₂ deneylerini kullanın: 1D: 19 F{1 H}-prob kafası için F19CPD (pp=zgig) ve ¹⁹F/¹H-prob kafası için ^F19(pp=zg); SCREEN_19F_T2 (pp = CPMGIGSP).
      4. 220 ppm'lik bir spektral genişlik ve -140 ppm'de bir uyarma frekansı kullanın. Deney süresi, donanıma ve numune konsantrasyonuna bağlı olarak 1 ila 5 saat arasındadır (biyomakromolekülün uzun süreli stabilitesini sağlar). T₂ için, CPMG süresi 0 ms ile 200 ms arasında değişmelidir.
   3. Işleme
      1. STD, T_1ρ ve T₂ deneylerini sahte 2D olarak kaydedin. İki tek 1D spektrumunu işlemek için IconNMR, gevşetme seçeneğiyle veya seçeneği olmadan au-program proc_std kullanır. İlk seçenek referans 1D'yi ve iki spektrumun farkını sağlar. İkinci seçenek, kısa ve uzun gevşeme süresine sahip iki ayrı spektrum verir. waterLOGSY, çözücü sinyali için negatif ile fazlanması gereken tek bir 1D'dir.
2. Kullanıcıya özel koşullar
   1. Daha önce bahsedilen parametrelerden herhangi birini kullanıcı tanımlı koşullara uyarlayın. Örneğin, kullanıcı tarafından sağlanan bir tesis proteini genel olarak kullanılan sıcaklıkta kararlı değilse, optimizasyon deneyleri değişen sıcaklık, konsantrasyon, tampon koşulları vb. Gerçekleştirilebilir.

4. Veri Analizi

1. Parça kütüphanesi QC (d6-DMSO/spesifik tampon) ve niceleme
   1. CMC-q
      NOT: Tarama kampanyalarının başlatılmasından önce parça kütüphanelerinin kalite kontrolü esastır. Ayrıca, çeşitli tarama kampanyalarının uygulanması için fragman kütüphanesinin uzun vadeli istikrarının sağlanması gerekmektedir, bu nedenle kütüphanenin kalitesinin periyodik olarak değerlendirilmesi gerekmektedir. Bu amaçla, kalite ve miktar değerlendirmesi için TopSpin'in entegre yazılımı CMC-q ve CMC-a kullanılır. CMC-q ve CMC-a, Topspin içinde, küçük organik moleküllerden elde edilen ¹H-NMR spektrumunu kullanarak yapı doğrulaması da dahil olmak üzere sorunsuz bir şekilde elde edilmeyi, analizi sağlayan yazılım modülleridir ⁹.
      1. Bütünlük için, d6-DMSO'da 1 mM parça konsantrasyonuna sahip değerlendirme numuneleri hazırlayın. Sıvı numune toplamayı 3 mm'lik bir NMR tüpüne doldurarak pipetleme robotu ile numuneleri otomatik bir şekilde hazırlayın.
      2. Çözünürlük değerlendirmesi için, pH 7.4'te 50 mM sodyum fosfat tamponunda 1 mM bileşik, 150 mM sodyum klorür,% 90 H 2 O / % 10 D 2 O ve 1 mM 3-(trimetilsilil) propiyonik-2,2,3,3-d4 asit sodyum tuzu (TMSP-Na) içeren numune kullanın.
      3. Üçlü rezonans 5 mm TCI kriyojenik prob ve aynı anda 579 numuneyi işleyebilen bir HT numune değiştirici ile donatılmış 600 MHz NMR spektrometresi kullanarak NMR spektrumlarını 298 K veya 293 K'da toplayın.
      4. CMC-q yazılımını kurmak için, bir IconNMR kullanıcısının oluşturulmasını, FastLaneNMR'nin etkinleştirilmesini ve HT numune değiştiricisinin değiştirilmesini uygulayan kullanım kılavuzunun talimatlarını izleyin.
      5. 90° darbeyi kalibre edin ve TopSpin prosol tablasına kaydedin.
      6. 96 numune kuyusu plakasını HT numune değiştiricideki 5 raf konumundan birine yerleştirin.
      7. Önerilen kimyasal yapısını, benzersiz bir tanımlayıcıyı ve bir toplu işlemdeki her numunenin HT numune değiştiricisindeki konumunu içermesi gereken bir SDF dosyasını (yapı veri dosyası) yüklemek için CMC-q Kurulum penceresinde Gözat'a gidin ve .sdf ile biten bir dosya seçtikten sonra Aç'ı tıklatın.
      8. CMC.q Toplu İş Otomasyonu ayarlarında, ölçülecek denemeyi tanımlayan doğrulama türünü, IconNMR kullanıcısını ayarlayın ve Çözücüyü tanımlayın.
      9. SDF dosyasının yolu, molekül kimliği ve örnek konum için SDF dosyalarını tanımlayın.
      10. Başlat'a tıklayarak satın alma işlemini başlatın. Edinmeyi Başlat'a tekrar tıklayın. CMC-q Kurulumu, Kaydet'e tıklayarak da kaydedilebilir.
      11. CMC-q kurulum adımlarının ayrıntılı açıklaması için Bruker'ın kullanım kılavuzu talimatlarını izleyin.
   2. CMC-a
      1. CMC-a için, küçük organik moleküllerden elde edilen 1H-NMR spektrumunu kullanarak yapı doğrulaması dahil olmak üzere analiz sağlayan Topspin içindeki yazılım modülünü kullanın⁹.
2. Karışım tasarımı
   NOT: Uygun bir karışım tasarımı, NMR'yi bir platform olarak kullanarak tarama için önemli bir rol oynar. Karışım başına çok sayıda parça, daha hızlı taramaya izin verir, ancak yanlış pozitif ve negatif riskini artırır. Daha düşük bir sayı bu riski azaltır, ancak taramayı yapmak için gereken süreyi arttırır. Genel olarak, karışımlar oluşturulurken sinyal çakışmasından kaçınılmalıdır. Şirket içi kütüphaneyi kullanarak, kütüphane özellikle çeşitli olacak ve yüksek kimyasal çeşitliliği korurken çok az sinyal örtüşmesi gösterecek şekilde tasarlandığından, ¹H taraması için bu ihmal edilebilir. Bu da, 64 karışımın oluşturulması için özel bir tasarım prosedüründen geçilmesi gerekmediği anlamına gelir.
   1. ¹⁹F taraması, flor içeren kurum içi kütüphanenin parçalarına dayandığından ve kütüphane bu belirli parçalar için sinyal çakışmasını azaltmak için oluşturulmadığından, uygun bir karışım tasarlayın.
   2. ¹⁹F içeren tüm parçalar için tek bileşik spektrumlarını ölçün.
   3. Her sinyalin kimyasal kayma bilgisine dikkat edin.
   4. Bu bilgilere göre, karışım başına 20-21 parça seçin. Bu da, her biri sinyal çakışması olmayan 20-21 parça içeren 5 karışım verir ve verilerin yarı otomatik analizine izin verir.
3. Bir ligand gözlemlenen biyomakromolekül-ligand etkileşimi içinde isabet tanımlaması gerçekleştirin
   NOT: ¹⁹F ve ¹H tarama prosedürü arasında bir isabetin farklı tanımları vardır. Aşağıdaki isabet tanımlamaları bizim tarafımızdan oluşturulmuştur ve belirli kurallara uymaktadır. İsabet belirleme konusu çok öznel bir tarzdır ve kullanıcıdan kullanıcıya farklılık gösterebilir. Bununla birlikte, isabet tanımlama kurallarının, doğrulama ve güvenilirliği korumak için üzerinde anlaşmaya varıldıktan sonra değişmemesi son derece önemlidir.
   1. ¹H Ekran
      1. Vuruşları güvenle belirlemek için, bağlayıcıları tanımlamak için hedefin hem varlığında hem de yokluğunda 1D ¹H spektrumları, waterLOGSY ve T₂ gevşeme deneyleri elde edin. Her üç deney de bağlayıcı bir olay gösterme potansiyeline sahiptir. Boş spektrumlara kıyasla numune spektrumlarında 6 Hz'den daha büyük bir CSP görülebiliyorsa, bu bir isabet göstergesi olarak kabul edilir. Aynı şey, waterLOGSY'de güçlü bir pozitif sinyalin yanı sıra numune spektrumlarında 0'dan fazla_T2 azalma görülebiliyorsa da geçerlidir. Bağlanma olayları, spektrum içeren numuneyi kendi boş spektrumlarıyla karşılaştırırken her üç deneyde de sergilenebilir. Ancak, bağlayıcı olaylar her üç deneyde de görünmeyebilir. Bu nedenle, bir parçayı bağlayıcı bir vuruş olarak sınıflandırmak için daha önce açıklanan olaylardan en az ikisinin gerçekleşmesi gerektiği konusunda anlaşmaya varılmıştır.
      2. Parçaların durumunu bağlayıcı, belirsiz, bilinmeyen, toplamalar ve bağlayıcı olmayan olarak tanımlamak için TopSpin'deki FBS aracını kullanın.
      3. Bir karışımla işiniz bittiğinde, FBS aracında onaylayın.
      4. FBS projesindeki özet sekmesinde, Tarama raporu oluştur'a tıklayın. Bu, .xlsx dosyası oluşturan bir pencere açacaktır. Kullanıcı daha sonra tüm ligandlar, yalnızca bağlayıcı ligandlar, yalnızca bağlayıcı ligandlar ve elektronik tabloda bildirilecek belirsiz ligandlar arasında seçim yapmayı seçebilir.
   2. ¹⁹F Ekranı
      1. Bağlayıcı olmayan, hafta bağlayıcı ve güçlü bağlayıcı arasında ayrım yapmak için, 200 ms hedef ölçüm ile 200 ms boş ölçüm arasındaki entegrasyon katsayısını 0 ms hedef ölçümünün bölümüne bölün ve 0 ms boş ölçüm kullanılır:
         
         NOT: Bu, 0 ile ~1 (isabet puanı) arasında değişen değerler vererek her bağlama durumu için eşikler atamayı mümkün kılar.
      2. İsabet puanının 1'i aştığı durumları işaretlemek için referans 200 ms ölçümün ortalamasını temel eşik olarak kullanın. Bu, içe aktarılan integraller negatif değerler içeriyorsa veya referans ölçümü hedef ölçümden yüksekse oluşabilir. 0,67'≤ isabet puanı zayıf isabet, 0,33 < güçlü isabet ve 0,67'> herhangi bir şey isabetsiz olarak kabul edilir. Şekil 2'de bir örnek gösterilmiştir.

Şekil 2: ¹⁹F taraması için isabet tanımlaması. Örnek bir bileşiğin ¹⁹F CPMG NMR spektrumunun kesiti. Bu resimsel gösterim, bir bağlayıcının özelliklerini açıklar. ¹⁹RNA'nın varlığında ve yokluğunda karışım örneklerinden elde edilen bir bileşiğin F-CPMG spektrumları. Değerler, karşılık gelen tepe noktasının normlu integral değerlerini temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

4. Veri analizi
   1. Verileri analiz için hazırlama
      NOT: Elde edilen verilerin görünür kusurlarının olmaması önemlidir. Bu, şimşek çakmanın sorunlu olduğu veya su bastırmanın yetersiz olduğu verilerin analiz için dikkate alınmaması gerektiği anlamına gelir. Bunun yerine, verilerin tekrar kaydedilmesi ve numunede (örneğin, hava kabarcığı yok), sıcaklık, şimleme ve su bastırma ile her şeyin yolunda olduğundan emin olunması önerilir. DMSO sinyalleri karşılaştırılırken veri doğruluğu her zaman değerlendirilebilir.
   2. ¹H taraması
      1. ¹H tarama verilerini analiz etmek için, TopSpin 4.0.9'daki FBS aracını (ek lisans gerektirir) kullanın.
      2. Veri analizine başlamak için FBS araç kılavuzundaki talimatları izleyin. Aşağıdaki adımlarda, kılavuzda bildirilen yordam özetlenmektedir.
      3. BMRZ NMR verilerini, tarama kampanyalarından saklayın, böylece her farklı tarama karışımının, bir alt dizinin numune üzerinde ölçülen farklı deneyleri tuttuğu kendi dizini vardır.
      4. FBS aracını kullanmak için, biyomoleküler hedef olmadan numunelerden kaydedilen tüm verilere sahip referans spektrumlarını, ancak karışımların yanı sıra farklı / nmr dizinlerinde ölçülen tek bileşikle saklayın. FBS aracı her birinin dizin yolunu ayrı ayrı soracağı için bu önemlidir.
         NOT: Aşağıdaki veri kümeleri, bir filtreleme örneğinin karışımlarının depolandığı dizinde (csv, FragmentScreen XML belgeleri ve BAK dosyası) depolanmışsa, FBS aracı bir dizini filtreleme projesi olarak tanır.
      5. TopSpin 4.0.9'u kullanırken, DIR adı verilen edinilen verileri içeren dizine doğrudan bir yol oluşturun. tüm karışımların ayrı bir dizine sahip olması gereken /nmr dizinini seçin.
      6. Görüntülenen bir örneğin FBS aracını başlatmak için, FBS projesi sembolünü TopSpin penceresinin ortasına sürükleyin. Seçilen dizinde, daha önce söz konusu veri kümeleri kopyalanmışsa FBS proje sembolü görünmelidir.
      7. Parça Tabanlı Tarama Seçenekleri penceresi, yeni bir FBS projesi ilk kez yüklenirken otomatik olarak açılmalıdır. Bu pencerede bir kokteyl dosyası seçin. Kokteyl dosyası, mikslerin adının, her bir parçanın adının ve mikslere bölünmesinin atanmasını içeren bir csv dosyasıdır. Ayrıca, tek parçaların tüm ölçülen spektrumlarına sahip bir referans ligand spektrum klasörü tanımlayın. Son olarak, genellikle araştırılan hedef olmadan karışımların veri kümelerini içeren klasör olan bir referans boş deneme klasörü tanımlayın.
      8. Fragman Tabanlı Tarama Seçenekleri, araştırılan spektrumları ve spektrumları görüntülemek için rengi tanımlamaya izin veren Spektrum türleri adlı bir sekmeye sahiptir. Spectype'ı önceden işlenen verilere göre ayarlayın. Ekran düzeni sekmesinde, spesifikasyonlarına göre birbirleriyle karşılaştırılacak spektrumları tanımlayın.
      9. FBS projesini başlatmak için Tamam'a basın.
      10. Verilere bakarken, tüm kokteyl karışımlarını ve her karışımın tüm ligandlarını bir tabloda özetleyen ayrı bir pencere açılacaktır. Bir hücreye çift tıklandığında, ilgili veri kümeleri açılır ve örneğin 1 H ^1DBoş spektrumları hedefi içeren veri kümesiyle karşılaştırır.
      11. Bağlayıcıları atamadan önce, referans piklerinin (tüm ölçümlerin DMSO'su ve tek bileşikler) birbirleriyle eşleştiğinden ve aynı kimyasal kaymaya sahip olduğundan emin olun. Farklılıklar gözlenirse, TopSpin'den seri işleme seçeneğini kullanarak bunları düzeltin.
      12. Seri işleme seçeneği, Gelişmiş altındaki İşlem sekmesi altındadır. Değişiklikleri bir veri kümesinden seçilen tüm spektrumlara uygular. Bu şekilde, Spectypes deney numaralarına kolayca atanabilir ve tüm spektrumlar referansla hizalanmak üzere aynı anda kaydırılabilir.
   3. ¹⁹F Tarama
      1. ¹⁹F karışımlarının ilk analizi için, her karışım için bir entegrasyon dosyası oluşturun. Entegrasyon bölgesini tanımlamak için, Analiz sekmesindeki Entegre işlevine tıklayın. Karışımdaki her parça için, karşılık gelen ¹⁹F-singal için net bir entegrasyon bölgesinin tanımlandığından emin olun.
      2. Entegrasyon dosyasını ileride kullanmak üzere dışa aktarmak için Entegrasyon bölgelerini kaydet/dışa aktar düğmesini kullanın. Kullanılan entegrasyon dosyalarını C:\Bruker\TopSpin4.0.9\exp\stan\nmr\lists\intrng konumuna veya TopSpin kurulum dizininin karşılık gelen yoluna kaydedin.
      3. ¹⁹F verisi için, araştırılan hedefle birlikte veya hedef olmadan bir veri kümesi açın.
      4. Entegrasyon dosyasını geçerli spektruma yüklemek için Analiz sekmesini tekrar açın, Tümleştirme'ye gidin ve Tümleştirme bölgelerini Oku/İçe Aktar düğmesini kullanarak ilgili tümleştirme dosyasını yükleyin. Bu, o dosyanın tanımlanmış bölgelerini geçerli spektruma yükler.
      5. İntegraller sekmesindeki tüm tümleşik bölgelerin listesini bulmak için kaydedin ve geri dönün. Bunu bir elektronik tabloya veya verilerin daha fazla analizi için kullanılan başka bir araca kopyalayın.
      6. Hedefli ve hedefsiz her karışım için bu prosedürü tekrarlayın.
   4. Veri Yönetimi
      1. Kullanım kolaylığı ve üretkenlik uğruna, elde edilen verilerin daha fazla analiz edilmesi ve depolanması için tek tip bir iş akışı ayarlayın. Hem ¹H hem de ¹⁹F taraması için, her biri için özel olarak tasarlanmış bir elektronik tablo kullanın.
         NOT: ¹H taraması için bu tamamen veri yönetimi ve her hedefi özetlemek için kullanılırken, ¹⁹F taraması için bölüm 4.3'te açıklanan bölüm, integral veriler kopyalandıktan sonra her bir parçayı otomatik olarak isabet / isabet yok olarak etiketlemek için kullandı. Bu, analiz sırasında dosyanın düzgün bir şekilde kurulduğunu varsayarak insan hatası riskini azaltır ve tüm önemli bilgiler, verilere ilk kez bakmak için başka programlara ihtiyaç duymadan hemen hemen herkes tarafından açılabilen bir dosyada tek bir yerde toplandığından, bilgi paylaşımını kolaylaştırır.

Results

Parça kütüphanesinin kalite kontrolü

Discussion

NMR tabanlı fragman/ilaç taramasının çok yönlülüğü. BMRZ, ilaç keşfi için çok çeşitli afinite rejimindeki parçaları tanımlamak için son teknoloji ürünü otomatik NMR enstrümantasyonunun yanı sıra STD-NMR, waterLOGSY ve gevşeme deneylerini başarıyla uygulamıştır. Kurulan donanım, yüksek verimli bir numune hazırlama robotu ve 600 MHz spektrometre ile ilişkili yüksek verimli numune depolama, değiştirici ve veri toplama ünitesi içerir. 1 H, 19 F, ¹³C ve ¹⁵N için yakın zamanda satın alınan bir kriyojenik prob, önerilen ölçümler için gerekli hassasiyeti sağlar ve ¹⁹F algılama sırasında 1 H (¹) dekuplaja izin verir. Bu prob, CMC-q, CMC-assist, CMC-se ve FBS (TopSpin'e dahil) dahil olmak üzere Bruker'in gelişmiş yazılım araçlarını kullanma imkanı sunan en yeni nesil NMR konsoluna bağlanır. Parça tabanlı tarama (FBS) aracı, TopSpin'in en son sürümüne dahil edilmiştir ve STD, waterLOGSY, T₂ / T_1r-gevşeme deneylerinden oluşan yüksek verimli verilerin analiz edilmesine yardımcı olur. Sıvı 1D 1H numune toplama, numune doldurma robotu kullanılarak NMR tüplerine otomatik bir şekilde doldurulabilir. Tipik olarak, 96 tüpten (3 mm) oluşan bir blok yaklaşık iki saat içinde doldurulur. 96 delikli plaka rafları, bloğun barkodunu okuyan ve NMR tüplerini otomasyon yazılımı (IconNMR) tarafından kontrol edilen deneylere atayan HT numune değiştiriciye doğrudan yerleştirilir. HT numune değiştiricide aynı anda beş adet 96 delikli plaka rafı saklanabilir ve programlanabilir. Her bir rafın sıcaklığı ayrı ayrı kontrol edilebilir ve ayarlanabilir. Ek olarak, her bir numune ölçümden önce istenen sıcaklığa önceden koşullandırılabilir (yoğuşmuş nemin giderilmesi için ön ısıtma ve boru kurutma).

Çok çeşitli uygulamalar için uygunluk. Bu otomatik NMR tabanlı taramanın geniş uygulamalarından biri, bir biyomakromoleküler hedefe (DNA / RNA / Proteinler) bağlanan yeni ligandları tanımlamak ve geliştirmektir. Bu ligandlar, tipik olarak kovalent olmayan şekilde bağlanan ortosterik ve allosterik inhibitörleri içerebilir. Ayrıca, NMR tarafından FBDD tipik olarak umut verici bileşikleri seçmek için ilk adım olarak kullanılır, karşılanması gereken gereksinimler biyomoleküler hedefin yeterli miktarlarda mevcudiyetidir. Bu hedef iki ana göreve ayrılmıştır.

Birinci görev, aşağıdaki nedenlerden dolayı şirket içi bir parça kütüphanesi geliştirmek ve karakterize etmektir: 1000'den fazla parçanın ilk ve periyodik kalite kontrolü, karakterizasyonu ve nicelleştirilmesi; fragmanların her bir hedef için, özellikle protein hedefleri için optimize edilmiş tamponlardaki çözünürlüğünün belirlenmesi; ve çeşitli iskeleleri barındıracak ve diğer makromolekül sınıflarına doğru uzanacak birkaç kütüphanenin kurulması. İkinci görev, NMR tarafından fragman tabanlı ilaç tasarımı (FBDD) için iş akışlarını entegre etmektir: otomatik 1D-ligand gözlemlenen tarama (¹H ve ¹⁹F gözlenen); ortosterik ve allosterik bağlamayı ayırt etmek için otomatik replasman testleri ((doğal) ligand ile rekabet deneyleri); birden fazla parçaya sahip otomatik ikincil taramalar; otomatik 2D-protein taraması ve EU-OPENSCREEN kütüphanesini veya başka bir kütüphaneyi kullanan ilk vuruş etrafında bir dizi türevin ikincil taraması; ve seçilen hedeflere karşı FDA kütüphanesinin yeniden profillendirilmesi.

Ek olarak, hücre döngüsü kontrolünü ve metabolizmasını birbirine bağlayan düzenleyici mekanizmaları çözmek için çeşitli hücre hatlarının metabotiplemesi (hastalıkla ilgili) yapılabilir. Ayrıca, yapı / alan optimizasyonunun optimizasyonu için in vivo ve in vitro RNA / DNA / protein düzenleme elemanlarının fonksiyonel karakterizasyonu (yapısal araştırmalar için stabilite optimizasyonu (Tampon, pH, sıcaklık ve tuz taraması) ve NMR bazlı fragman taramasının membran proteinlerine ve genellikle diğer tekniklere erişilemeyen içsel olarak bozulmuş proteinlere genişletilmesi vardır.

Sınırlama. ¹⁹F ve ¹H parça kütüphanelerinin kullanımının artıları ve eksileri vardır, bunlardan birkaçı aşağıda belirtilecektir. ¹⁹F'ye karşı ¹H ölçümlerinin en büyük yararı, hem gerçek ölçüm süresinin hem de sonraki analizin hızıdır, çünkü karışımlar neredeyse iki kat daha fazla parça içerir ve daha az deney yapılması gerekir. Takip analizi, ¹⁹F tarama için de daha kolaydır, çünkü tamponlardan parazit yoktur ve ayrıca optimum şekilde tasarlanmış bir parça karışımı için neredeyse hiç sinyal çakışması olmadan daha geniş bir kimyasal kayma aralığı sunar. Spektrumların kendileri büyük ölçüde basitleştirilmiştir, genellikle flor atomlarının sayısına bağlı olarak parça başına sadece bir veya iki sinyale sahiptir. Bu spektrumların analizi bu nedenle otomatikleştirilebilir ve yine zaman içinde kısaltılabilir. Bu, en azından bu çalışmada kullanılan kütüphane için kimyasal çeşitlilik pahasına gelir. Kütüphanenin sadece ~% 13'ü 19 F içerdiğinden, ancak doğal olarak hepsi ¹H taramasında kullanılabilir olduğundan, ¹⁹F tarama parçalarının çeşitliliği daha düşük olacaktır. Bu, daha fazla parçaya ve daha büyük kimyasal çeşitliliğe sahip özel olarak tasarlanmış ¹⁹F kütüphaneleri kullanılarak atlatılabilir. ¹⁹F tarama için bir diğer dezavantaj, parça başına düşük sinyal sayısıdır. Parçalar genellikle birden fazla hidrojen atomundan oluşur. Bu nedenle, ¹saat gözlemlenen tarama deneyleri, bağlanmayı tespit etmek için aynı parça için farklı sinyallere güvenebilir. Bu, ¹H taraması için isabetleri belirlerken daha yüksek bir güven derecesi sağlarken, ¹⁹F taraması parça başına verilen bir veya iki sinyale dayanmalıdır.

Modern otomatik NMR tabanlı fragman tarama enstrümantasyonu, yazılım ve analiz yöntemleri ve bunların protokolleri hakkında ayrıntılı bir açıklama sunulmuştur. Kurulan donanım, yüksek verimli bir numune hazırlama robotu ve 600 MHz spektrometre ile ilişkili yüksek verimli bir numune depolama, değiştirici ve veri toplama ünitesi içerir. ¹H, 19 F, 13 C ve ¹⁵N için yakın zamanda monte edilmiş bir kriyojenik prob kafası, önerilen ölçümler için gerekli hassasiyeti sağlar ve ¹⁹F algılama sırasında ¹H dekuplaja izin verir. Ayrıca, en yeni nesil NMR konsolu, edinim ve anında analize yardımcı olmak için gelişmiş analitik yazılım kullanma imkanı sunar. Yukarıda tartışılan teknoloji, iş akışları ve açıklanan protokoller, FBS'yi NMR tarafından takip eden kullanıcılara kayda değer bir başarı sağlamalıdır.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bruker Avance III HD		Bruker	600 MHz NMR Spektrometre
Matrisi Şeffaf Polipropilen 2D Barkodlu Üstü Açık Depolama Tüpleri	3731-11 0.75ML V-BOTTOM TÜP/MANDAL RAFI	ThermoFisher Scientific	Barkodlu Tüpler
Matrix SepraSeal und DuraSeal&	4463 Kapak Matı, SeptraSeal 10/CS	ThermoFisher Scientific
SampleJet		Bruker	HT Numune Değiştirici
SamplePro Tube		Bruker	Pipetleme Robotu