Kemirgen ve İnsan Beyin Dokularında Aktüer Polimerizasyon Durumunu Değerlendirmek için Zaman Verimli Floresan Spektroskopi Tabanlı Bir Tahlil

Sitoskeletal protein aktin, yapısal destek, hücresel taşıma, hücre hareketliliği ve bölünme dahil olmak üzere birden fazla hücresel işlevde yer alır. Aktin dengede iki şekilde ortaya çıkar: monomerik globüler aktin (G-actin) ve polimerize filamentli aktin (F-actin). Akinin polimerizasyon durumundaki hızlı değişiklikler (G ve F formları arasındaki interkonversiyon) hızlı filament montajına ve sökülmesine neden olur ve hücresel fizyolojideki düzenleyici rollerinin altında yatmaktadır. Actin nöronal sitoskeletal yapının ana bileşenini oluşturur ve çok çeşitli nöronal fonksiyonları etkiler^1,2. Not olarak, aktin sitoskeleton sinaptik terminallerin yapısal platformunun ayrılmaz bir parçasını oluşturur. Bu nedenle, sinaptik morfogenez ve fizyolojinin önemli bir belirleyicisidir ve sinapsların boyutunun, sayısının ve morfolojisinin kontrolünde temel bir rol oynar³,^4,5. Özellikle, dinamik aksin polimerizasyon-depolimerizasyon, hafıza ve öğrenme süreçlerinin altında sinaptik plastisite ile ilişkili sinaptik yeniden şekillendirmenin önemli bir belirleyicisidir. Gerçekten de, hem presynaptik (nörotransmitter^{salınımı 6,7,8,9,10}gibi) hem de postsinaptik fonksiyonlar (plastisite ile ilgili dinamik yeniden şekillendirme^11,12,13,14)kritik olarak aktin sitoskeletonunun polimerizasyon durumundaki dinamik değişikliklere dayanır.

Fizyolojik koşullar altında, F-actin seviyeleri, posttranslational modifikasyon 4 ,^{15 , 16}ve aksin bağlayıcı proteinler (ABP' ler)^4,17 içeren multimodal bir yol ile dinamik ve sıkı bir şekilde düzenlenir. ABP'ler birden fazla düzeyde (polimerizasyonun başlatılması veya inhibe edilmesi, filament dallanmasının teşvik edilmesi, filamentlerin daha küçük parçalara kesilmesi, depolimerizasyonun teşvik edilmesi ve depolimerizasyona karşı koruma gibi) aksin dinamiklerini etkileyebilir ve sırayla çeşitli hücre dışı ve hücre içi sinyallere duyarlı sıkı bir modüler kontrol altındadır^{18, 19,20}. Birden fazla düzeydeki bu tür düzenleyici kontroller, sinaptik sitoskeletondaki aktin dinamiklerinin sıkı bir şekilde düzenlenmesini, nöronal fizyolojinin hem bazal hem de aktivite kaynaklı durumlarda ince ayarlı ön ve postynaptik yönlerini belirler.

Aktinin nöronal fizyolojideki önemli rolleri göz önüne alındığında, çeşitli çalışmaların nörodejenerasyon, psikolojik hastalıklar ve nörogelişimsel rahatsızlıklar 3 , 21 , 22 ,²³,²⁴,^{25 , 26,}27 dahil olmak üzere çok çeşitli nörolojik bozukluklarla bağlantılı kritik patojenik olaylar olarak aksin dinamiklerindeki değişiklikler için kanıt sağlaması şaşırtıcı değildir. Bununla birlikte, nöronal fizyoloji ve patofizyolojide aktin'in kilit rollerine işaret eden araştırma verilerinin zenginliğine rağmen, özellikle sinaptik sitoskeletonda aktin dinamikleri anlayışında hala önemli boşluklar devam etmektedir. Nöronal akinin ve patolojik koşullar altındaki değişimlerinin daha iyi anlaşılması için daha fazla araştırma çalışmasına ihtiyaç vardır. Bu bağlamda ana odak alanlarından biri aksin polimerizasyon durumunun değerlendirilmesidir. Batı blotting tabanlı ticari kitler vardır (G-Actin/F-Actin in vivo tahlil biyokimyasal kiti; Cytoskeleton SKU BK037^28,29) ve F-actin seviyelerinin değerlendirilmesi için ev yapımı tahliller⁶. Bununla birlikte, bunlar F-actin ve G-actin'in biyokimyasal izolasyonu gerektirdiğinden ve sonraki nicelemeleri immünblotting protokollerine dayandığından, zaman alıcı olabilirler. Burada, önceki bir çalışma^30'dan uyarlanmış floresan spektroskopi tabanlı bir tahlil, hem F-actin bazal seviyelerini hem de montaj sökümsünü dinamik değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilecek değişikliklerle rapor ediyoruz. Özellikle, 1 mL cuvette için uygun numuneleri mevcut 96 kuyu plakası formatına uygun numuneler gerektiren orijinal protokolü verimli bir şekilde değiştirdik. Bu nedenle modifiye edilen protokol, test için gerekli olan doku/numune miktarını önemli ölçüde azaltmıştır. Ayrıca, protokolün sadece beyin dokusu homojenatları için değil, aynı zamanda izole sinaptik terminaller (sinaptozomlar ve sinaptoneurozomlar) gibi hücre altı fraksiyonlar için de uygun olduğuna dair kanıtlar sunuyoruz. Son olarak, test taze parçalanmış kemirgen beyin dokuları ve uzun süreli saklanan ölüm sonrası insan beyin örnekleri için kullanılabilir. Not olarak, test nöronal bağlamda sunulurken, onlarla ilişkili diğer hücre tiplerine ve fizyolojik süreçlere uygun şekilde genişletilebilir.

Tüm deneysel işlemler Otago Üniversitesi Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımında Etik Kurulu'nun yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir (Etik Protokol No. AUP95/18 ve AUP80/17) ve Yeni Zelanda yasama organı. İnsan beyin dokuları, İspanya'nın Barselona kentindeki Clínic-IDIBAPS BioBank Hastanesi Nörolojik Doku Bankası'ndan elde edildi. Tüm doku toplama protokolleri Barselona'daki Clínic Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylandı ve ailelerden bilgilendirilmiş onay alındı.

1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması

1. Beyin dokusunun homojenizasyonu ve sinaptik terminallerin zenginleştirilmiş fraksiyonunun hazırlanması için aşağıdaki tamponları hazırlayın:
   Homojenizasyon tamponu: 5 mM HEPES, pH 7.4 0.32 M sakkaroz ile desteklenmiş
   Resüspenzyon tamponu: 5 mM Tris, 0,32 M sakkaroz ile desteklenmiş pH 7,4
   Yıkama tamponu: 5 mM Tris, pH 8.1
   1.2 M sakaroz
   1.0 M sakaroz
   0.85 M sakaroz
2. Proteaz ve fosfataz inhibitörlerinin ev yapımı veya ticari karışımını ekleyin.
   NOT: Komple Proteaz inhibitör karışımının (10 mL tampon başına 1 tablet) ve Fosfataz inhibitörü kokteyl IV'ün (1:100; hacim: hacim) EDTA içermeyen sürümünü kullandık.
3. Phalloidinin sabitlenmesi, permeabilizasyonu ve bağlanması için aşağıdaki tamponları ve reaktifleri hazırlayın:
   Krebs tampon: 118.5 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 0.1 mM KH₂PO₄, 5 mM NaHCO₃, 10 mM glikoz, 20 mM HEPES, pH 7.4
   1 M KCl
   %25 glutaraldehit (stok çözeltisi)
   % 0,1 Triton X-100 ve 1 mg/mL NaBH₄ içeren Krebs tamponu
   DMSO'da 400x Alexa Fluor 647 Phalloidin
   0.32 M sakkaroz içeren Krebs tamponu
   DMSO'da 50 μM latrunculin A (stok çözümü)
   1 M KCl (stok çözümü)
   DİkKAT: Phalloidin toksiktir (LD₅₀ = 2 mg/kg) ve dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Glutaraldehitin solunması toksiktir ve bir duman kaputunda ele alınmalıdır.
4. Tamponları 4 °C'de, phalloidin ve latrunculin A'yı ise -20 °C'de uzun süreli depolama için saklayın.
   NOT: Arabelleklerin uzun süreli depolanmasının önerilmez. Protokol burada duraklatılabilir.

2. Beyin dokusu homojenizasyonu

1. Bir Potter-Elvehjem cam tüpünde ve buzda pestle içinde 10 cilt homojenizasyon tamponunda kriyoprezer korunmuş veya taze parçalanmış sıçan beyin dokusunu homojenize edin.
   NOT: Optimal homojenizasyon, beyin dokuları için elle 15-20 inme ile elde edilir. Başarılı homojenizasyon, süspansiyonun cam tüpten sorunsuz akışı ile doğrulanabilir. Protokol burada duraklatılabilir.
2. Bradford tahlil³¹kullanarak homojenattaki protein konsantrasyonu belirleniyor.
   NOT: Protein tahmini için alternatif ev yapımı veya ticari tahliller de kullanılabilir.
3. Krebs tamponunda homojenat örnekleri 50 μL hacimde 2-3 mg protein/mL konsantrasyonda seyreltin.
   NOT: Bazı deneylerimizde, homojenleri 37 °C'de 1 saat boyunca 2 μM latrunculin A veya DMSO (kontroller) ile kuluçkaya yatırıyoruz. Bunun için homojenatlar 48 μL Krebs tamponunda yeniden sulanır ve 50 μM latrunculin A veya 2 μL DMSO'nun 2 μL'si eklenir. İmmünblotting için ayrıca, inkübasyondan sonra az miktarda örnek (10 μg) toplanır.
4. Homojen örnekleri düzeltin (bölüm 5).

3. İzole sinir terminallerinin hazırlanması

1. Sinaptozomların hazırlanması
   NOT: Sinaptozomlar için alternatif protokoller^32,33 de kullanılabilir.
   1. Santrifüj beyin 4 °C'de 10 dakika boyunca 1.200 x g'da homojendir.
   2. Ham nükleer fraksiyon olan peleni atın.
   3. 3.1.1 adımda elde edilen süpernatantı (S1) 12.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika boyunca daha fazla santrifüj edin.
   4. Çözünür sitozolitik fraksiyon olan süpernatantı (S2) çıkarın.
   5. Resüspensyon tamponunda ham sinaptozomal fraksiyon olan 3.1.3 adımında elde edilen peletin (P2) yeniden dürttü.
      NOT: Resüspenzyon tamponunun hacmi başlangıç dokusunun miktarına ve elde edilen pelet miktarına bağlıdır. Örneğin, 150-300 mg beyin dokusu ile başlarken, elde edilen pelet 200 μL resüspenzyon tamponunda yeniden kullanılabilir.
   6. Yeniden canlanan ham sinaptozomları 0,85-1,0-1,2 M sakkaroz eşit hacimlerde yapılmış süreksiz bir sakkaroz gradyanı üzerine yükleyin.
      NOT: Tipik olarak sakkaroz çözeltisinin her biri için 1 mL kullanırız (150-300 mg doku için). Bu daha büyük doku miktarlarına göre değiştirilebilir. Süreksiz gradyanlar, ultracentrifuge tüpünün iç duvarına bastırılmış 25G şırıng ve sakkaroz katmanlarının yumuşak katmanları kullanılarak yapılabilir.
   7. 4 °C'de 2 saat için 85.000 x g'da santrifüj.
      NOT: Santrifüjlemenin yüksek hızı nedeniyle, ısıtmayı azaltmak için vakum oluşturabilen bir ultra merkezigül gereklidir.
   8. 200 μL pipet ucu kullanarak 1.0 ile 1.2 M sakkaroz arasındaki arayüzde sinaptozmal fraksiyonu toplayın.
   9. Sinaptozomal fraksiyonu 18.000 x g'da santrifüjleme ile buz gibi yıkama tamponu ile 4 °C'de 10 dakika yıkayın.
      NOT: Yıkama için, 1.0 ve 1.2 M sakkaroz arayüzünde elde edilen sinaptozmal fraksiyon taze bir 1.5 mL tüpte toplanır ve yüksek sakkarozun ortamdan uzaklaştırılmasını sağlayan eşit hacimde bir yıkama tamponu eklenir.
   10. Sinaptozomal peletı 12.000 g'da buz gibi homojenizasyon tamponu ile 4 °C'de 10 dakika tekrar yıkayın.
   11. Sinaptozomları buzdaki homojenizasyon tamponunda yeniden dirsintir.
       NOT: Protokol burada kısa bir süre duraklatılabilir.
   12. Bradford tahlilini kullanarak protein konsantrasyonu belirlen.
   13. Krebs tamponundaki sinaptozomları 50 μL'lik bir hacimde 2-3 mg protein/mL konsantrasyonda yeniden depolar (sinaptozomlar KCl ile depolarize edilecekse 47,5 μL; bkz. bölüm 4).
       NOT: Resüspensiyon için, sinaptozomal fraksiyon ilk olarak 12.000 x g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca döndürülür ve üst düğme (tampon) çıkarılır. Sinaptozomal pelet daha sonra 200 μL pipet ucu kullanılarak hafif pipetleme ile Krebs tamponunda yeniden sınıflandırılmıştır.
   14. Depolarizasyona devam edin (bölüm 4).
2. Sinaptonürozomların hazırlanması
   NOT: Sinaptoneurozomlar için alternatif protokoller^34,35 de kullanılabilir.
   1. Beyni homojenatı, 1 mL şırıngan kullanarak bir filtre tutucusunda 100 μm gözenek boyutunda önceden ıslanmış bir ağ filtresinden geçirin.
      NOT: Numune kaybını önlemek için tüm filtrelerin önceden ıslatılması önemlidir ve homojenizasyon tamponu kullanılarak yapılmalıdır. Bunun için homojenizasyon tamponu, tampon dışarı akana kadar filtre tutucusunda bulunan filtrelerden 1 mL şırıng kullanılarak geçirilir.
   2. Filtratı (F1) buz üzerinde önceden soğutulmuş 1,5 mL'lik bir tüpte toplayın.
   3. İkinci filtrat (F2) elde etmek için F1 kesir için işlemi (adım 3.2.1 ve 3.2.2) tekrarlayın.
   4. F2 filtratı 5 μm gözenek boyutunda bir ağ filtresinden geçirin.
   5. Filtratı (F3) buz üzerinde önceden soğutulmuş 1,5 mL tüpte toplayın.
   6. Santrifüj filtrat F3 1,500 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca.
   7. Krebs tamponundaki peleti (sinaptoneurozomlar) 50 μL'lik bir hacimde 2-3 mg protein/mL konsantrasyonda buz üzerinde yeniden depolar (sinaptozomlar KCl ile depolarize edilecekse 47,5 μL; bkz. bölüm 4).
      NOT: Protokol burada kısa bir süre duraklatılabilir.
   8. Bradford testini kullanarak protein konsantrasyonu tahmin edin.
   9. Depolarizasyona devam edin (bölüm 4).

4. İzole sinaptik terminallerin KCl aracılı depolarizasyonu

1. 5-10 dakika boyunca 37 °C'de eşkenel lipatokomlar/sinaptoneurozomlar.
2. Hücre dışı K⁺ 'yı 37 °C'de 30 sn için 50 mM'ye çıkarmak ve ilgili uyarılmamış kontrol kümesine eşit hacimde Krebs tamponu eklemek için KCl ekleyerek sinaptozomları /sinaptoneurozomları uyarın.
   NOT: Örneğin, 47,5 μL Krebs arabelleğine yeniden harcanan sinaptozomlara 2,5 μL 1 M KCl ekleyin; ve ilgili uyarılmamış kontrol sinaptozomlarına 2,5 μL Krebs tamponu ekleyin. Çok sayıda örneğin yer aldığı deneyler için, depolarizasyon süresinin 30 s'yi geçmemesi için aynı anda en fazla 2 örnekle devam edin.
3. Glutaraldehit ekleyerek stimülasyonu sonlandırın (bölüm 5).

5. Örneklerin fiksasyonu ve phalloidin lekelenmesi

1. Homojenat/sinaptozomal/sinaptoneurosomal örneklere glutaraldehit ekleyin, oda sıcaklığında 2-3 dakika boyunca% 2,5'lik son konsantrasyona ekleyin.
   NOT: 50 μL numunede (homojenatlar/sinaptozomlar/sinaptoneurozomlar) glutaraldehitin son konsantrasyonunun %2,5 olması için 6 μL%25 glutaraldehit çözeltisi ekledik. Fiksasyon kritiktir ve hızlı olmalı ve bu nedenle glutaraldehit ekledikten hemen sonra, örnek güçlü bir şekilde girdaplanmalıdır.
2. Örnekleri 5 dakika boyunca 20.000 x g'da tortulandır.
3. Üsttekini çıkarın.
   NOT: Glutaraldehit toksik olduğu için süpernatantı duman kaputuna atın.
4. Oda sıcaklığında 2-3 dakika boyunca %0,1 Triton X-100 ve 1 mg/mL NaHB₄ içeren 100 μL Krebs tamponunda resüspenzyon ile peleti dengele.
5. Örnekleri 5 dakika boyunca 20.000 x g'da tortulandır.
6. Geçirgenleştirme arabelleği kaldırılın.
7. Peletin 200 μL Krebs tamponu ile 5 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleme ile yıkayın.
8. Peletin, oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika boyunca 100 μL Krebs tamponunda 1x Alexa Fluor 647 Phalloidin (500 μU'ya karşılık gelir) ile yeniden depolayın ve lekeleyin.
   NOT: Floresan phalloidin analoglarının diğer çeşitleri ticari olarak mevcuttur ve test için değiştirilebilir. Phalloidin konsantrasyonu ve toplam inkübasyon örnek hacmi, test edilen doku/numune miktarına ve türüne göre değiştirilmek ve buna göre optimal koşullar standartlaştırılmalıdır.
9. Lekeli numuneleri 5 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüj edin.
10. İlişkisiz phalloidin 'i (süpernatant) çıkarın.
11. Numuneyi 200 μL Krebs tamponu ile 20.000 x g'da santrifüjleme ile 5 dakika boyunca yıkayın.
12. 0,32 M sakkaroz içeren 200 μL Krebs tamponunda yeniden diriltme.
    NOT: Protokol burada kısa bir süre duraklatılabilir.

6. Florometrik analiz ve ışık saçılım

1. Alexa Fluor 647 Phalloidin lekeli örnekleri siyah 96 kuyu plakasında dağıtin.
2. Floresan yoğunluğunu 645 nm'lik bir ekscitasyon dalga boyunda ve oda sıcaklığında bir plaka okuyucuda 670 nm emisyon dalga boyunda ölçün.
3. 200 μL pipet uçları kullanarak numuneleri siyah 96 kuyu plakasından şeffaf 96 kuyu plakasına aktarın.
4. Önceki sabitleme, permeabilizasyon ve boyama adımları sırasında meydana gelmiş olabilecek kayıpları düzeltmek için ışığın saçılmasını 540 nm olarak ölçün.
   NOT: Lekeli numunelerde tutulan biyolojik malzemedeki varyasyonlar, daha az miktarda başlangıç malzemesi için daha belirgin olabilir (bkz. Tartışma).
5. Krebs tamponuna farklı konsantrasyonlarda bir dizi Alexa Fluor 647 Phalloidin ekleyin (0.05x, Standart eğri olarak testlerin her bir partisi için 25, 50, 125, 175, 250, 375 ve 500 μU'ya karşılık gelen 0,1x, 0,25x, 0,35x, 0,75x, 0,5x ve 1x.
   NOT: Bu isteğe bağlı bir adımdır ve özellikle F-actin düzeyleri göreceli olarak ifade edilirken tahlil sonuçlarını etkilemez (Bölüm 7). Protokol burada duraklatılabilir.

7. Veri analizi

1. Numunelerdeki F-aktinin miktarı, bağlı phalloidin floresan yoğunluğu ile doğru orantılıdır. Etiketli phalloidin standardının doğrusal eğrisinden hesaplanan phalloidin bağlı birimlerinin mutlak cinsinden ifade.
   NOT: Örnek olarak, bkz.
2. Kontrol örneklerinin bir kısmı olarak F-actin seviyelerini ifade edin.
   NOT: Örnek olarak, bkz.

F-actin seviyelerinin değerlendirilmesi için test doğrusallığı
İlk olarak, Alexa Fluor 647 Phalloidin floresanında doğrusal artış için standart bir eğri tespit edildi ve her deney seti için tekrarlandı (Şekil 1). Tahlilin doğrusal aralığını araştırmak için kemirgenlerden (Şekil 2A ve 2B)ve ölüm sonrası insan deneklerden(Şekil 3A ve 3B)farklı miktarlarda beyin homojenliği işlenmiştir. Test, tutulan etiketli phalloidin miktarları ile değerlendirildiği gibi 50-200 μg protein aralığında doğrusal bulunmuştur. Farklı miktarda numuneyi doğrulamak için 540 nm'de ışık saçılım kullanıldı (Şekil 2C ve Şekil 3C).

Latrunculin, bir aktüer depolimerizasyon ajanı etiketli phalloidin bağlanmasını azaltır
Latrunculin A'nın actin filamentlerini depolymerize etmesi ve F-actin36 , 37,38,39seviyelerini azaltması bilinmektedir. Kemirgen veya insan beyin dokularından elde edilen homojenatlar, aktüer filamentlerini depolimerize etmek için 37 °C'de 1 saat boyunca 2 μM latrunculin A ile inkübe edildi. İlgili işlenmemiş kontrol setleri 37 °C'de 1 saat aynı süreyle DMSO ile inkübe edildi. Test, kontrol örneklerinde F-actin seviyelerinin kaybını 95.7 ± 6.6'dan (ortalama ± SEM) kemirgen beyin homojenatlarında latrunculin A ile tedavi edilen örneklerde 72.0 ± 3.2 (ortalama ± SEM) μU bağlı phalloidin μU'ya kadar güçlü bir şekilde ölçtü (Şekil 4A). İnsan beyin dokularından elde edilen homojenatlar latrunculin A tedavisine tabi tutulduğunda etiketli phalloidinin tutulmasında benzer bir azalma (83,7 ± 3,9'dan 66,9'a ±4,2μU) da gözlenmiştir ( Şekil 4B). İmmünblotting ile değerlendirilen dikkat çekici, toplam aktin seviyeleri, hem sıçanda(Ek Şekil 1A-B)hem de insanda ( EkŞekil 1C-D) beyin homojenlerinde latrunculin A ile tedavide değişmedi.

İzole sinaptik terminallerin depolarizasyonuaktüer polimerizasyonunu ve filament oluşumunu uyarır
İzole sinaptik terminallerin ex vivo depolarizasyonunun, aksin polimerizasyonu6, 30,40'ınhızlı uyarılmasıyla sonuçlandığını göstermiştir ve bu fenomen burada bildirilen tahlilin daha fazla teyidi olarak kullanılmıştır. Sinaptik terminallerde zenginleştirilmiş biyokimyasal fraksiyonlar iki farklı şekilde hazırlanmıştır; "Sinaptozomlar" elde etmek için gradyan tabanlı ultrasantrifüjleme yöntemi41,42,43,44 ve sıralı filtrasyon tabanlı bir protokol elde etmek için "sinaptonürosomes"43,45,46. İkincisi için verim daha yüksek olduğu için, doku miktarlarının genellikle sınırlandığı insan ölüm sonrası beyin dokuları için kullandık. Öte yandan, sıçan beyin dokusu deneylerimiz için sinaptik parçaların41 zenginleştirilmesi daha yüksek dereceye sahip sinaptozomları kullanmayı tercih ettik.

Sinaptozomların veya sinaptoneurozomların depolarizasyonu ve aksin polimerizasyonunun uyarılması, hücre dışı K+ ila 50 mM'de kısa (30 saniye) bir artış patlaması ile elde edildi. KCl maruziyeti, kemirgen beyin sinaptozomlarında ilgili mock-uyarılmış kontrollere kıyasla neredeyse% 40 oranında phalloidin bağlanmasına neden oldu (Şekil 5A; ayrıca bkz. Ek Şekil 2A). Daha küçük ( civarında) ancak KCl ile tedavi edilen insan sinaptonürozomlarında da tutarlı bir artış gözlenmiştir (Şekil 5B; ayrıcabkz. Bu deneyler, izole sinaptik terminaller de dahil olmak üzere beyin dokusu örneklerinde F-aktüer seviyelerindeki değişiklikleri belirlemede testimizin sağlamlığını doğrular.

Şekil 1. Alexa Fluor 647 Phalloidin floresan için standart eğri.  Farklı miktarlarda (25-500 μU) etiketli phalloidin floresan emisyonunun doğrusallığı, floresan spektroskopisi ile 645 nm'lik bir ekstrüzyonda ve 670 nm'lik bir emisyonla doğrulandı (R2 = 0.9942). Veriler ortalama ± SEM (n=3) olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. Sıçan beyin dokusundan tüm hücre homojenlerine penisoidin bağlanmasının doğrusallığı.  (A) Phalloidinin farklı miktarlarda homojenatlara (50-300 μg protein) bağlanması değerlendirildi. (B) Bağlama 50-200 μg protein aralığında doğrusaldı (R2 = 0.9602). (C) Numunelerin farklı miktarlarını doğrulamak için 540 nm'de saçılma kullanıldı (R2 = 0.8319). Veriler ortalama ± SEM (n=4) olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. Ölüm sonrası insan beyin dokusundan tüm hücre homojenlerine phalloidin bağlanması.  (A) Çeşitli miktarlarda (50-300 μg protein) phalloidin tutulması değerlendirildi. (B) Phalloidin bağlanmasının 50-200 μg protein aralığında doğrusal olduğu bulunmuştur (R2 = 0.8832). (C) 540 nm'de saçılma, numunelerin değişen miktarlarını doğruladı (R2 = 0.9730). Veriler ortalama ± SEM (n=4) olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4. Latrunculin A'nın F-actin seviyeleri üzerindeki etkileri.  Beyin homojenatlarının aktilyimerleştirici ajan Latrunculin A (2 μM, 1 h at 37°C) ile tedavisi, kemirgende etiketli phalloidin tutulması ile değerlendirilen ilgili sahte işlem görmüş kontrol örneklerine kıyasla akren filamentlerinin miktarlarında önemli bir azalmaya neden oldu (p = 0.0034; eşleştirilmiş iki kuyruklu Öğrenci t-testi) (A) ve ölüm sonrası insan dokuları (p = 0.0011; eşleştirilmiş iki kuyruklu Öğrenci t-testi) (B). Veriler ortalama ± SEM (n=6 çift) olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5. KCl aracılı depolarizasyonun izole sinaptik terminallerde F-aktilon miktarları üzerindeki etkileri.  (A) 37 °C'de 30 s uyarılmış aktiin polimerizasyonunda 50 mM KCl ile sıçan beyninden sinaptozomların inkübasyonu, sonuç olarak phalloidin bağlanmasında bir artışa neden oldu (p = 0.0014; eşleştirilmiş iki kuyruklu Student's t-test). (B) Ölüm sonrası insan beyin dokularından sinaptoneurosomal fraksiyonda da daha küçük bir artış gözlenmiştir (p = 0.014; eşleştirilmiş iki kuyruklu Student's t-test). Veriler ortalama ± SEM (n=6 çift) olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tamamlayıcı Şekil 1. Latrunculin A'nın toplam akredin seviyeleri üzerindeki etkileri.  Beyin homojenatları latrunculin A (2 μM, 37°C'de 1 saat) veya eşit hacimde DMSO (37°C'de 1 saat) ile inkübe edildi. Sabitlemeden önce numune başına 10 μg protein (latrunculin A işlenmiş ve DMSO mock-işlemli kontroller) toplanmıştır. Toplam aktiin düzeyleri immünblotting ile değerlendirildi. Sıçan (A) ve insan (C) beyin homojenatları için temsili lekeler gösterilir. Latrunculin A, hem sıçan(B; p = 0.40; eşleştirilmiş iki kuyruklu Student's t-test) hem de insan (D; p = 0.42; eşleştirilmiş iki kuyruklu Student's t-test) beyin homojenatlarındaki toplam aktüer seviyelerini değiştirmedi. Veriler ortalama ± SEM (n=3 çift) olarak temsil edilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 2. KCl aracılı depolarizasyonun sıçan sinaptozomlarında ve insan sinaptonüromlarında F-aktüer seviyeleri üzerindeki etkileri.  (A) 50 mM KCl (37 °C'de 30 sn) ile sıçan beyninden sinaptozomların inkübasyonu aktisin polimerizasyonunu ve bunun sonucunda phalloidin bağlanmasında bir artışa neden oldu (p = 0.0019; eşleştirilmiş iki kuyruklu Öğrenci t-testi). (B) Phalloidin tutulmasında artış, KCl tarafından depolarize edilen insan sinaptoneurosomal fraksiyonunda da ilgili uyarılmamış kontrollere göre gözlenmiştir (p = 0.015; eşleştirilmiş iki kuyruklu Öğrenci t-testi). Veriler ortalama ± SEM (n=6 çift) olarak temsil edilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.