Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Koyunlarda Erişkin ve Prepubertal Yumurtalıklardan Toplanan In Vitro Olgunlaşmış Oositlerin Vitrifikasyonu

5.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62272

⸱

10 Temmuz 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary Medicine, University of Sassari

Bu makalede

Özet

Protokol, yetişkin ve yavru koyun oositlerinin vitrifikasyonu için standart bir yöntem sağlamayı amaçlamaktadır. Tüp bebek medyasının hazırlanmasından ısınma sonrası kültüre kadar tüm adımları içerir. Oositler, minimum temel hacmi sağlamak için Cryotop kullanılarak MII aşamasında vitrifiye edilir.

Özet

Hayvancılıkta, bir mezbahadan kolayca elde edilebilen çok sayıda yumurtalık ve oosit sayesinde in vitro embriyo üretim sistemleri geliştirilebilir ve sürdürülebilir. Yetişkin yumurtalıklar her zaman birkaç antral folikül taşırken, pubertal öncesi donörlerde, yumurtalıkların antral foliküllerin en yüksek sayılarını taşıdığı 4 haftalıkken maksimum sayıda oosit mevcuttur. Bu nedenle, 4 haftalık kuzular, prepubertal oositlerin gelişimsel yeterliliği yetişkin meslektaşlarına kıyasla daha düşük olsa bile iyi donör olarak kabul edilir.

Temel araştırmalar ve ticari uygulamalar, hem yetişkin hem de prepubertal donörlerden elde edilen vitrifiye oositlerin başarıyla kriyoprezer tasarrufu olasılığı ile artırılacaktır. Prepubertal donörlerden toplanan oositlerin vitrifikasyonu da üretim aralığının kısaltılmasına ve böylece üreme programlarındaki genetik kazancın artırılmasına olanak sağlayacaktır. Bununla birlikte, kriyoprezervasyondan sonra gelişimsel potansiyelin kaybı, memeli oositleri muhtemelen kriyoprezervasyonu en zor hücre türlerinden biri haline getirir. Mevcut kriyoprezervasyon teknikleri arasında vitrifikasyon hayvan ve insan oositlerine yaygın olarak uygulanmaktadır. Teknikteki son gelişmelere rağmen, yüksek konsantrasyonlarda kriyoprotektif ajanların yanı sıra ürpertici yaralanma ve ozmotik strese maruz kalmak hala birkaç yapısal ve moleküler değişikliğe neden olmakta ve memeli oositlerin gelişim potansiyelini azaltmaktadır. Burada, çocuk ve yetişkin donörlerden toplanan ve kriyoprezervasyondan önce olgunlaşmış in vitro koyun oositlerinin vitrifikasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, oosit in vitro olgunlaşmadan vitrifikasyona, ısınma ve ısınma sonrası kuluçka dönemine kadar tüm prosedürleri içerir. MII aşamasında vitrifiye edilen oositler ısınmadan sonra gerçekten döllenebilir, ancak kriyoprezervasyon prosedürleri nedeniyle hasarı geri yüklemek ve gelişim potansiyellerini artırmak için döllenmeden önce ekstra zamana ihtiyaçları vardır. Bu nedenle, ısınma sonrası kültür koşulları ve zamanlama, özellikle oositler genç donörlerden toplandığında, oosit gelişim potansiyelinin restorasyonu için çok önemli adımlardır.

Giriş

Dişi gametlerin uzun süreli depolanmasının, genetik seçim programlarıyla evcil hayvan yetiştiriciliğinin iyileştirilmesi, ex-situ yaban hayatı türlerinin korunması programı ile biyoçeşitliliğin korunmasına katkıda bulunması ve in vitro embriyo üretimi veya nükleer transplantasyon programlarına dahil edilecek depolanmış oositlerin mevcudiyeti sayesinde in vitro biyoteknoloji araştırma ve uygulamalarının artırılması gibi çok çeşitli uygulamalar sunabilir1,2,3. Juvenil oosit vitrifikasyonu da üreme programlarında üretim aralığını kısaltarak genetik kazancı artıracaktır4. Oositlerin ultra hızlı soğutulması ve ısıtılması ile vitrifikasyon şu anda hayvancılık oositleri kriyoprezervasyonu için standart bir yaklaşım olarak kabul edilir5. Ruminantlarda, vitrifikasyondan önce, oositler genellikle in vitro olarak olgunlaştırılır, a sittoir türevi yumurtalıklardan elde edilen foliküllerden alındıktan sonra2. Yetişkin ve özellikle prepubertal yumurtalıklar4,6, gerçekten kriyoprezerserved için neredeyse sınırsız sayıda oosit sağlayabilir.

Sığırlarda, oosit vitrifikasyonu ve ısınmadan sonra, son on yılda birkaç laboratuvar tarafından yaygın olarak bildirilen % 10'> blastosist verimi3. Bununla birlikte, küçük ruminantlarda oosit vitrifikasyonu hem genç hem de yetişkin oositler için hala nispeten yeni kabul edilir ve koyun oosit vitrifikasyonu için standart bir yöntem kurulmaya devam eder2,5. Son gelişmelere rağmen, vitrifiye edilmiş ve ısıtılmış oosit gerçekten de gelişim potansiyellerini sınırlayan çeşitli fonksiyonel ve yapısal değişiklikler sunar7,8,9. Bu nedenle, çok az makale% 10 veya daha fazla vitrifiye / ısıtılmış koyun oositleri2blastosist gelişimini bildirmiştir. Yukarıda belirtilen değişiklikleri azaltmak için çeşitli yaklaşımlar araştırılmıştır: vitrifikasyon ve çözülme çözeltilerinin bileşimini optimize etmek10,11; farklı kriyo cihazlarının kullanımı ile deneme8,12,13; ve in vitro olgunlaşma (IVM)4, 14,15ve/veya ısınmadan sonraki iyileşme süresi sırasında özel tedaviler uygulamak6.

Burada, çocuk ve yetişkin donörlerden toplanan ve kriyoprezervasyondan önce in vitro olarak olgunlaşan koyun oositlerinin vitrifikasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, oosit in vitro olgunlaşmadan vitrifikasyona, ısınma ve ısınma sonrası kültür dönemine kadar tüm prosedürleri içerir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan protokolü ve aşağıda açıklanan prosedürler, Sassari Üniversitesi'nde yürürlükte olan etik yönergelere, Avrupa Birliği Direktifi 86/609/EC'ye ve Avrupa Toplulukları Komisyonu 2007/526/EC'nin tavsiyesine uygundur.

1. Oosit manipülasyonu için medyanın hazırlanması

  1. Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinini 0,1 g/L penisilin ve 0,1 g/L streptomisin (PBS) ile destekleyerek toplanan yumurtalıkların taşınması için ortamı hazırlayın.
  2. 9,5 g Doku Kültürü Ortamı (TCM) 199'u penisilinle desteklenmiş 1 L Milli-Q su ile toz halinde seyrelterek oosit toplama ve olgunlaşma için ortamı hazırlayın (%0,1) ve streptomisinin (%0.1).
    1. Seyreltmeden sonra, 100 mL orta filtreleyin ve bir hafta boyunca kullanılmak üzere Stok Olgunlaşma Ortamı (SMM) olarak 4 °C'de saklayın.
    2. Kalan 900 mL'yi 25 mM HEPES, 0,36 g/L bikarbonat ve %0,1 (w/v) polivinil alkol (PVA) (pH 7,3, osmolality 290 mOsm/kg) ile destekleyerek toplama ortamını (CM) hazırlayın.
  3. Olgunlaşma ortamını 0.021 g/L bikarbonat, %10 ısıl işlem görmüş östrus koyun serumu, 1 IU/mL FSH, 1 IU/mL LH, 100 μL sisteamin ve 8 mg/mL piruvat ile desteklenmiş SMM ile hazırlayın.
    NOT: 10 mL hacimdeki olgunlaşma ortamı, kullanımdan önce en az 4 saat boyunca standart koşullarda (havada % 5 CO2'de 39 °C'de maksimum nemlendirilmiş atmosferde) inkübe edilmelidir.
  4. Baz ortamı (BM) in vitro olgunlaşmadan sonra oosit manipülasyonu için hazırlayın, Ca++ ve Mg++içermeyen PBS'de% 20 fetal baldır serumu (FCS) ile desteklenmiştir.

2. Oosit toplama ve olgunlaşma

  1. Oositleri gençlerden (30-40 günlük yaş, vücut ağırlığı 6-10 kg) ve yetişkin yumurtalıklardan kurtarın.
  2. Toplanan yumurtalıkları ticari mezbahadan 27 °C'de PBS'de 1-2 saat içinde laboratuvara taşıyın.
  3. PBS taze ortamda yıkadıktan sonra, folikül içeriğini serbest bırakmak için yumurtalıkları bir mikro bıçak kullanarak CM olarak dilimleyin.
  4. 60x büyütmeli stereomikroskop muayenesi altında, 4-10 kat granüloza hücreli, düzgün sitoplazmalı oosit, sitoplazmada lipit damlacıklarının homojen dağılımı ve yaklaşık 90 μm (ortalama) dış çapı olanları seçerek in vitro olgunlaşma için kümülüs-oosit komplekslerini (COC' ler) seçin.
  5. Seçilen COC'leri CM'de üç kez yıkayın ve son olarak olgunlaşma ortamında aktarın.
    NOT: Juvenil oositler için, vitrifikasyondan sonra sağkalımını iyileştirmek için, olgunlaşma ortamını 100 μM trehaloz ile destekleyin.
  6. İn vitro olgunlaşma için, 300 μL mineral yağ ile kaplanmış dört kuyulu Petri kaplarında 600 μL olgunlaşma ortamında 30-35 CO'ları aktarın ve 39 ° C'de havada% 5 CO2'de 22 (yetişkin oositler)/24 (juvenil oositler) için kuluçkaya aktarın.
  7. In vitro olgunlaşmadan sonra, kümülüs hücrelerinin TÜB'lerini hafifçe pipetleme ile denude. 60x büyütmeli stereomikroskop altında yapılan incelemeyi takiben, vitrifikasyon için sadece ilk kutup gövdesinde ve dolayısıyla metafaz II (MII) aşamasında ekstrüzyonu gösterenleri seçin.

3. Sperm toplama, dondurma ve çözme prosedürleri

  1. Baz ortamı, %20 yumurta sarısı (v/v) ile desteklenmiş ram extender (200 mM Tris; 70 mM sitrik asit; 55 mM fruktoz; pH 7.2, osmolality 300 mOsm/kg) ile takviye edilen semen kriyoprezervasyonu için hazırlayın.
  2. Meniyi sadece koyun yetiştirme mevsiminde (Ekim-Kasım) toplayın.
  3. Yetişkin koçlardan (2-5 yaş arası), dış ortamda tutulan ve canlı ağırlık bakım rasyonunu besleyen yapay vajina ile boşalmalar elde edin. Koçları ayrı kalemlerde izole edin, ancak birbirleri arasında görsel temas vardır.
  4. Her erkekten en az 8 boşalma elde etmek için tüm üreme mevsimi boyunca haftada bir kez sperm toplamayı tekrarlayın.
  5. Sperm örneklerini toplama işleminden sonra 5 dakika içinde çevresel sıcaklıkta laboratuvara taşıyın ve hemen işleyin. İki-üç koç boşalmalarını bire bir edin ve sperm konsantrasyon spektrofotometrisini değerlendirin.
  6. Havuzlamadan sonra, boşalmaları% 4 gliserol ile desteklenmiş sperm kriyoprezervasyonu için baz ortam ile 400 x 106 spermatozoa / mL'ye kadar seyreltin. Daha sonra seyreltilmiş meniyi 2 saat boyunca 4 °C'ye soğutun ve donmadan önce 20 dakika boyunca dengelendirin.
  7. Meni örneklerini kuru buz üzerinde pelet formunda (0,25 mL) dondurun ve ardından sıvı nitrojene daldırın.
  8. Çözülme için, peleni sterilize edilmiş bir cam şahine koyun ve 39 ° C'de 20 s su banyosuna daldırın.

4. Tüp bebek ve embriyo kültürü

  1. Sentetik ögüktal sıvının (SOF) yapısı için stokları hazırlayın.
    1. Stok A Hazırlayın: 99,4 mL MilliQ-su; 6.29 g NaCl; 0.534 g KCl; 0.161 g KH2PO4; 0.182 g MgSO4 ·7H2O; ve 0.6 mL Sodyum Laktat. 3 aya kadar 4 °C'de tutun.
    2. Stok B Hazırlayın: 10 mL MiliQ-su; 0.210 g NaHCO3; ve 2-3 g Fenol Kırmızısı. 1 ay boyunca 4 °C'de tutun.
    3. Stok C: 10 mL MilliQ-su hazırlayın; ve 0.051 g sodyum piruvat. 1 ay boyunca 4 °C'de tutun.
    4. Stok D Hazırlayın: 10 mL MilliQ-su; ve 0.262 g CaCl2 2H2O. 1 ay boyunca 4 °C'de tutun.
    5. 7.630 mL MilliQ su, 1 mL Stok A, 1 mL Stok B, 0.07 mL Stok C ve 0.7 mL stok D'den oluşan 10 mL SOF hazırlayın.
    6. In vitro fertilizasyon (IVF) ortamı hazırlayın: SOF% 2 ısıl işlem görmüş östrous koyun serumu, 10 μg / mL heparin ve 1 μg / mL hipoutarin (osmolality 280-290 mOsm / kg) ile desteklenir.
      NOT: 10 mL hacimdeki IVF ortamı standart koşullarda (%5 CO2'de39 °C'de maksimum nemlendirilmiş atmosferde%5O 2 ve %90 N2)kullanımdan önce en az 4 saat kuluçkaya yatırılmalıdır.
  2. Donmuş/çözülmüş meni aliquots 1.5 mL ılık IVF ortamının altında sterilize edilmiş bir cam konik tüpte aktarın ve havada% 5 CO2'de nemlendirilmiş bir atmosferde 39 ° C'de 15 dakika kuluçkaya bırakın.
  3. Kuluçkadan sonra, hareketli spermatozoa sıvı sütunun apikal kısmına doğru yüzer. Üst tabakayı toplayın ve sperm hareketliliği değerlendirmesi için gözlemleyin.
    NOT: Sperm hareketliliği parametreleri aşağıdaki ayarlara sahip bilgisayar destekli bir sperm analizi (CASA) sistemi kullanılarak değerlendirilmelidir: Sperm izinin çakışmasını önlemek için elde edilen 25 kare, minimum kontrast 10, ortalama yol 30 μm / s'nin minimum hızı ve aşamalı hareketlilik% 80 düzlük >. Bu sistem ram sperm değerlendirme için özel bir kuruluma sahiptir. Her örnek için, 5 μL sperm süspansiyonu alt örneği, 10 μm derinliğe sahip önceden ısıtılmış bir analiz odasına yüklenir. Sperm hareketliliği faz kontrast mikroskobu kullanılarak 40x'te 37 °C'de değerlendirilir ve en az dört farklı mikroskobik alanda alt örneklem başına en az 500 sperm analiz edilmelidir. Total motile ve progresif motile sperm yüzdesi değerlendirildi. IVF için progresif motile spermatozoa yüzdesi% 30'≥ olmalıdır.
  4. Yüzme türevi motile spermatozoayı 1 x 106 spermatozoa/mL son konsantrasyonda seyreltin ve dört kuyulu Petri kaplarında mineral yağ ile kaplı 300 μL IVF ortamında MII oositleri ile birlikte kuluçkaya yatırın.
  5. 22 saat sonra, %0,4 sığır serum albümini ve oviductal konsantrasyonda esansiyel ve esansiyel olmayan amino asitlerle desteklenmiş SOF içeren dört kuyulu Petri yemeklerindeki varsayımsal zigotları, mineral yağ altında16 kişi tarafından rapor edildiği gibi aktarın ve blastosist aşamasına kadar standart koşullar altında kültüre edin.
  6. 22, 26 ve 32- s tohumlama sonrası, 60x büyütmeli stereomikroskop altında yapılan incelemede, iki farklı blastomer gösteren bölünmüş oosit sayısını kaydedin.
  7. Embriyoları kültürün beşinci gününden başlayarak dokuzuncu gününe kadar günlük olarak gözlemleyin ve yeni oluşan blastosistler 60x büyütmeli stereomikroskop altında muayene ile kayıt altına alınmalıdır.

5. Oosit vitrifikasyonu ve ısınması

NOT: Cihaz kriyotoplarını kullanarak minimum temel hacim (MEV) yöntemini izleyerek vitrifikasyongerçekleştirin 17.

  1. BM'de 2 dakika boyunca 38,5 °C'de beş oositlik bir grubu dengeler. BM kullanımı düşük kalsiyum konsantrasyonu garanti eder ([Ca2++] 2.2 mg/dL)10.
  2. BM'de %7,5 (v/v) dimetil sülfit (DMSO) ve %7,5 (v/v) etilen glikol (EG) içeren equilibrasyon çözeltisine 3 dk maruz kalarak oositleri susuzlaştırın.
  3. Oositleri bir kriyotop cihazına yüklemeden ve 30 s içinde doğrudan sıvı nitrojene sokmadan önce BM'de %16,5 (v/v) DMSO, %16,5 (v/v) EG ve 0,5 M trehaloz içeren vitrifikasyon çözeltisine aktarın.
  4. Biyolojik bir sıcaklığa ısınmak için, her vitrifikasyon cihazının içeriğini sıvı azottan BM'de 38,5 °C'de 1 dakika boyunca 1,25 M trehalozun 200 μL damlasına aktarın ve karıştırmayı kolaylaştırmak için hafifçe karıştırın.
  5. Hücre içi kriyoprotektantların çıkarılmasını teşvik etmek için, Oositleri BM'de 38,5 °C'de 10 dakika boyunca dengelenmeden önce 38,5 °C'de 30 sn için 200 μL azalan trehaloz çözeltisi damlasına (BM'de 0,5 M, 0,25 M, 0,125 M trehaloz) adım adım aktarın.

6. Isınma sonrası oosit kalitesinin değerlendirilmesi

  1. Isındıktan sonra, oositleri PBS'de Ca++ ve Mg++ artı% 20 FCS (BM) olmadan 6 saat boyunca 38,5 ° C'de havada% 5 CO2'de kuluçkaya yatırın.
    NOT: Vitrifikasyon sonrası biyolojik ve yapısal özellikleri geri kazanma oosit yeteneği, kullanılan oositlerin türleri ve sınıfları ile ilişkilidir.
  2. Kriyoprezervasyon hasarlarını geri kazanma oosit yeteneği zamana bağlı olduğundan, oosit döllenmesi için en uygun zaman penceresini tanımlamak için, ısınmadan sonra in vitro kültürün farklı zaman noktalarında (0 h, 2 h, 4 h, 6 h) oosit kalitesini değerlendirin.
    NOT: Yetişkin koyun oositinde, en uygun süre ısınma sonrası 4 saattir; prepubertal oosit için en uygun süre ısınma sonrası 2 saattir.

7. Oosit hayatta kalma değerlendirmesi

  1. Isınmadan hemen sonra ve ısınma sonrası kültürün her zaman noktası için, 100x büyütmeli ters bir mikroskop kullanarak oositleri morfolojik olarak değerlendirin.
    NOT: Silik sitoplazma, hasar zona pellucida ve/veya membran gibi yapısal değişikliklere sahip oositler dejenere olarak sınıflandırılmalıdır.
  2. Çift diferansiyel floresan boyama kullanarak membran bütünlüğü değerlendirmesini doğrulayın.
  3. Oositleri propidium iyodür (PI; 10 μg/mL) ve Hoechst 33342 (10 μg/mL) içeren 2 mL'lik BM'de 38,5 °C'de havada %5 CO2'de 5 dakika kuluçkaya yaslanın.
  4. Taze BM'de üç kez yıkadıktan sonra, Hoechst 33342 için 350 nm'lik bir uyarılma filtresi ve 460 nm emisyon ve 535 nm'lik bir uyarı filtresi ve PI için 617 nm emisyon kullanarak floresan mikroskop altında oositleri gözlemleyin.
    NOT: Sağlam bir zara sahip oositler Hoechst 33342 ile renkli DNA'nın mavi floresanıyla tanınabilir. Hasarlı membranlı oosit, PI ile DNA lekesi nedeniyle kırmızı bir floresan gösterir.

8. Mitokondriyal aktivitenin ve ROS hücre içi düzeylerinin konfokal lazer tarama mikroskopisi ile değerlendirilmesi

  1. MitoTracker Red CM-H2XRos (MT-Red) probunu hazırlayın.
    1. 1 mM çözelti elde etmek için 1 şişe (50 μg) içeriğini 1 mL DMSO ile seyreltin. Seyreltilmiş şişeyi sıvı nitrojende tutun.
    2. Çözeltiyi DMSO ile 1 mM seyrelterek 100 μM stok çözeltisini elde edin ve karanlıkta -80 °C'de saklayın.
  2. 2′,7′-diklorodihydrofluorescein diasetat (H2DCF-DA) probu hazırlayın.
    1. İlk 100 mM çözeltiyi elde etmek için H2DCF-DA'yı% 0,1 polivinil pirrolidon (PVA)/ PBS'de seyreltin. Çözeltiyi karanlıkta -80 °C'de tutun.
    2. 100 μM stok çözeltisini elde etmek için ilk çözeltiyi% 0,1 PVA / PBS'de seyreltin. Karanlıkta -20 °C'de saklayın.
  3. Montaj ortamını (MM) hazırlayın: 10 mL MM için 5 mL gliserol, 5 mL PBS ve 250 mg sodyum azit ekleyin. Kullanıma kadar -20 °C'de saklayın.
  4. 500 nM MT-Red (stok çözeltisi: DMSO'da 100 μM) ile BM'de 38,5 °C'de 30 dakika boyunca oositleri kuluçkaya yaslanın.
  5. MT-Red probu ile inkübasyondan sonra, oositleri BM'de üç kez yıkayın ve 5 μM H 2 DCF-DA (stok çözeltisi: BM'de 100 μM) içeren aynı ortamda20dakika kuluçkaya yatırın.
  6. Problara maruz kaldıktan sonra, oositleri BM'de yıkayın ve% 2,5 glutaraldehit / PBS'de en az 15 dakika sabitlenin.
  7. Sabitleme işleminden sonra, oositleri BM'de üç kez yıkayın ve numunelerin sıkıştırılmasını önlemek için balmumu yastıkları kullanarak 1 mg/ mL Hoechst 33342 ile 4 μL MM'lik bir damla cam kaydıraklara monte edin.
  8. Slaytları değerlendirmeye kadar karanlıkta 4 °C'de saklayın.
  9. Konfokal lazer tarama mikroskobu ile immünal zilli bölümlerin analizini gerçekleştirin. Mikroskop, 40/60x yağ hedefi kullanılarak Ar/He/Ne lazerleri ile donatılmıştır. Bölümleri sıralı ekscitasyona göre analiz edin.
  10. Mitokondriyal değerlendirme için, MT-Red'i tespit etmek için örnekleri çoktoğraf lazerle gözlemleyin (pozlama: 579 nm; emisyon: 599 nm).
  11. Diklorofluorescein (DCF) 18'i belirtmek için 488 nm'de bir argon iyon lazer ışını ve B-2 A filtresi (495 nm maruz kalma ve519 nmemisyon) kullanın.
  12. Her bir oositte, ekvatoral düzlemde MT-Red ve DCF floresan yoğunluklarını ölçün19.
  13. Tüm görüntü alımları sırasında floresan yoğunluğu ile ilgili parametreleri sabit değerlerde koruyun (lazer enerjisi %26, Sıralı Ayarlar 1: PMT1 kazanç 649-PMT2 kazanç 482; Sıralı Ayar 2: PMT1 kazanç 625-PMT2 kazanç 589; uzaklık 0; iğne deliği boyutu: 68).
  14. Leica LAS AF Lite görüntü analizi yazılım paketini kullanarak floresan yoğunluğunun nicel analizinigerçekleştirin, 20tarafından standartlaştırılan prosedürleri izleyerek .
  15. Ekvator düzlemine ulaşana kadar Z ekseninde hareket ederek resimleri bir kez yakalayın.
  16. Her fotoğraf için gri skalaya dönüştürün ve kanal 1'i kapatın (Hoechst mavisi ile ilgili) kapatıldı. Daha sonra meiotik iğ çevresinde, çevrelenmiş bir alana manuel olarak bir ilgi alanı (YATıRıM YGsi) çizin.
    NOT: Yazılım, kanal 2'deki (FITC) piksel ortalama değerini otomatik olarak okuyabilir ve arka planın değerini ondan çıkarabilir.
  17. Piksellerin ortalama değerlerini kaydedin ve istatistiksel analiz için gönderin.

9. İstatistiksel Analizler

  1. Aşağıdaki farklılıkları analiz edin: juvenil ve yetişkin oositlerde sağkalım oranları, kontrol ve trehalozla tedavi edilen juvenil oositlerde sağkalım oranları ve gelişimsel yetkinlik, farklı kalsiyum konsantrasyon ortamı ile vitrifiye edilen erişkin oositlerin sağkalım ve partenogenetik aktivasyon oranları ve gelişimsel yeterliliği, düşük veya yüksek kalsiyum konsantrasyonu ile vitrifiye edilen juvenil oositlerde döllenme oranları ve embriyo üretimi, juvenil vitrifiye oositlerde aktif mitokondri fenotipleri chi kare testi kullanılarak yetişkin ve juvenil vitrifiye oositler arasında ısınma sonrası kültürün farklı zaman noktaları ve partenogenetik aktivasyon oranları.
  2. Isınma sonrası kültürün farklı zaman noktalarında vitrifiye yetişkin oositlerinde bölünme oranını ve embriyo çıkışını analiz edin, mitokondriyal aktivitenin floresan yoğunluğu ve çocuk vitrifiye oositlerinde ROS hücre içi düzeyler, Levene'nin testi ile varyansın homojenliği için analiz edildikten sonra ANOVA tarafından ısınma sonrası kültürün farklı zaman noktalarında. Gruplar arasındaki ve gruplar arasındaki farkları vurgulamak için geçici bir test Tukey testi kullanın.
  3. İstatistiksel yazılım programını kullanarak istatistiksel analiz yapın ve P < 0.05 olasılığının minimum önem düzeyi olduğunu düşünün. Tüm sonuçlar S.E.M ± olarak ifade edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Çocuk donörlerden gelen oosit kriyotoleransı yetişkin olanlara göre daha düşüktür. Gözlenen ilk etki, yetişkin oositlere kıyasla ısınma sonrası sağkalım oranının daha düşük olmasıdır(Şekil 1A; χ2 test P<0.001). Juvenil oositler ısındıktan sonra daha düşük bir membran bütünlüğü göstermiştir (Şekil 1B). Olgunlaşma ortamında trehaloz kullanımı, bu şekerin juvenil oositlerdeki kriyoinjuries'i azaltıp azaltamayacağını doğrulamak için tasarlanmıştır. Ver...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Evcil hayvanlarda oosit kriyoprezervasyonu sadece dişi genetik kaynakların uzun süreli korunmasına izin vermekle kalmaz, aynı zamanda embriyonik biyoteknolojilerin gelişimini de ilerletebilir. Bu nedenle, oosit vitrifikasyonu için standart bir yöntemin geliştirilmesi hem hayvancılık hem de araştırma sektörüne avantaj sağlayacaktır. Bu protokolde, yetişkin koyun oosit vitrifikasyonu için eksiksiz bir yöntem sunulmaktadır ve juvenil oosit için etkili bir vitrifikasyon sisteminin geliştirilmesi için sağlam bir başlangıç nok...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Yazarlar bu çalışma için özel bir fon almadılar. Profesör Maria Grazia Cappai ve Dr. Valeria Pasciu, video seslendirmesi ve video yapımı sırasında laboratuvarı kurmaları için minnettar bir şekilde kabul edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2&asal;,7′-Diklorofloresan diasetatSigma-AldrichD-6883
Albümin sığır fraksiyonu V, proteaz içermezSigma-AldrichA3059
Bisbenzimid H 33342 trihidroklorür (Hoechst 33342)Sigma-Aldrich14533
Kalsiyum klorür (CaCl2 2H20)Sigma-AldrichC8106
Sitrik asitSigma-AldrichC2404
Konfokal lazer tarama mikroskobuLeica Microsystems GmbH, WetzlarTCS SP5 DMI 6000CS
Cryotop KitazatoTıbbi Biyolojik Teknolojiler
CysteamineSigma-AldrichM9768
D- (-) FruktozSigma-AldrichF0127
D (+) Trehaloz dehidratSigma-AldrichT0167
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Dulbecco Fosfat Tamponlu TuzluSu Sigma-AldrichD8537
Yumurta sarısıSigma-AldrichP3556
Etilen glikol (EG)Sigma-Aldrich324558
FSHSigma-AldrichF4021
Glutamik AsitSigma-AldrichG5638
GluteraldehitSigma-AldrichG5882
GliserolSigma-AldrichG5516
GlisinSigma-AldrichG8790
HeparinSigma-AldrichH4149
HEPESSigma-AldrichH4034
HipoutarinSigma-AldrichH1384
Ters mikroskopDiaphot, Nikon
L-AlaninSigma-AldrichA3534
L-ArgininSigma-AldrichA3784
L-AsparaginSigma-AldrichA4284
L-Aspartik AsitSigma-AldrichA4534
L-SisteinSigma-AldrichC7352
L-SistinSigma-AldrichC8786
L-GlutaminSigma-AldrichG3126
LHSigma-AldrichL6420
L-HistidinSigma-AldrichH9511
L-İzolösinSigma-AldrichI7383
L-LösinSigma-AldrichL1512
L-LizinSigma-AldrichL1137
L-MetioninSigma-AldrichM2893
L-OrnitinSigma-AldrichO6503
L-FenilalaninSigma-AldrichP5030
L-ProlinSigma-AldrichP4655
L-SerinSigma-AldrichS5511
L-TirozinSigma-AldrichT1020
L-ValinSigma-AldrichV6504
Magnezyum klorür heptahidrat (MgSO4< / sub>.7H < sub > 2 < / sub >O)Sigma-AldrichM2393
Makler Sayma OdasıSefi-Tıbbi Aletler ltd. Biyosigma Srl
Orta 199Sigma-AldrichM5017
Mineral yağSigma-AldrichM8410
MitoTracker Kırmızı CM-H2XRosThermoFisherM7512
Yeni doğan buzağı serumu ısıyla inaktive edilmiş (FCS)Sigma-AldrichN4762
Penisilin G sodyum tuzuSigma-AldrichP3032
Fenol KırmızıSigma-AldrichP3532
Polivinil alkol (%87-90 hidrolize edilmiş, ortalama mol ağırlığı 30.000-70.000)Sigma-AldrichP8136
Potasyum Klorür (KCl)Sigma-AldrichP5405
Potasyum fosfat monobazik (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655
Propidyum iyodürSigma-AldrichP4170
Koyun serumuSigma-AldrichS2263
Sodyum azidSigma-AldrichS2202
Sodyum bikarbonat (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
Sodyum klorür (NaCl)Sigma-AldrichS9888
Sodyum dl-laktat çözelti şurubuSigma-AldrichL4263
Sodyum piruvatSigma-AldrichP2256
Sperm Sınıfı Analiz CihazıMicroptic SLS.C.A. v 3.2.0
İstatistiksel yazılım Minitab 18.12017 Minitab
Stereo mikroskopOlimpusSZ61
Streptomisin sülfatSigma-AldrichS9137
TaurinSigma-AldrichT7146
TRISSigma-Aldrich15,456-3

Kaynaklar

  1. Arav, A. Cryopreservation of oocytes and embryos. Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).
  2. Mullen, S. F., Fahy, G. M. A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep. Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).
  3. Hwang, I. S., Hochi, S. Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
  4. Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), (2007).
  5. Quan, G., Wu, G., Hong, Q. Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective. Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).
  6. Succu, S., et al. A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 110, (2018).
  7. Succu, S., et al. Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance. Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).
  8. Succu, S., et al. Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).
  9. Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes. Reproductive BioMedicine Online. , (2015).
  10. Succu, S., et al. Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes. Theriogenology. 75 (4), (2011).
  11. Sanaei, B., et al. An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator. Cryobiology. 84, 82-90 (2018).
  12. Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices. Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).
  13. Fernández-Reyez, F., et al. maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices. Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).
  14. Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).
  15. Barrera, N., et al. Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes. PLoS ONE. 13 (6), (2018).
  16. Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations. Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).
  17. Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
  18. Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes. Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).
  19. Dell'Aquila, M. E., et al. Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
  20. Gadau, S. D. Morphological and quantitative analysis on α-tubulin modifications in glioblastoma cells. Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).
  21. los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation. Theriogenology. , (2011).
  22. Leoni, G. G., et al. Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model. PLoS ONE. 10 (4), (2015).
  23. Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).
  24. Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 148, 216-224 (2020).
  25. Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes. Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).
  26. Ciotti, P. M., et al. Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing. Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).
  27. Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1. Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).
  28. Palmerini, M. G., et al. In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).
  29. Leoni, G. G., et al. Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).
  30. Succu, S., et al. Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes. Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).
  31. Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes. Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).
  32. Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution. Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).
  33. Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
  34. De Santis, L., et al. Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters. Placenta. 32, 280-281 (2011).
  35. Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification. Nanomedicine. 6 (6), London, England. 1115-1129 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Oosit VitrifikasyonuIn Vitro MatürasyonKoyun OositleriPrepubertal OositlerErişkin OositlerKriyokoruma TekniğiIsıtma Sonrası KültürKumulus Oosit KompleksiCryotop YöntemiMitokondriyal Aktivite
Koyunlarda Erişkin ve Prepubertal Yumurtalıklardan Toplanan In Vitro Olgunlaşmış Oositlerin Vitrifikasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.