Kriyojenik Olarak Korunmuş Hücrelerden Kriyo-Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskobik Veri Toplama

Summary

Bu protokol, kriyo yapısına sahip aydınlatma mikroskopisi kullanılarak biyolojik kriyo ile korunmuş örneklerin nasıl görüntülenerek görüntülenlerin ortaya koyduğunu göstermektedir. U2OS hücrelerinin sitoskeletonlarını görüntüleyerek metodolojiyi gösteriyoruz.

Abstract

Üç boyutlu (3D) yapılandırılmış aydınlatma mikroskopisi (SIM), floresan etiketli hücresel yapıların geleneksel floresan mikroskopiden daha yüksek çözünürlükte görüntülenmesini sağlar. Bu süper çözünürlüklü (SR) teknik, tüm hücrelerdeki moleküler süreçlerin görselleştirilmesini sağlar ve yapısal ve fonksiyonel bilgileri ilişkilendirmek için elektron mikroskopisi ve X-ışını tomografisi ile birlikte kullanılma potansiyeline sahiptir. Kriyogenik olarak korunmuş örnekler (cryoSIM) için bir SIM mikroskobu yakın zamanda İngiltere senkrotronunda B24 korelatif kriyo görüntüleme kiriş hattında devreye alınmıştır.

Kriyojenik sıcaklıklarda biyolojik örneklerin kriyo-yumuşak X-ışını tomografisi gibi X-ışını mikroskopi yöntemleri ile aynı örneklerin sonraki görüntülemesine uyumlu bir şekilde 3D görüntülenmesi için özel olarak tasarlanmıştır. Bu video makalesi, cryoSIM kullanarak başarılı görüntüleme için ayrıntılı yöntemler ve protokoller sağlar. CryoSIM mikroskopunun çalışmasına ilişkin talimatlara ek olarak, numunelerin, floroforların ve parametre ayarlarının seçimi ile ilgili öneriler de eklenmiştir. Protokol, mitokondri ve tubulin floresan olarak etiketlenmiş U2OS hücre örneklerinde gösterilmiştir.

Introduction

SR görüntüleme teknikleri son on yılda biyologlar tarafından yaygın olarak erişilebilir hale gelmiştir¹. Floresan etiketli örneklerin kırınım sınırının ötesinde yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine izin verirler. Bununla birlikte, SR mikroskopi yöntemlerini kriyojenik sıcaklıklarda örneklerle çalışacak şekilde uyarlamak zor olmuştur². Bu, elektron veya X-ışını tomografisi ile birlikte korelatif görüntüleme için avantajlı olacaktır. Son zamanlarda, SIM kriyojenik örneklerle kullanılmak üzere uyarlanmıştır ve Diamond Light Source Synchrotron'daki (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html) korelatif kriyo görüntüleme kiriş çizgisi B24'te yumuşak X-ışını tomografisi (SXT)³ ile birlikte biyolojik hücrelerin korelatif çalışmalarını sağladığı başarıyla gösterilmiştir. SIM, numuneyi çizgili ışık desenleriyle (Moiré saçakları) üç açıda ve beş aşamada aydınlatarak geleneksel geniş alan mikroskopisinin çözünürlüğünü iki katına çıkarır. Bu ışık desenleri ve örnek floresan arasındaki parazit, alt kırınım yapıları^4,5hakkında ek bilgileri hesaplamalı olarak ortaya çıkarmak için kullanılabilir.

Sim'in kriyojenik uygulamalar için diğer SR tekniklerine göre çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, özel olarak tasarlanmış yanıp sönen floroforlar olmadan çalışabilir; geleneksel floresanlar kullanılabilir, daha geniş bir potansiyel floresan etiketleme ajanlarına erişim sağlar⁶. Buna ek olarak, z dilimi başına sadece 15 görüntü gerektirir (3D olarak; 2D için 9 görüntü), diğer SR yöntemleri ise dilim başına yaklaşık 1000 görüntü alır, örneğin ısıtılma şansını artırır ve bu nedenle eserlere neden olabilecek buz kristali oluşum riskini artırır. Son olarak, bu teknik 10 μm'nin üzerindeki daha kalın biyolojik örnekleri görüntüleyebilir ve tüm hücrelerin neredeyse yerel durumlarında görüntülenebilir⁶. CryoSIM, standart optik bileşenler kullanılarak ve görüntüleme için açık erişim yazılımı ile üretilmiştir, bu da istenirse belgelemeyi ve çoğaltmayı kolaylaştırır⁶. CryoSIM'in 100x/0.9 sayısal diyafram hedefi vardır (Bkz. Malzeme Tablosu); Optik bileşenleri, tasarım parametreleri ve performansı hakkında daha fazla bilgi Phillips ve ark.⁶ tarafından açıklanmıştır.

Protocol

NOT: Bu protokol, iletim elektron mikroskopisi (TEM) 3 mm düz altın ızgaralarda yetiştirilen veya biriken hücreleri içeren numunelerle ilgili olup, dalma dondurma veya yüksek basınçlı dondurma ile vitrifiye edilmiş delikli karbon destek filmi ile. Bu protokol, örneklerin cryoSIM'de görüntüleme için ilgi çekici yerleri haritalamak için geleneksel bir epifluoresans ve brightfield mikroskobu kullanılarak zaten görüntülendiğini varsayar. Tüm protokole genel bir bakış için Şekil 1'e bakın.

1. Kriyo aşamasının hazırlanması

1. LN_2'denstandart bilimsel kuru kağıt mendillerle kaplı bir huniden geçirerek buzsuz sıvı nitrojen (LN₂₎ hazırlayın.
   NOT: LN₂ yanıklara neden olduğundan, kullanırken kriyo koruyucu eldivenler ve gözlükler de dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipmanları giyin. Bu tür sıvılar oksijeni yerinden edebilir ve hızlı boğulmaya neden olabilir ve uygun şekilde havalandırılan bir alanda ele alınmalıdır.
2. Yüzey tozunu basınçlı hava ile kriyo aşamasından çıkarın. Sıvıyı kullanmadan önce basınçlı hava kabından dışarı atın.
3. Numune yükleme kartuşunun uygun odalı numune tutucusu ile yerinde olduğundan emin olun (önceki bir denemeden numune tutucuda ızgara kalmadığını kontrol edin) (Şekil 2).
4. Kapağı kriyo-aşamanın dış dewar'ından çıkarın ve filtrelenmiş LN_2'yi yaklaşık 1/4'ü dolana kadar dökün. Daha fazla dökmeden önce ilk kaynama geçene kadar bekleyin; kabı yaklaşık 2/3^rd dolu olarak doldurun. LN₂ prizden kaynarken nozüleyi işleyiciden ve sahne/optikten uzağa doğrultarak kapağı dikkatlice değiştirin.
5. LN₂ çıkıştan çıkmak durduktan sonra, çıkış borusunu kriyo sahnesindeki sahne dewar'ın üzerine yerleştirin.
6. Sahnenin güç kaynağını takın ve USB kablosunu kriyo aşamasına bağlayın. Isıtmalı numune haznesinin kapağının takılı olduğundan emin olun. Dış dewar'ı sahneye takın.
   NOT: Çıkış borusu kriyo aşamasındaki sahne dewar üzerine yerlenene kadar harici dewar'ı takmayın. LN₂ taşarsa (veya taşmasını önlemek için), USB kablosunu ~10 sn için çekin, dengeye sahip olmasına izin verin ve sensörü yeniden etkinleştirmek için USB kablosunu yeniden bağlayın.
7. LN₂ sahne alanına teslim edildikten sonra, LN_2'nin numune odasına girmesine izin vermek için kriyo aşamasındaki serbest bırakma düğmesine basın.
   NOT: LN₂ hazneyi doldururken sistemi başıboş bırakmayın.
8. Görüntü almaya başlamadan önce sistemin soğumasını ve dengelenmesine izin vermek için ~30-45 dakika bekleyin. Dış dewar'ı düzenli aralıklarla kontrol edin ve dörtte birinden az doluysa (yaklaşık her saat) filtrelenmiş LN₂ ile yüklemeyi deneyin.

2. Örnek saklama kutusunun kriyo aşamasına aktarılması

NOT: Numune saklama kutusunu, tutucuyu ve herhangi bir aletin (örneğin, asalar) uçlarını, numune veya numune odasının içindeki herhangi bir nesne gibi soğuk yüzeylere dokunmadan önce soğutmak için filtrelenmiş LN_2'nin içine daldırın. Biyolojik numuneleri kullanırken bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giyin.

1. Vitrifiye numunelerin kriyo uyumlu bir kapta olduğundan emin olun ve mikroskopla getirin. Örnek haznedeki ışığı açmak için kriyo aşamasındaki ilgili düğmeye basın.
2. Örnek aktarım kasetinin iki plakasını açmak için kaset aracındaki onaltılık anahtarı kullanın. Plakaları iki plaka arasındaki ızgaraya düşecek kadar geniş açın, ancak ızgaranın diğer taraftan düşmesini önlemek için maksimum açık konuma açılmaktan kaçının.
3. Örnek ızgara kutusunu LN_2'denkaldırmak için uzun uzun tokmaklar kullanın, çentiğin sahne alanının içindeki depolama konumunun konumuyla hizalandığı yere çevirin ve sahne alanına yerleştirin. Saklama kutusu kapağını doğru numune konumuna açmak için uygun cihazı (örneğin bir tornavida) kullanın.
4. Ters tokmaklar (veya herhangi bir ince uçlu cerrahi tokmak) kullanarak, TEM ızgarasını numune tutucudan çıkarın, LN_2'niniçine daldırın ve transfer işlemi sırasında LN_2'ye yakın tutarak örnek aktarım kasetinde pozisyona bırakın. Karbon film tarafının yerleştirildiklarından emin olun, böylece sonuçta örnek köprüdeki hedefle karşı karşıya kalacaktır.
5. Kaset aracındaki onaltılık anahtarı kullanarak örnek kartuşu kapatın. Kalan örneklerle birlikte depolama kutusunu kapatın ve çıkarın.
6. Izgarayı içeren kartuşu kaldırmak ve örnek köprüye monte etmek için kaset aracındaki mıknatıs noktasını kullanın. Aktarım işlemi sırasında LN_2'ye daldırılmış/yakın tutun. Yönlendirmenin köprü için uygun olduğundan emin olun (iki mıknatıs köprüdeki mıknatıslarla temas edecektir). Kaseti köprünün konumlandırma pimleri içine düz yerleştirin ve sabit olduğundan emin olmak için hafifçe itin.
   NOT: Sonraki odaklanmış iyon ışın frezeleme için hazırlanmış kırpılmış ızgaralar için bir örnek kaset de B24 kiriş hattındaki CryoSIM tesisinde mevcuttur.

3. Sahne yerleştirme ve odaklama

1. Kriyo-sahne kapağı açmasını görüntüleme konumuna getirin ve numune odası ışığını kapatın. Sahneyi optiklere doğru kaydırarak objektif mercek altına hizalayın. Kolu kullanarak hedefi yavaşça pozisyona bırakın, kriyo-sahnenin kapağında kalmasını sağlayın, ancak dokunmayın.
   NOT: Harici Dewar'ın çıkış borusunun veri toplama sırasında kriyo aşamasındaki sahne alanına dokunmamasını sağlayın.
2. Sahneyi ve optikleri opak siyah bir perde ile örtün. CryoSIM PC'de kontrol yazılımı Cockpit'i başlatın (Şekil 3 ve Şekil 4).
3. Her kamera için okuma modu düğmesine tıklayın ve CONV 3 MHz olarak ayarlayın. Her kameranın sıcaklığının -80 °C olduğundan ve kamera fanının kapalı olduğundan kontrol edin.
4. Yansıyan kamerayı açın. Işıklaraltında, ortam (pozlama 20 ms) seçin ve linkamaltında kondenser'e tıklayın. Video modu düğmesine tıklayın.
5. Mozaik görünüm penceresinde, ızgara anahattını görmek için uzaklaştırın (fare kaydırma). Görülemiyorsa Sahneyi bul'a tıklayın. Dairenin ortasında çift sol tıklatarak ızgarayı ortala.
6. Izgara destek filmi (veya diğer ilgili örnek özellikleri) netleme yapılana kadar, kriyo aşamasını yukarı ve aşağı taşımak için yukarı ve aşağı tuşlarını ve z adımını değiştirmek için sayısal peddeki 9 ve 3 tuşlarını kullanarak (ilk odaklama için 20 μm'ye ayarlayın) numuneyi odakla.
   NOT: Kullanıcının z'de seyahati biterse, kriyo-sahnenin altındaki tekerlek kullanılarak sahne alanı manuel olarak yukarı veya aşağı hareket ettirilebilir. Her seferinde bir çentik çevirin ve örneğin görüş aralığında olup olmadığını kontrol edin. Odaklama kötüleşirse yönü tekrar değiştirin.

4. Brightfield mozaik alımı

1. Sahne ortalandıktan sonra, video modunukapatın ve görünür bir ışık mozaiği toplayın (merkezden dışa doğru sarmal görünen ışık görüntülerinin karolarını üretmek için Mozaik görünümünde mozaiği çalıştır'a tıklayın). Izgara bükülmüşse, ızgara üzerinde farklı konumlar deneyin (Mozaik görünümündeçift sol tıklama), yeniden odaklanın ve kısmi mozaikleri toplamak için Mozaiği yeniden çalıştır'a tıklayın. Alternatif olarak, mozaiğin üzerine odaklanmış bir görüntü bırakın (Şekil 3).
2. Mozaiği kaydet 'itıklatarak görünümü kaydedin. Depolama kutusu ve ilgili kılavuz numarası hakkında bilgi içeren kısa bir dosya adı verin (dosya adına otomatik olarak bir zaman damgası eklenir).

5. İlgi alanlarının belirlenmesi

1. Brightfield mozaiğini, hücrelerin veya biyolojik ilgi çekici özelliklerin daha önce bulunduğu yerler için önceki floresan "harita" görüntülerinin yanı sıra inceleyin. Bu alanların uygun floresan üretip üretmeyeceğine bakın.
   1. Ortam ışığını ve yoğunlayıcıyı ve etkinse video modunu kapatın. Gerekli heyecan lazerini (405, 488, 561 veya 647) açın ve 50 ms pozlama süresi için başlangıçta 50 mW'da ilgili kamerayı ve filtreyiseçin.
      NOT: Floresan sinyaline bağlı olarak bu kamera ve filtre ayarlarını artırın/azaltın.
   2. Bir görüntüyü tutturmak için 0'a ve otomatik kontrast için * tuşuna basın. Alternatif olarak, görüntünün altındaki kaydırıcıyı kullanarak kontrastı manuel olarak ayarlayın.
      NOT: Oda için Lazer işaretini açın.
   3. Uygun floresan içeren biyolojik olarak ilginç hücreler bulunduktan sonra, Mozaik görünümünde Siteyi işaretle düğmesini kullanarak konumlarını işaretleyin.
      NOT: Bu işaretli siteler ekli listede görünecektir ve koordinatlara çift tıklayarak erişilebilir. İşaretli bir siteye dönerken, çift tıklatmadan önce alanı yakınlaştırın.
   4. Görüntü alımına başlamadan önce tüm potansiyel siteleri işaretlemeye devam edin. Mozaiği işaretli sitelerle yeniden kaydedin; Siteleri dosyaya kaydet 'itıklatın.
      1. StitchM yazılımını kullanarak mozaik görüntüleri birbirine dikmek için (B24 beamline'da dahili olarak geliştirilmiştir), .txt mozaik dosyasını .bat uzantılı StitchM dosyasına sürükleyip bırakın ve mozaik karoların birleşik tiff görüntüsünü aynı klasöre kaydedin. İşaretli sitelerle bir görüntüyü kaydetmek için mozaik.txt dosyasını ve işaretleyicileri.txt dosyasını aynı anda simgeye sürükleyip bırakın.
         NOT: Veri toplamayı projenin ihtiyaçlarına göre dengeleyin (örneğin, korelatif görüntüleme yapılacaksa, partner görüntüleme yöntemiyle kaç görüntü alınabileceğini kontrol edin ve kriyoSIM görüntüleme için uygun sayıda site seçin). Buna ek olarak, dış savaş LN₂ ile yeniden doldurulmasını gerektiriyorsa, kriyo aşaması sistemi konum değiştirir ve işaretli siteler büyük olasılıkla aynı konumlara dönmez; bu nedenle, görüntülenecek site sayısını seçerken bunu göz önünde bulundurun.

6. Veri toplama stratejisi

1. Lazer pozlama süresini floresan görüntüdeki dinamik aralıktaki sayılara göre ayarlayın (kamera görünümleri penceresinin altında). Hangi filtrenin uygulanacağını seçin ve bu ayarları kullanılacak her dalga boyu için optimize edin ve her lazeri ayrı ayrı açın.
   NOT: 10.000-20.000 sayım en uygun olmasına rağmen, iyi bir kontrast varsa daha düşük sayımlar kabul edilebilir. İdeal olarak, ızgaranın farklı bölgelerindeki hücreler değişken floresan düzeylerine sahip olabileceğinden, her görüntü yığını elde olmadan önce filtre ayarlarını denetleyin.

7. Veri toplama

1. Açmak için her iki kameraya da tıklayın. İşaretli sitelerden birine dönün ve istediğiniz derinliğe tekrar odaklanın. İlgi çekici bir alana odaklandıktan sonra, elde etmek için z yığınının yüksekliğini seçmek için Makro Aşaması'ndaki XY penceresinde odağın dışına çıkın (⭐ tuşu) ve Üstten kaydet 'itıklatın. Odağın dışına doğru aşağı doğru hareket edin(↓ tuşu), Alta kaydet'e tıklayın ve sonra Merkeze git 'etıklayın ve görüntünün hala odakta olup olmadığını kontrol edin.
   NOT: Örnek yüksekliği pencerede gösterilecektir.
2. Kokpit penceresindeki slm'ye (uzamsal ışık modülatörü) sağ tıklayın ve açının 0,41 olarak ayarlı olduğundan emin olun. Kokpit penceresinde, Tek siteli deneme 'yiseçin.
   NOT: Slm'yi tıklatma; Kokpit görüntü alımı sırasında otomatik olarak açar.
   1. Açılan listeden Yapılandırılmış Aydınlatma 'yıseçin. Yığın yüksekliğini z yüksekliği + 1 μm'ye eşit olacak şekilde değiştirin.
      NOT: 1 μm ilavesi, numunenin tamamının z içinde yakalanmasını sağlar ve rekonstrüksiyon eserlerini en aza indirir.
   2. Üst sıradaki 405 nm ve 488 nm lazerlerin pozlama sürelerini (ms) ve alt sıradaki 561 nm ve 647 nm lazerlerin pozlama sürelerini (iletilen kamera için) girin.
      NOT: Pozlama süresi değerleri, daha önce karar verildi ve ana Kokpit penceresinde gösterilen değerlerle eşleşmelidir.
   3. Ne tür bir görüntüleme yapıldığına bağlı olarak bir dosya adı (adlandırma kuralı: kutu number_grid area_filters_FL) (FL (floresan) veya BF (brightfield) girin. Önceki dosyaların üzerine yazmadan tarih ve saati içeren yeni bir dosya oluşturmak için Güncelleştir'i tıklatın. Ardından, Başlat'ıtıklatın.
3. Veriler toplanırken Kamera görünümünü kontrol edin. Herhangi bir xy yer değiştirmesi varsa görüntüleri yeniden alın. LN₂ dewar görüntü alımı sırasında kriyo aşamasını yeniden doldurursa, Kokpit yazılımındaki İptal düğmesine tıklayarak işlemi iptal edin.
   1. Dış savaş aşama dewar doldurmayı tamamladıktan sonra, yeniden doldurma örneği dikey olarak yerinden koyduğundan denemeyi tekrarlayın. Görüntüyü z içinde yeniden ortalamak için yeniden odaklayın ve Tek site denemesiniyineleyin. Gerekli tüm lazer ve filtre kombinasyonları için Tek site denemesini tekrarlayın.
      NOT: Yeniden doldurmayı bitirmek yaklaşık 30 s-1 dakika sürer. Bir ızgaranın görüntülenmesi sırasında, yeniden doldurma ~4-8x olacaktır.
4. Her konumda, görünür ışığı kullanarak bir z yığını toplayın.
   1. Lazerleri kapatın ve Ortam ışığını ve kondenserinikapatın. Tek siteli denemealtında, Z yığınınıseçin, Ortam ışığını 20 ms pozlama olarak ayarlayın ve z yüksekliğini yukarıdaki gibi tutun.
5. Kılavuzda işaretlenmiş tüm siteler için 7.2 ile 7.4 adımlarını yineleyin.
6. Başka bir örneğe geçmeden önce, Döşemeleri sil 'itıklatarak mozaiği silin.
   1. Bunları silmek için tüm döşemelerin etrafına bir kare çizin. Listedeki tümünü seçip seçili siteleri sil 'i tıklatarak işaretleyicileri de silin.
7. Izgarayı değiştirmeye devam etmeden önce ortam ışığını ve kondenserini kapatın. Aşamayı hedefin altından çıkarmak ve ızgarayı değiştirmek için bölüm 4'teki adımları ters olarak izleyin.

8. Görüntülemeden sonra

1. Görüntüleme tamamlandıktan sonra sahneyi çıkarın ve tüm örnekleri çıkarın. Numune odası ışığını kapatın. Dış dewar'ı çıkarın ve kalan LN_2'yi başka bir kriyo uyumlu kaba çıkarın, böylece dewar güvenli bir şekilde normal sıcaklığa geri dönebilir.
2. Kapak fişini kriyo sahnesine takın. Sahne alanında daha fazla LN₂ kalmadıktan sonra kriyo-sahne ekranını pişirme seçeneği kullanıma sunulana kadar bekleyin. Isıtma moduna girmek için fırınlama düğmesine basın ve buz oluşumunu önlemek için kriyo aşamasındaki nemi çıkarın.

9. Yeniden Yapılanma

1. Ham SIM veri dosyalarını yeniden yapılandırma için uygun iş istasyonuna aktarın. 0,004'lük tüm kanallar için sabit bir Wiener filtresi ve₂₀₀ sapma uzaklığı ile kanala özgü optik aktarım işlevlerini (OTFS) (çok floresan boncuk noktası yayılma işlevlerinden hesaplanır) ve K 0 açılarını (0,29278, -1,8028, 2,3786) kullanarak İşleme Görevi oluşturucu penceresinde toplu olarak işlemeyi çalıştırın.
2. Ek seçenekler panelinde, diğer seçenekleri işaretsiz tutarak negatif yoğunlukların atıldığından emin olun. SIR görüntülerini " işlendi " adlı bir klasörekaydedin.
   NOT: Ticari SIM rekonstrüksiyon yazılımı genellikle yeniden yapılandırılmış SIM verileri üretir ve dosya adını korur, ancak sonunda SIR.dv ekler. Yeniden yapılandırma başarısı hakkında işleme protokolünü, adımları ve istatistiksel bilgileri içeren bir günlük dosyası da oluşturulur.

10. Kromatik vardiya düzeltmesi

1. Kromatik değişimi düzeltmek için Chromagnon⁷ yazılımını indirin.
2. Toplanan verilerin floresan dalga boylarına karşılık gelen kromatik vardiya referans matrisini kullanın (kiriş çizgisi tarafından sağlanır).
   NOT: Referans dosyası, hizalama parametrelerini içeren ve çok floresan nanopartiküller kullanılarak kalibrasyon görüntülerinden elde edilen bir 'kromagnon.csv' dosyasıdır. Aynı anda birden çok veri kümesini toplu olarak işlemek için kullanılabilir.
   1. Örneği görüntülemek için kullanılan lazer dalga boyu ve filtreyle eşleşen uygun başvuru dosyasını seçin ve referans alanına ekleyin. Kaynak alana hizalanacak yeniden yapılandırılmış SIR verilerini ekleyin ve Çalıştır'ı tıklatın.
   2. Floresan sinyalinin artık görüntülerde hizalanıp hizalanmadığını kontrol edin. Toplu işleme için, hizalanacak tüm SIR görüntülerini kaynak alana ve başvuru dosyasını başvuru alanına yerleştirin ve Tümlerini çalıştır 'abasın.

Results

U2OS hücrelerini içeren bir örnek, yeşil mikrotübül sitoskeleton boyası ve kırmızı mitokondri boyası karışımı ile boyandı ve bu da sitoskeleton (yeşil) ve mitokondri (kırmızı) mikrotübül bileşeninin lekelenmesine neden oldu. Daha sonraki görüntülemeler, hücre içindeki mitokondrilerin lokalizasyonunu ve mikrotübüllerin düzenlenmesini göstererek, hücreye sağladıkları yapısal çerçeveyi ve sisoskeletonun çekirdek gibi organellerin etrafındaki montajını vurguladı. CryoSIM'deki çözünürlük standart epifluoresans mikroskopisündekinden önemli ölçüde daha yüksektir (Şekil 5). Şekil 6, geleneksel bir epifluoresans mikroskobundan floresan "haritanın" görüntüleme için ilgi çekici alanları ve ilgili cryoSIM yeniden yapılandırılmış görüntüyü ızgaradaki bir konumdan bulmak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Şekil 1: CryoSIM görüntüleme protokolünün aşamalarını gösteren akış şeması. Kısaltma: cryoSIM = Kriyo yapılı aydınlatma mikroskopisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Kriyo aşaması. (A) Kriyo aşaması kurulumu. (B) Ters kümesler tarafından tutulan örnek bir ızgara. (C) Kriyo-sahnenin bileşenleri. Bağlantı portları turuncuya karşılık gelen renklerle etiketlenir: güç kaynağı, sarı: ısıtmalı sahne kapağı, mavi: harici savaş, yeşil: PC'ye bağlantı. Kısaltmalar: PC = kişisel bilgisayar; LN₂ = sıvı nitrojen. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Kokpit yazılım panellerinin görünümleri. (A) Ana panel, (B) makro aşaması XY, (C) mozaik görünümü, (D) kamera görünümleri. Kısaltma: SLM = uzamsal ışık modülatörü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Kokpit yazılım panellerinin görünümleri. (A) Z yığını tek site deneyi. (B) SI tek site deneyi. (C) Görüntü alımı sırasında kullanılan kokpit yazılımı için klavye kısayolları. (D) CryoSIM mikroskobu, Diamond Light Source synchrotron'daki B24 beamline'da yerindedir. Kısaltma: cryoSIM = Kriyo yapılı aydınlatma mikroskopisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: CryoSIM'in çözünürlüğü( A) İncelenmekte olan bir ızgaranın mozaik görünümü. (B) İlgi Alanı 'nın (AOI) Brightfield görüntüsü. (C) Çözünürlükteki artışı gösteren (D) SIM görüntüsüne kıyasla sözde geniş alan görüntüsü. Beyaz ok SIM rekonstrüksiyon eserlerini gösterir. (E) Yeniden oluşturulan görüntünün piksel yoğunluğu bilgilerini SIMCheck²tarafından oluşturulan ham verilerin ilgili modülasyon kontrast-gürültü oranı (MCNR) değerlerinin renk bilgileriyle birleştiren modülasyon kontrast haritası . Parlak ve karanlık bölgeler sırasıyla yüksek ve düşük kontrast gösterir. Ölçek çubuğu = 10 μm. CryoSIM görüntüleme ayarları: heyecan/emisyon dalga boyları: 488/525 nm, 50 mW lazer gücü, 50 ms maruz kalma süresi ve 647/655 nm, 20 mW lazer gücü, 5 ms maruz kalma süresi. Kısaltma: cryoSIM = Kriyo yapılı aydınlatma mikroskopisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: CryoSIM'de, geleneksel bir epifluoresans haritasından floresan haritasında ızgaradaki bir konumdan görüntü rekonstrüksiyonu. (A,B) Geleneksel epifluoresans mikroskobu ile oluşturulan parlak alan ve floresan görüntü haritalarının yer paylaşımı. Bu harita, daha sonra cryoSIM'deki görüntünün ilgi çekici bölgelerini bulmak için kullanılır. (C)(B)alanında gösterilen yerde elde edilen yeniden yapılandırılmış cryoSIM görüntüsü. Kısaltma: cryoSIM = Kriyo yapılı aydınlatma mikroskopisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Kriyojenik sıcaklıklarda 3D SIM, vitrifiye biyolojik materyal görüntüleme için diğer SR görüntüleme tekniklerine göre birçok avantaja sahiptir. Diğer SR yöntemlerine kıyasla z dilimi başına önemli ölçüde daha az görüntü gerektirir, bu da daha az ışınlama ve vitrifiye numuneler için daha düşük buz kristali oluşumu şansı ile sonuçlanır. Ayrıca tüm hücreleri görüntüleyebilir ve yapıyı işlevle eşleştirmek için X-ışını tomografisi ile ilişkilendirilebilir. İlginçtir ki, piyasada bulunan çoğu florofor ve floresan etiketi, kriyojenik koşullar altında oda sıcaklığına göre daha az ağartıcıdır. Bununla birlikte, oda sıcaklığında en yaygın floroforların yüksek kuantum verimi göz önüne alındığında (bazı durumlarda% 80'den fazla), fotonlarda tespit edilen mutlak kazanç kuantum verimlerindeki değişikliklerden değil, karmaşık ağartma işlemlerindeki azalmadan kaynaklanmaktadır. Kriyojenik sıcaklıklarda floroforların verimi hakkında daha fazla bilgi ⁸.

CryoSIM'e ulaşan örneklerin, daha fazla görüntüleme için tüm potansiyel AOI'lerin vurgulanması içeren bir ızgara "haritası" üretmek için brightfield yeteneğine sahip geleneksel bir kriyolüoresans mikroskobu kullanılarak önceden haritalanmış olması önemlidir (Şekil 5). CryoSIM'deki erişim süresi, daha sonra teknik fizibilite ve biyomedikal etki için değerlendirilen bir teklifin sunulmasını içeren rekabetçi bir süreçle tahsis edilir. Bu nedenle, ekipmandaki zaman her zaman "premium" dır ve önceden eşlenmiş ızgaralar bir tahsisatın en verimli şekilde kullanılmasına izin verir. Buz kristallerinin oluşumunu ve daha sonraki numune hasarını en aza indirmek için numunenin özellikle numune tutucudan görüntüleme platformuna numune transferi sırasında vitrifiye edilmesi de esastır. Örnek, en iyi SIM görüntülerini üretmek için iyi kalitede olmalıdır. İyi hazırlanmış bir örnek aşağıdaki özelliklerle karakterize edilecektir: (a) buz kristali kirlenmesi olmayacak, (b) kullanılan ızgara bir bulucu ızgara olacak, (c) taşıyıcı düz olacak, (d) ızgara örgüsü ve substrat yüzeyi otomatik floresan olmayacak ve (e) destek zarında kırılma olmayacaktır. Bu önkoşullar, dikkatli numune kullanımı ve numunelerin her zaman vitrifiye kalmasını sağlayarak elde edilebilir.

Önerilen örnek floroforların kriyoSIM mikroskopunda yeterli sinyal verip vermeyeceğini önceden kontrol etmek önemlidir. SPEKCheck⁹ gibi araçlar, en uygun florofor ve filtre kombinasyonlarını seçmeye yardımcı olabilir. Ham veri toplama veya yeniden yapılandırma işlemiyle ilgili sorunlar varsa, yeniden yapılandırmadan sonra görüntülerde eserler görünebilir. Çeşitli eserlere örnekler Demmerle ve ark.¹⁰ Yeniden yapılandırma özet dosyasını açarak yeniden yapılandırma en uygun değilse, görüntü yeniden yapılandırma parametreleri SoftWoRx günlük dosyasında gözden geçirilebilir. Belirli bir kanaldaki açılar arasında tutarlı çizgi aralığı ve nispeten tutarlı genlik olmalıdır. %30'dan fazla değişim ve 1'in üzerindeki değerler (boncuk boyutu telafisi uygulanırsa) daha yakından araştırılmalı ve başarısız rekonstrüksiyonları göstermesi muhtemeldir. Buna ek olarak, Fiji'deki SIMcheck² yazılımı, görüntüleme veya rekonstrüksiyon parametresi ayarlarındaki hataların nedenini teşhis etmek için ham ve yeniden yapılandırılmış veriler üzerinde çeşitli kontroller yapmak için de kullanılabilir. SIM kontrolü ve modülasyon kontrast haritası, bir görüntünün hangi alanlarının eserlere karşı gerçek yapılar olabileceğini yorumlayarak yeniden yapılandırılmış verilerin kalitesinin değerlendirilmesine de yardımcı olabilir.

Nükleer alan içindeki düşük modülasyon kontrastı (koyu renkle, Şekil 5E'degösterilmiştir), bu bölgenin yeniden yapılanma eserlerine daha duyarlı olacağı anlamına gelir, bu nedenle çekirdekte gösterilen karma desenlerin bir eser olarak sınıflandırılabileceğini ima eder (Şekil 5D). Güçlü floresan sinyal alanlarının işlenen verilerdeki yerel yapıları doğru bir şekilde yansıtma olasılığı daha yüksektir. Floroforların bir vezikülün toplam yüzeyi gibi daha geniş alanlara dağıtıldığı zayıf sinyal alanlarında, gerçek sinyalin işleme eserleriyle bir arada olması muhtemeldir ve bu verilerin yorumlanmasında dikkatli olunmalıdır. Garip eserler olmadığından ve arka planın genellikle Gauss'lu olduğundan ve sıfıra yakın ortalandığından emin olmak için tam aralıkta yeniden yapılandırılmış verilerin incelenmesinden sonra, veriler genellikle sıfıra kırpılır veya kalıcı değer-arka plan sinyalinin zirvesi-sıfıra çok yakın olmalıdır. Bu, görüntülenen görüntünün dinamik aralığının negatif arka plan yapıtları tarafından baskın olmamasını sağlar. Daha zayıf bir sinyal beklendiğinde, özelliklerin analiz edilmesi ve yeniden inşa eserleri yerine gerçek yapılar olmalarının sağlanmasında ekstra özen verilmelidir.

Görüntüleme sisteminin bazı sınırlamaları vardır. Örnek aşama düz olduğundan, değişken kalınlıklı numuneler veya düz olmayan ızgaralar görüntüleme için ideal denekler değildir. Ayrıca, korelatif görüntüleme yumuşak X-ışını tomografisi kullanılarak yapılacaksa, eğim serisi alımı sırasında X-ışını mikroskopunda görünmeyeceği için ızgara sınırlarına yakın hücreler görüntülenmemelidir. Son olarak, dalma dondurmadan önce numunenin şişirme miktarı görüntüleme kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahiptir; çok az şişkinlik, çok kalın olan örneklerle sonuçlanır, yüksek arka plan gürültüsü ile düşük SIM görüntüler verirken, çok fazla şişkinlik hücrelerin yanlış şekil görmesine ve bu nedenle olay lazer ışınından kaynaklanan ısı hasarına daha duyarlı olmasına neden olabilir. Özetle, cryoSIM biyolojik örneklerin 3D olarak neredeyse yerli bir aşamada görüntülenmesi için güçlü bir floresan mikroskopi aracıdır ve birçok alanda geniş kapsamlı uygulamalara sahiptir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Otomatik ızgaralar	FEI
Autogrids	Thermo Fisher Scientific	1036173
BioTracker 488 Yeşil Mikrotübül Hücre İskeleti Boyası	Sigma-Aldrich	SCT142
Kokpit Yazılımı	Oxford Üniversitesi		https://github.com/MicronOxford/cockpit
kriyo uyumlu poliüretan kap	Jena bioscience	CC-FD-800
Cryo TEM ızgara saklama kutusu	Thermo Fisher Bilimsel Model	#AutoGrid
cryo-SIM mikroskop	Özel yapım	N/A	Özel yapım, tasarım için aşağıdaki referansa bakın:  Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis ve Ian M. Dobbie, "CryoSIM: ilişkili ultrastrüktürel görüntüleme için süper çözünürlüklü 3D yapılandırılmış aydınlatma kriyojenik floresan mikroskobu," Optica 7, 802-812 (2020). Nikon TU Plan Apo 100x/0.9 NA'ya sahiptir.
Kriyostage sistemi	Linkam Scientific Instruments	CMS196
İnce uçlu cerrahi forseps	Ted Pella	38125
MitoTracker Koyu Kırmızı FM	Thermo Fisher Scientific	M22426
Python Mikroskop Yazılımı	Oxford Üniversitesi		https://www.python-microscope.org/
Bilimsel kuru kağıt mendil	Kimberly-Clark 7551
SIM Yeniden Yapılandırma Yazılımı	softWoRx, GE Sağlık Sürümü	6.5.2
StitchM Yazılımı	Elmas Işık Kaynağı		https://github.com/DiamondLightSource/StitchM
numuneler için TEM ızgaraları	Quantifoil Micro Tools	G200F1