Travmatik Beyin Hasarından Sonra Yetişkin Sıçanlarda Mekansal Çalışma Belleğini Değerlendirmek için Bir Metrik Test

Orta travmatik beyin hasarı (TBI) sonrası dikkat, yönetici fonksiyonu ve bazı hafıza açıkları gibi nörolojik açıkların yaygınlığı yüzde 50'den fazladır¹, 2^,3,4,5,6,7,8. TBI, mekansal kısa süreli, uzun süreli ve çalışma belleğinde ciddi bozukluklara yol açabilir⁹. Bu hafıza bozuklukları TBI kemirgen modellerinde gözlenmiştir. Kemirgen modelleri, belleği test etmek için tekniklerin geliştirilmesini sağlayarak, TBI'ın sinirsel bellek sistemlerinde bellek işleme üzerindeki etkisine daha derin incelemeler yapılmasına izin verir.

Sırasıyla topolojik ve metrik mekansal bilgi işleme ile ilgili iki test, uzamsal çalışma belleğinin (SWM) ölçülmesine yardımcı oluyor. Topolojik test, bir nesnenin etrafındaki çevresel alanın veya ilgili bağlantı veya muhafaza alanlarının boyutunu değiştirmeye bağlıdır, metrik test ise nesneler arasındaki açılardaki veya uzaklıktaki değişiklikleri değerlendirir^10,11. Goodrich-Hunsaker ve ark. ilk olarak sıçanlar için insan topolojik testini^{uyarladı 10} ve mekansal bilgi işlemede parietal korteks (PC) ve dorsal hipokampus rollerini ayrıştırmak için metrik görevi uyguladı¹¹. Benzer şekilde, Gurkoff ve meslektaşları lateral sıvı perküsyon yaralanmasından sonra metrik, topolojik ve zamansal sıralama bellek görevlerini değerlendirdi⁹. Beynin belirli bölgelerindeki hasar ile metrik veya topolojik hafıza bozukluğu arasında bir korelasyon vardır. Metrik hafıza bozukluğunun hipokampüsün bilateral dorsal dentat girus ve cornu ammonis (CA) alt bölgesi CA3'teki lezyonlarla ilişkili olduğu, topolojik hafıza bozukluğunun bilateral parietal korteks lezyonları^10,12ile ilişkili olduğu ileri sürlenmiştir.

Bu protokolün amacı, bir sıçan popülasyonundaki mekansal bellek açığını metrik bir görevle değerlendirmektir. Bu yöntem, beyin hasarından sonra SWM mekanizmalarını araştırmak için uygun bir alternatiftir ve avantajları arasında göreceli uygulama kolaylığı, yüksek hassasiyet, düşük tekrarlanabilirlik maliyeti, dinamik gözlem olasılığı ve düşük stres ortamı bulunur. Barnes labirenti^{13 , 14}, Morris su navigasyon görevi^15,16,17veya uzamsal labirent görevleri¹⁸,¹⁹gibi diğer davranışsal görevlerle^{karşılaştırıldığında,}bu ölçüm testi daha az karmaşıktır. Uygulama kolaylığı nedeniyle, metrik test daha kısa ve daha az stresli bir eğitim süresi gerektirir ve sadece 2 gün^{boyunca gerçekleşir 9}: alışkanlık için 1 gün ve görev için 1 gün. Ayrıca, önerdiğimiz testin gerçekleştirilmesi, yeni nesne tanıma (NOR) görevi gibi diğer düşük stres testlerinden daha kolaydır ve fazladan alışkanlık günü gerektirmez²⁰.

Bu makale, beyin hasarından sonra SWM'yi değerlendirmek için basit bir model sunmaktadır. TBI sonrası SWM'nin bu değerlendirmesi patofizyolojisinin daha kapsamlı bir şekilde araştırılmasına yardımcı olabilir.

Deneyler, Helsinki ve Tokyo Bildirgeleri ve Avrupa Topluluğu Deney Hayvanlarının Kullanımına İlişkin Kılavuzların tavsiyeleri sonrasında gerçekleştirildi. Deneyler, Negev Ben-Gurion Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı. Şekil 1'de bir protokol zaman çizelgesi gösterilmiştir.

1. Cerrahi prosedürler ve sıvı perküsyon TBI

1. 22 ± 1 °C oda sıcaklığında ve 12-12 saat açık-karanlık döngülerle% 40-60 nemde bulunan erkek ve dişi yetişkin Sprague-Dawley sıçanlarını seçin.
2. Yemek ve su ad libitumolarak yiyecek sağlayın. Sabah saatleri arasında, yani .m 6:00 ile 12:00 .m arasında deneyler yapın.
3. Deney başlamadan önce hem kontrol hem de TBI grupları için temel nörolojik değerlendirme yapın (aşağıdaki bölüm 2'ye bakın).
4. İndüksiyon için% 4 izofluran ve anestezi bakımı için% 1.5 solunan sıçanları uyuşturun. Tahriş edici bir tepki olarak pedal refleksi veya hareketini test ederek sıçanın hareketsiz hale getirilmesini sağlayın.
   NOT: Anestezi için sürekli izofluran uygulama sistemi kullanın. Tüm yordamları aseptik koşullarda gerçekleştirin.
5. Daha önce açıklandığı gibi paraziteral sıvı-perküsyon yaralanması gerçekleştirin^21,22.
6. Deri altı, kesiden önce prospektif kesi bölgesi boyunca% 0.5 bupivakainin 0.2 mL enjekte eder. sıçanı iyileşme odasına koşturmak ve nörolojik (örneğin felç), solunum (örneğin solunum durması) ve kardiyovasküler durumu (örneğin, yumuşak doku perfüzyonunda azalmalar, gözbebeklerinin renginde değişiklikler ve bradikardi) izlemeye devam edin. Anesteziden önce ameliyat sonrası analjezi olarak 0.01 - 0.05 mg/kg intramüsküler buprenorfin uygulanır. En az 48 saat boyunca her 6 - 12 saat dozları tekrarlayın.

2. Nörolojik Şiddet Skorunun Değerlendirilmesi (NSS)

NOT: Nörolojik eksikliğin değerlendirilmesi, daha önce açıklandığı gibi bir NSS kullanılarak yapıldı ve derecelendirildi^23,24. Motor fonksiyon ve davranıştaki maksimum değişiklik puanı 24 puandır. 0 puanı bozulmamış bir nörolojik durumu gösterir ve 24, daha önce açıklandığı gibi şiddetli nörolojik disfonksiyonu gösterir²⁴.

1. Sıçanın merkezine yerleştirildiğinde bir daire (50 cm çapında) bırakamamasını test edin. Her oturum 30 dakika, 60 dk ve her biri 60 dakikadan fazla sürecek şekilde bu görevi üç kez gerçekleştirin.
   NOT: Sıçanları kuyruk tarafından topluyorsanız, kuyruğun tabanını tutun.
2. Sıçanı sağ refleks kaybı için test edin.
   1. Hayvanı sırta araştırmacının avucunun içine yerleştirin. Hayvan kendini²⁵ (dört pençenin üzerinde durarak) düzeltebiliyorsa 1 puan verin.
3. Sıçanı hemipleji, sıçanın zorla konumlandırmaya karşı koyamaması için test edin.
4. Arkadakinin refleks bükümünü test etmek için sıçanı kuyruğundan kaldırın.
5. Sıçanı düz yürüme yeteneğini test etmek için yere koyun.
6. Üç refleks davranışı için test gerçekleştirin: pinna refleksi, kornea refleksi ve ürkütme refleksi.
   1. Pinna refleksi için, daha önce açıklandığı gibi kulak geri çekilmesini test etmek için hafif dokunsal stimülasyon gerçekleştirin²⁵.
   2. Kornea refleksini test etmek için, göze hafifçe yumuşak bir çubuk uygularken yanıp sönme tepkisini izleyin ve daha önce açıklandığı gibi üçlü göz kırpmasına (3) 0 (yanıt yok) ölçeğinde ölçüm^uygulayın.
   3. Ürkütme refleksi için, bir kalemi tel kafesin üst kısmına sürükleyin ve daha önce açıklandığı gibi 0 'dan (yanıt yok) 3'e (1 cm atlama veya daha fazla) bir ölçekle yanıt kaydedin²⁵.
7. Sıçanı arama davranışı ve secde kaybına göre derecelendirin (bıyıklarını hareket ettirmemek, koklamak veya yeni bir ortama transfer edildikten sonra koşmak)²⁴.
8. Sol ve sağ ön ayaklara ve ardından sol ve sağ arka planlara yerleştirme için uzuv reflekslerini test edin.
9. 1,5 cm genişliğinde bir ışın ile ışın dengeleme görevi ile işlevselliği analiz edin. 20 saniye, 40 saniye ve 60 saniyeden fazla süren oturumlar için testi gerçekleştirin.
10. Kiriş yürüyüş testini üç farklı kirişle çalıştırın: 8,5 cm genişliğinde, 5 cm genişliğinde ve 2,5 cm genişliğinde.

3. Ölçüm görevine hazırlanma

1. Ekipman
   1. Bir tablanın üzerine 200 cm çapında ve 1 cm kalınlığında siyah dairesel bir platform yerleştirin. Masanın yüksekliği zeminden 80 cm yukarıda olmalıdır.
   2. Birbirinden 68 cm uzaklıktaki dairesel platformun ortasına iki farklı nesne kurun.
      NOT: Bu deneyde nesneler için iki cam şişe, 13,5 cm yüksekliğinde bir yuvarlak şişe ve 20 cm yüksekliğinde başka bir yüzlü şişe kullanılmıştır. Stabiliteyi sağlamak için şişeleri suyla doldurun.
   3. Bir kamera hazırlayın ve verileri yakalamak, kaydetmek ve işlemek için gerekli bilgisayar yazılımını yükleyin. Kamerayı zeminden 290 cm yüksekliğe takın.
      NOT: Platform ve kamera arasındaki mesafe kamera özelliklerine bağlıdır. Kamera çerçevesi, testin yapıldığı arenanın tüm alanını kapsamalıdır. Platform ve kamera arasındaki denememizin mesafesi 210 cm idi.
2. Alışkanlık
   1. Görevden bir gün önce, video kaydı olmadan arenaya yerleştirerek sıçanı 10 dakika boyunca yeni ortama alışın.
      NOT: Nörolojik görevleri ve metrik görevi aynı gün gerçekleştirmeyin.
      NOT: Kırmızı ışık alanında ölçüm testleri gerçekleştirin.

4. Ölçüm görevini gerçekleştirme

NOT: Ölçüm görevinin gerçekleştirilmesi iki dönemden oluşur: 1) alışkanlık (15 dk) ve 2) test (5 dk) dönem.

1. Alışkanlık dönemi
   1. Dairesel platformun ortasına birbirinden 68 cm uzaklıkta iki farklı nesne oluşturun.
   2. Sıçanı 15 dakikalık bir süre boyunca nesnelerden eşitlikçi platformun ucuna yerleştirin ve videoyu kaydedin.
   3. Sıçanı platformdan çıkarın ve 5 dakika boyunca tek bir kafese yerleştirin.
   4. Platformu% 5-10 alkolle temizleyin.
      NOT: Platformu iyi havalandırılan alanlarda temizlemek için %70'e kadar alkol kullanılabilir.
2. Test dönemi
   1. Nesneler arasındaki mesafeyi 34 cm'ye düşürün.
   2. Sıçanı platforma 5 dakika yerleştirin ve sıçanın keşif aktivitesini videoya kaydedin.
   3. Platformu% 5-10 alkolle temizleyin.

5. Veri analizi

NOT: Veri analizi, hayvan aktivitesini ve hareketini otomatik olarak kaydeden hayvan davranış çalışmaları için özel olarak tasarlanmış video izleme yazılımı tarafından gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu). Bu yazılım, hareketlilik, etkinlik ve keşif davranışı da dahil olmak üzere çeşitli davranış değişkenlerini otomatikleştirir.

1. Video dosyalarını çözümlemeden önce yazılım donanım anahtarını takın. Video izleme yazılımını başlatın ve hazır ayar Şablonu 'naaçın.
2. Kurulum bölümünde ayarları aşağıdaki gibi doğrulayın: Arena, Deneme Denetimive Ayarları Algılama (bkz. Şekil 2a) .
   NOT: Bu deney için, keşif alanı parametreleri ilgi çekici nesnenin etrafında 6 cm olarak tanımlanır. Farenin bu bölgeye girdiği süre ölçüldü.
3. Ayarları doğruladıktan sonra çoğaltın ve yeniden adlandırın.
4. Programın genel ekranında, fareye sağ tıklayarak Arka Planı Kap.
5. Arka plan görüntüsü için bir video dosyası seçin. Gözat menüsünde video dosyasının konumunu seçin.
6. Görüntüyü yakalayın ve incelenen alanları ve bölgeleri işaretleyin, görüntüyü analiz için kalibre edin. Deneme Denetimi ve Algılama Ayarlarıiçin de aynı adımları uygulayın.
7. Genel menüde Deneme Listesi'ni seçin ve analiz için video dosyalarının listesini indirin.
8. Videoları ekleyin ve gerekli ayarlarla konumu belirtin.
9. Edinme ve Denemeyi Başlat'ı seçin (bkz. Şekil 2b,c). Tüm verileri Excel dosyaları olarak dışa aktarma (bkz. Şekil 2d).
   NOT: Alışkanlık ve test dönemleri için tüm hesaplamaları gerçekleştirin. Metrik görev değerlendirmesi gelişmiş bir şablonla hazırlanır.

Gruplar arasındaki karşılaştırmaların önemi Mann-Whitney testi kullanılarak belirlendi. Sonuçların istatistiksel önemi 0.05 < P <'da dikkate alınırken, istatistiksel olarak yüksek alaka düzeyi 0.01 olarak ölçüldü.

Sonuçlar, müdahaleden önce ve TBI'dan 28 gün sonra tüm gruplar arasında NSS'de herhangi bir fark göstermedi. Her grup 12 dişi veya 12 erkek sıçandan oluşuyordu. TBI tablo 1'desunulduktan sonra 48 saat elde edilen NSS puanları. Yaralanmadan sonra 28. günde önemli nörolojik eksiklik gösteren TBI grubundan sıçanlar deneyden çıkarıldı. Veriler sayım olarak ölçülür ve ortanca ± aralığı olarak sunulur.

Sham-operated kontrol grubu, çalışmanın ilk gününden sonra (NSS-0) 48 saat boyunca herhangi bir nörolojik açık göstermedi. TBI'dan sonra 48 saatte nörolojik açık, erkek TBI sıçanları için erkek sham-operated sıçanlara göre önemli ölçüde daha fazlaydı (5.5(4-7) ve 0(0-0), U = 0, p < 0.01, r = -0.89) ve dişi TBI sıçanları için dişi sham-operated sıçanlara göre (4.5(3.25-6) ve 0(0-0), U = 0, p < 0.01, r = -0.91), Mann-Whitney testine göre (Tablo 1).

Bir Mann-Whitney testi, metrik görev sırasında nesne keşif süresinin erkek TBI sıçanları için önemli ölçüde daha kısa olduğunu gösterdi. erkek sham-operated sıçanlar (0 ± D,3 ile 78 ± Y,2), U = 0, p < 0,01, r = -0,85 (bkz. Şekil 3a,b). Veriler, taban noktasının % olarak ifade edilen saniye olarak ölçülür ve ortalama olarak sunulur ± SEM. Kalan üç zaman puanı (5-10 dk, 10-15 dk ve 20-25 dk) taban çizgisinin yüzdesi olarak hesaplandı.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.