Yöntem makalesi

SARS-CoV-2 Tespiti ve Ölçümü için İki Adımlı Ters Transkripsiyon Damlacığı Dijital PCR Protokolleri

5.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/62295

⸱

31 Mart 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Special Pathogens and Biosafety, Center for Biosafety Mega-Science, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, 2International College, University of Chinese Academy of Sciences, 3Sino-Africa Joint Research Center, 4CAS Key Laboratory of Molecular Virology & Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, 5Center for Infectious and Parasitic Diseases Control Research, Kenya Medical Research Institute

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, iki renkli bir ddPCR sistemi kullanarak SARS-CoV-2 tespiti için farklı tahliller geliştirme adımlarını özetlemektedir. Adımlar ayrıntılıdır ve tahlillerin ve deney performansının nasıl geliştirileceğine dair notlar eklenmiştir. Bu testler birden fazla SARS-CoV-2 RT-ddPCR uygulaması için kullanılabilir.

Özet

Devam eden SARS-CoV-2 pandemisinin teşhisi, dünyadaki tüm ülkeler için bir önceliktir. Şu anda, ters transkripsiyon kantitatif PCR (RT-qPCR), kalıcı bir çözüm bulunmadığından SARS-CoV-2 tanısı için altın standarttır. Bu teknik ne kadar etkili olursa olsun, özellikle düşük bol hedefler söz konusu olduğunda, tespit ve tanıdaki sınırlamalarını gösteren araştırmalar ortaya çıkmıştır. Buna karşılık, qPCR'ye göre üstün avantajlara sahip yeni ortaya çıkan bir teknoloji olan damlacık dijital PCR'nin (ddPCR), düşük miktarda hedef numuneden SARS-CoV-2 tanısında RT-qPCR'nin zorluklarının üstesinden geldiği gösterilmiştir. İleriye dönük olarak, bu makalede, RT-ddPCR'nin yetenekleri, iki renkli bir algılama sistemi kullanarak simpleks, dubleks, tripleks prob karışımı ve dörtlü testlerin nasıl geliştirileceğine dair adımlar gösterilerek daha da genişletilmiştir. SARS-CoV-2 genomunun belirli bölgelerini (N, ORF1ab, RPP30 ve RBD2) hedefleyen primerler ve problar kullanılarak, bu testlerin geliştirilmesinin mümkün olduğu gösterilmiştir. Ek olarak, tahlil iş akışının nasıl geliştirileceği ve verilerin nasıl analiz edileceği konusunda adım adım ayrıntılı protokoller, notlar ve öneriler sağlanmaktadır. Bu iş akışının gelecekteki çalışmalara uyarlanması, küçük bir numunede maksimum hedef sayısının hassas bir şekilde tespit edilebilmesini sağlayacak ve maliyet ve numune verimini önemli ölçüde artıracaktır.

Giriş

İyi bilinen bir teknik olan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), nükleik asit araştırmalarına cevap verebilen güçlü bir teknik haline gelmesinden bu yana çeşitli dönüşümler geçirmiştir. Bu dönüşümler eski tekniğin sürekli bir gelişimi olmuştur. Bu dönüşümler üç kuşakta özetlenebilir1. İlk nesil, güçlendirilmiş hedefleri ölçmek ve tespit etmek için jel elektroforezine dayanan geleneksel PCR'dir. İkinci nesil, numuneleri gerçek zamanlı olarak tespit edebilen ve bir numunedeki hedefleri doğrudan ölçmek için standart bir eğriye dayanan kantitatif gerçek zamanlı PCR'dir (qPCR). Üçüncü nesil dijital PCR (dPCR), standart bir eğriye ihtiyaç duymadan nükleik asit hedeflerinin hem tespitini hem de mutlak nicelleştirilmesini gerçekleştirebilir. dPCR ayrıca, bir duvarın kuyuları tarafından ayrılan reaksiyon odalarından, damlacık bazlı dijital PCR2'de görüldüğü gibi, aynı kuyu içinde yağ, su emülsiyonlarına ve stabilize edici kimyasallara daha da geliştirilmiştir. Damlacık dijital PCR'de (ddPCR), bir numune, daha sonra Poisson istatistikleri 2,3,4 kullanılarak ölçülecek olan bireysel hedefleri içeren binlerce nanolitre boyutlu damlacığa bölünür. Bu teknik, ddPCR'ye, diğer PCR nesillerine kıyasla düşük bol hedeflerin ölçülmesinde bir avantaj sağlar.

Son zamanlarda, birden fazla uygulama, düşük bol hedefleri tespit ederken ve ölçerken ddPCR'nin yaygın olarak kullanılan qPCR'ye göre üstünlüğünü vurgulamıştır 1,5,6. SARS-CoV-2 bu uygulamalar için bir istisna değildir 7,8,9,10,11,12. SARS-CoV-2'nin patlak vermesinden bu yana, bilim adamları virüsün nasıl teşhis edileceği ve verimli bir şekilde nasıl tespit edileceği konusunda çözümler bulmak için tüm cephelerde çalışıyorlar. Mevcut altın standart hala qPCR13 olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, RT-ddPCR'nin, RT-qPCR 7,8,9,10,11,12 ile karşılaştırıldığında, hem çevresel hem de klinik örneklerden düşük miktarda SARS-CoV-2 hedeflerini tespit etmede daha doğru olduğu gösterilmiştir. SARS-CoV-2 ddPCR tarafından yayınlanan çalışmaların çoğu, ticari tahlillere bağlı olarak multipleks tahlillere bağlı olarak simpleks tahlillerine dayanmaktadır. Bu nedenle, SARS-CoV-2 tespiti için multipleks RT-dPCR testlerinin nasıl geliştirileceğini açıklamak için daha fazla şey yapılmalıdır.

Uygun bir tahlil tasarımında çoğullama, maliyetten tasarruf etmek, numune verimini artırmak ve küçük bir numune içinde hassas bir şekilde tespit edilebilecek hedef sayısını en üst düzeye çıkarmak için kullanılabilir. ddPCR ile çoğullama yaparken, belirli bir sistemde kaç floroforun tespit edilebileceği dikkate alınmalıdır. Bazı ddPCR platformları en fazla üç kanalı desteklerken, diğerleri yalnızca iki kanalı destekler. Bu nedenle, iki kanalla çoklama yaparken, ikiden fazla hedefi tespit etmek için daha yüksek dereceli çoklama da dahil olmak üzere farklı yaklaşımlar kullanmak gerekir14,15,16. Bu çalışmada, farklı araştırma uygulamaları için uyarlanabilecek farklı SARS-CoV-2 RT-ddPCR testlerinin nasıl geliştirileceğine dair adımları göstermek için iki renkli bir ddPCR tespit sistemi kullanılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Etik beyan
Wuhan Viroloji Enstitüsü (WHIOV), SARS-CoV-2 üzerine araştırma yapmak ve klinik örneklerden COVID-19'u tespit etmek için Wuhan şehrinin Çin CDC'si tarafından onaylanan laboratuvarlar ve enstitüler arasındadır. Klinik örnekler kullanılarak COVID-19 için yeni tanı teknikleri geliştirme araştırması, Wuhan Viroloji Enstitüsü (2020FCA001) etik komitesi tarafından da onaylanmıştır.

1. Örnek işleme iş akışı (Şekil 1A)

NOT: Çapraz kontaminasyonu önlemek için protokol boyunca, numune işleme (ekstraksiyon ve depolama), reaktif/mastermix hazırlama ve depolama, reaksiyon karışımı hazırlama (numune artı mastermix) ve algılama için özel pipetlere sahip ayrı odaların kullanılması önemlidir. Geliştirilecek tahliller, klinik örneklerin veya araştırma örneklerinin tespitinde kullanılabilir. Tüm numuneler, güvenli laboratuvar prosedürleri kullanılırken bile enfeksiyöz ajanları bulaştırabiliyormuş gibi muamele görmelidir. Numune işleme adımları, uygun kişisel koruyucu ekipmanların (KKD) giyilmesi de dahil olmak üzere katı BSL-2 kurallarına uygun olarak bir biyogüvenlik seviye 2 (BSL-2) laboratuvarında yapılmalıdır.

  1. Örnek devre dışı bırakma
    1. BSL-2 laboratuvarına 1 mL SARS-CoV-2 örneği alın. Numuneleri 65 °C'de 30 dakika boyunca ısıl olarak etkisiz hale getirin.
      NOT: Örnekler çeşitli kaynaklardan gelebilir, bu nedenle, inaktive edilecek hacmin sonraki RNA ekstraksiyonunu sağlamak için yeterli olduğundan emin olunmalıdır. Çoğu ekstraksiyon kiti 200 μL'ye kadar küçük bir numune hacmi gerektirir, bu nedenle inaktivasyon için yaklaşık 1 mL'lik bir numune hacmi yeterli olacaktır. Yüzey aktif maddeler, kitler ve lizis tamponları, laboratuvarların kendi SÇP'sine göre doğrudan inaktivasyon ve RNA ekstraksiyonu için de kullanılabilir.
    2. Numuneleri bir biyogüvenlik kabinine (BSC) götürün ve potansiyel aerosollerin yerleşmesine izin vermek için oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. Numuneleri hemen işlenmediği takdirde 24 saate kadar 4 °C'de saklayın.
      NOT: Numune depolama için belirli bir kap gerekmez. Numuneler, inaktivasyon sırasında kullanılan tüplerde veya kaplarda saklanabilir. Bu çalışma için, çoğu örnek viral taşıma ortamı (VTM) tüplerinde veya 1.5 mL tüplerinde saklandı.
  2. RNA ekstraksiyonu
    NOT: Birçok RNA ekstraksiyon cihazı ve özel protokollere sahip kitler kullanıma hazırdır. Burada, üreticinin talimatlarını izleyen otomatik bir prosedür sunulmaktadır.
    1. Önceden doldurulmuş 96 derinliğindeki kuyu deliği plakasını çıkarın; Manyetik boncukları karıştırmak için yavaşça baş aşağı çevirin. Karıştırdıktan sonra, duvarda olabilecek reaktif ve manyetik boncukları plakanın tabanına konsantre etmek için plakayı düz bir yüzeyde hafifçe sallayın.
    2. Plakanın titreşimini ve sıvı dökülmesini önlemek için alüminyum folyo sızdırmazlık filmini dikkatlice yırtın. 96 delikli plakanın 2. ve 8. sıralarına kuyucuk başına 20 μL proteinaz K ve 200 μL numune ekleyin. Ardından, 96 delikli plakayı 32 kanallı otomatik nükleik asit ekstraksiyon cihazının tabanına yerleştirin.
      NOT: Örneği ekledikten sonra 1 saat içinde programı bilgisayarda çalıştırın.
    3. Manyetik çubuk manşonunu 32 kanallı otomatik nükleik asit ekstraksiyon cihazının kart yuvasına takın. GF-FM502T5-TR"1"GF-FM502T5YH (hızlı sürüm) programını seçin ve çalıştırın.
    4. Ekstraksiyonun tamamlanmasından sonra, nükleik asit numunelerini satır 6 ve 12'de (yaklaşık 100 μL / numune) çıkarın ve temiz nükleaz içermeyen 96 delikli bir plakaya dağıtın. Numuneleri 4 °C'de kullanıma kadar 24 saate kadar veya -20 °C'de daha uzun süre saklayın.
      NOT: Numune plakasının kolonlarıyla doğrudan eşleşebildiği için numuneleri yeni bir 100-200 μL plakaya aktarmak için 100 μL çok kanallı pipet kullanılması önerilir.
  3. cDNA üretimi
    NOT: Uzun süre saklanan numuneler için, birden fazla donma/çözülme döngüsünden kaçının. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir cDNA kiti kullanarak cDNA üretimi gerçekleştirin.
    1. Buz/soğutma bloğuna yerleştirilen 100 veya 200 μL'lik bir PCR tüpüne, reaksiyon başına 2 μL 5x RT ana karışımı (örneğin, Mükemmel Gerçek Zamanlı), 5 μL örnek RNA ve 3 μL RNaz içermeyen ddH2O (toplam hacim 10 μL) ekleyin.
    2. PCR tüpünü 15 dakika boyunca 37 ° C'de (ters transkripsiyon), 5 s için 85 ° C'de (ters transkriptazın ısı inaktivasyonu) ve sonsuz bir süre için 4 ° C'de çalışacak şekilde ayarlanmış bir termal döngüleyiciye yerleştirin.
      NOT: Numuneleri hemen işleyin veya kullanıma kadar 24 saate kadar 4 °C'de veya 6 aya kadar -20 °C'de saklayın.

2. ddPCR testi ve iş akışının optimizasyonu

NOT: Damlacıkları okumadan önce / sonra tahlilleri optimize edin. Sonuçlara bağlı olarak, daha iyi sonuçlar elde etmek için işin herhangi bir noktasında optimize edilebilirler. Aşağıda, ddPCR deneylerini optimize ederken göz önünde bulundurulması gereken bazı yaygın faktörler bulunmaktadır.

  1. ddPCR primerlerini ve problarını doğrulayın (Tablo 1).
    NOT: ORF1ab ve N primerleri Çin CDC17'den, insan endojen kontrol geninden (RPP30) Lu ve ark.18'den ve RBD2 Nyaruaba ve ark.13'ten uyarlanmıştır. RBD2 dışındaki tüm primerler ve problar zaten ddPCR testine tabi tutulmuş ve 7,8,18 optimize edilmiştir.
  2. Pozitif kontrol (dört hedefin tümünü içeren bir örnek), Şablon Kontrolü Yok (NTC; Nükleaz içermeyen su veya hedefi olmayan numune) ve ekstraksiyon / negatif kontrol (bulaşıcı olmayan kültürlü bir insan hücresinden ekstrakte edilen toplam nükleik asit veya sağlık gönüllülerinden toplanan örnekler).
    NOT: Hedef genlerin bilinen kopyalarına sahip standart kontrol örnekleri tercih edilir. Ancak, standartların yokluğunda, kontrollerini veya örnek matrisini tanımlamak için mevcut örnekleri kullanın. Denetimleri test örnekleriyle birlikte çalıştırın.
  3. PCR'nin tavlama adımında (adım 3.2) 55 °C ila 65 °C arasında bir sıcaklık gradyanı ekleyerek tavlama sıcaklığını optimize edin (Şekil 2D).
    NOT: Tavlama sıcaklığı optimizasyonu, damlacık ayırmanın minimum yağmurla maksimum olduğu (kolay hedef tanımlama) en iyi sıcaklığın bulunmasına yardımcı olur. Sonuçları elde ettikten sonra, daha iyi optimizasyon için sıcaklık aralığını daraltın, örneğin 55 ° C ila 60 ° C.
  4. Astar ve prob konsantrasyonlarını optimize edin. Tahlillerde pozitif ve negatif damlacıklar arasında optimum ayrım sağlanamazsa, astar (300-900 nM) ve / veya prob (100-400 nM) konsantrasyonlarını değiştirin.
    NOT: Astar / prob konsantrasyonlarının düşürülmesi, daha düşük bir hedef damlacık genliği ile sonuçlanır ve bunun arttırılması da hedefin genliğini arttırır. Bu, genlik tabanlı çoğullamada yardımcı olabilir.
  5. Analitik duyarlılığı, tercih edildiği gibi hem standart hem de test numunelerini kullanarak boşluk sınırı (LoB), algılama sınırı (LoD), özgüllük ve duyarlılık dahil olmak üzere farklı parametreleri göz önünde bulundurarak test edin.

3. ddPCR iş akışı (Şekil 1B) ve tahlil geliştirme (Tablo 2)

NOT: Diğer ddPCR algılama sistemleri gibi, bu iş akışı da reaksiyon karışımı hazırlama, damlacık oluşturma, PCR amplifikasyonu ve damlacık okuma dahil olmak üzere dört adımdan oluşur (Şekil 1B).

  1. Reaksiyon karışımı hazırlama
    NOT: Tüm tahlilleri temiz ayrı bir odada ve BSC'nin içinde hazırlayın. Temiz eldiven, temiz pipet, nükleaz içermeyen su ve dezenfektanların kullanımı dahil olmak üzere standart önlemlere uyun. Aliquot reaktifleri ayrı tüplerde bulunur ve tekrarlanan donma çözülme döngülerini önlemek için -20 oC'de saklar. Tahlilleri Tablo 2'de gösterildiği gibi hazırlayın. Astar ve prob stok çözeltileri 100 μM'lik yüksek konsantrasyonlarda saklanmalıdır. Çalışma çözeltileri 20-40 μM'lik alikotlarda saklanabilir (nükleaz içermeyen suda seyreltilir).
    1. Tüm tahlillerde ortak adımlar
      NOT: Tahlilleri hazırlamadan önce, numune sayısına bağlı olarak gereken toplam mastermix hacmini hesaplayın. Burada, pipetleme hatalarını hesaba katmak için her bir mastermix bileşen hacmi 1,05 ile çarpıldı.
      1. Reaksiyon malzemelerini oda sıcaklığına çözün ve dengeleyin. Homojenliği sağlamak için reaksiyon bileşenlerini kısaca (30 sn) vorteks edin ve içeriği tüpün dibinde toplamak için kısaca santrifüj.
      2. Çalışma çözeltilerinden Tablo 2'de detaylandırıldığı gibi spesifik reaksiyon hacimlerini karıştırarak tahlil başına bir astar-prob (PP) karışımı hazırlayın.
      3. Problar için 11 μL (1x) 2x ddPCR süper karışımı (dUTP yok), PP karışımı (çalışma çözeltisinden Tablo 2'de gösterildiği gibi tahlile bağlı olarak) ve nükleaz içermeyen suyu kuyu başına 19,8 μL'lik nihai bir hacme karıştırarak mastermix'i hazırlayın. Mastermix'i, numune sayısına bağlı olarak nükleaz içermeyen 96 delikli ddPCR plakasının kuyucuklarına dağıtın.
        NOT: Numune plakası için, bir sütundaki 8 kuyucuğun tümünün çözeltiye sahip olduğundan emin olun. Sadece birkaç kuyucuk kullanılıyorsa, örneğin 5 numune, diğer 3 kuyucuğu her biri 22 μL nükleaz içermeyen su veya kontrol tamponu ile doldurun.
      4. Son reaksiyon karışımı hacmini (22 μL) elde etmek için, mastermix içeren kuyucuk başına 2,2 μL cDNA örneği ekleyin. Plakayı tek kullanımlık bir PCR plaka mühürleyici ile kapatın.
        NOT: Numune eklemelerini belirlenen odada gerçekleştirin. Kontrolleri, yani pozitif, NTC ve ekstraksiyonu dahil edin. Ek olarak, RNA örnekleri düşük konsantrasyondaysa, mastermix'teki su hacmini azaltın ve numune hacmini buna göre 5.5 uL'ye kadar artırın.
      5. Reaksiyon karışımı kuyu başına dağıtıldıktan sonra, plakanın altındaki içeriği toplamak için kısaca vorteks (15-30 s) ve santrifüj (10-15 s). Damlacık üretimi için devam edin.
  2. Otomatik damlacık oluşumu (Ek Şekil 1)
    NOT: Farklı damlacık jeneratörleri kullanılabilir; ancak bu çalışma otomatik damlacık jeneratörü (AutoDG) ile gerçekleştirilmiştir. Amplikon kontaminasyonunu önlemek için, damlacık jeneratörünün ve okuyucuların ayrı alanlarda özel alana sahip olduğundan emin olun. Sarf malzemelerini yüklerken, çapraz kontaminasyonu önlemek amacıyla ellerin sarf malzemelerinin üzerinde hareket etmesini önlemek için öne doğru çalışan cihazın arkasından yüklemeye başlanması önerilir.
    1. Problar için AutoDG yağı, DG32 Kartuşları, pipet uçları, soğutma bloğu, numune plakası, damlacık plakası (yeni temiz ddPCR plakası) ve bir atık kutusu dahil olmak üzere AutoDG'yi kurmak için gereken tüm sarf malzemelerini edinin.
    2. AutoDG dokunmatik ekranında Numune Plakasını Yapılandır'a dokunun ve numunelerin numune plakasında bulunduğu sütunları seçip Tamam'a basın.
      NOT: Ekran, sarf malzemelerinin yüklenmesi gereken YÜKLE'yi gösteren sarıya döner.
    3. AutoDG kapağını açın ve sarf malzemelerini ilgili yerlerine yükleyin.
      NOT: Sarf malzemelerinin yüklenmesi gereken ilgili yerlerde, sarf malzemeleri yüklendiğinde daha sonra yeşile dönecek sarı bir gösterge olacaktır. Bu, dokunmatik ekrana benzer.
    4. Numune plakasını ve damlacık üretim plakasını yükleyin.
      NOT: Damlacık üretim plakası soğutma bloğu üzerine yerleştirilmelidir. Soğutma bloğunun mor (kullanıma hazır) olduğundan ve pembe olmadığından emin olun (renk mora dönene kadar dondurucuda tutulmalıdır).
    5. AutoDG kapağını kapatın, ekranın yeşil olduğundan emin olun (sarf malzemeleri yüklü) ve Damlacık Üretimini Başlat'a basmadan önce yağ türünün Problar için Yağ olduğunu seçin/emin olun.
    6. Damlacıkların oluşmasını bekleyin. Ekran Damlacıklar Hazır gösterdiğinde kapıyı açın ve damlacıkları içeren plakayı çıkarın.
    7. Plakayı, 5 s boyunca 185 oC'de çalışacak şekilde ayarlanmış bir plaka sızdırmazlık elemanı kullanarak delinebilir bir folyo conta ile kapatın. PCR amplifikasyonuna geçin.
      NOT: PCR amplifikasyonu damlacık üretiminden sonraki 30 dakika içinde başlatılmalıdır.
  3. PCR amplifikasyonu
    1. Sızdırmaz damlacık plakasını 96 derinliğinde bir kuyucuk termal çevrimleyicisine yerleştirin, numune hacmini 40 μL'ye ve kapak sıcaklığını 105 °C'ye ayarlayın.
    2. PCR, programı kullanarak damlacıkları yükseltir: 10 dakika boyunca 95 °C (enzim aktivasyonu), 30 s için 94 °C'de 40 döngü denatürasyon ve 57 °C'de 1 dakika tavlama / uzatma, 10 dakika boyunca 98 °C'de enzim deaktivasyonu ve 4 °C'de süresiz olarak tutma adımı. PCR'den sonra, damlacıkları okuyun veya 24 saate kadar 4 ° C'de saklayın.
      NOT: Rampa hızları farklı termal döngüleyiciler için farklılık gösterebileceğinden, tüm adımlarda 2 °C /s rampa hızı kullanın. Damlacıkları okumadan önce damlacık stabilizasyonuna izin vermek için plakayı 4 ° C'de en az 30 dakika tutun.
  4. Damlacık okuma
    1. Termal döngülü 96 delikli plakayı bir damlacık okuyucuya aktarın ve damlacık okuyucuya bağlı bir bilgisayarda beraberindeki yazılımı açın/başlatın.
    2. Kurulum modunda, Yeni'yi seçin ve ardından Kuyu Düzenleyicisi iletişim kutusunu açmak için herhangi bir kuyucuğa çift tıklayın. Okunacak kuyucukları seçin ve Deney: ABS, Supermix : Problar için ddPCR Supermix (dUTP yok), Hedef 1 Türü: Ch1 Bilinmiyor, Hedef 2 Türü: Ch2 Bilinmiyor'u seçin.
      NOT: Negatif, boş, NTC veya pozitif, kontrol örnekleri için hedef 1/2 türü açılır menüsünden seçilebilir.
    3. Hedef veya örnek adlarını plaka düzenine göre atayın ve Uygula'yı seçin. İşiniz bittiğinde Tamam'ı seçin ve oluşturulan şablonu kaydedin. Çalıştır'a tıklayın ve istendiğinde doğru rengi seçin (FAM/HEX).
      NOT: Çalıştırmadan önce sistemin astarlanması, günün ilk çalışmasından önce önerilir. Ayrıca, okuyucudaki tüm ışıkların yeşil olup olmadığını kontrol edin ve değilse, araç ipucu durumunda önerilen uygulamayı izleyin.
    4. Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, plakayı okuyucudan çıkarın. Verileri gerektiği gibi analiz edin.
      NOT: Ön sonuçlar ekranda görülebildiğinden, pozitif numunelerin ilk kuyucuklarda çalıştırılması gerçek zamanlı kalite kontrolü için kullanılabilir.

4. Veri analizi (Ek Şekil 2 ve 3)

  1. Toplam damlacık sayısı için tüm kuyucuklardan gelen verileri kontrol edin. Damlacık sayısı <10.000 ise, sonuçları atın ve testi tekrarlayın. Olumlu ve olumsuz sonuçları kabul etmek için bir kesim ayarlayın. Örneğin, 3 veya daha fazla pozitif damlacığa kadar bir damlacık sayısı, pozitif sonuçlar için kesim olarak düşünülebilir.
    NOT: Simpleks, dubleks, tripleks prob karışımı ve dörtlü testler dahil olmak üzere tüm tahliller için veriler, beraberindeki yazılım kullanılarak üretilir. Ancak, bu yazılım sadece simpleks ve dubleks tahliller için uygundur. Yüksek dereceli multipleks tahliller (>3 hedef) için harici bir yazılıma ihtiyaç vardır.
  2. Simpleks ve dubleks tahliller
    NOT: Harici yazılım simpleks ve dubleks verileri de analiz edebilir. Bununla birlikte, beraberindeki yazılımı kullanmak bu tahliller için daha kolaydır, bu nedenle bu makalede kullanılmıştır.
    1. Analiz edilecek .qlp dosyasına çift tıklayarak dosyayı açın ve Analiz Et'i seçin.
    2. Doğru kanaldaki her bir kuyu için pozitif ve negatif damlacıkları ayırt etmek için 1D Genlik ve 2D Genlikteki eşik araçlarını kullanın. NTC ve pozitif kontrol numuneleri, eşik ayarı için bir kılavuz olarak kullanılabilir.
      NOT: FAM sonuçları Kanal 1'de, HEX/VIC ise Kanal 2'de görülür.
    3. Eşik ayarından sonra, sonuçlar .csv bir dosya olarak dışa aktarılabilir ve Excel'de daha fazla analiz edilebilir veya doğrudan sonuçlar penceresinde okunarak kaydedilebilir.
  3. Tripleks prob karışımı (Ek Şekil 2) ve dörtlü testler (Ek Şekil 2)
    NOT: Tripleks prob karışımını ve dörtlü testi analiz etmeden önce, harici yazılımı indirin. Yüklemeden önce minimum sistem gereksinimlerine bakın.
    1. .qlp dosyasını, üzerine sağ tıklayıp harici yazılımla aç'ı seçerek veya harici yazılımı açıp klasörünüzdeki .qlp dosyasını bulmak için Gözat seçeneğine tıklayarak veya .qlp dosyasını sürükleyip zaten açık olan harici yazılıma bırakarak açın.
    2. Plaka düzenleyici sekmesinde, sekmenin sağ tarafında analiz edilecek kuyucukları seçin.
      1. Tripleks prob karışımı için, deney türü olarak Doğrudan Niceleme (DQ) öğesini seçin, tahlil bilgisi olarak Probe Mix Triplex'i seçin ve hedef adlarını buna göre girin ve ardından Uygula'ya tıklayın.
      2. Dörtlü için, deneme türü olarak Doğrudan Niceleme'yi (DQ) seçin, tahlil bilgisi olarak Genlik Çoklaması'nı seçin ve hedef adlarını buna göre girin ve ardından Uygula'ya tıklayın.
    3. 2B Genlik sekmesinin sol tarafında, Küme Atamak İçin Seç penceresi açılır önerilerinin ardından farklı hedef kümelere belirli renkler atamak için Grafik Araçları'nı kullanın.
      NOT: Tercih edilen küme modu, kullanıcıların tercihine göre uygulanabilir.
    4. Hedef renkler atandıktan sonra, niceleme verileri sağ alttaki Kuyu Verileri Penceresinde okunabilir. Kuyu veri tablosunun sağ üst köşesindeki üçlü çubuk simgesini kullanarak daha fazla analiz için verileri Excel/csv'ye dışa aktarın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bir kavram kanıtı çalışmasında, multipleks tahlillerin analitik performansı klinik ve araştırma örnekleri üzerinde test edilmiştir19. Multipleks tahlillerin performansı RT-PCR 19'unkinden daha üstündü. Düşük sayıda damlacık damlacık üretimi sırasında bir soruna işaret edebileceğinden, bu makalede ampirik verilere dayanarak kuyu başına 10.000 damlacık kesimi ayarlanmıştır.

Minimum yağmur paraziti ile pozitif ve negatif damlacıklar arasında iyi bir...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

SARS-CoV-2 tespiti için RT-ddPCR testlerinin nasıl geliştirileceği konusunda çok az kaynak mevcuttur. Bu makalede kullanılmamasına rağmen, bilinen kopyaları olan standart numuneler, tahlilleri geliştirmek ve optimize etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu çalışmada, Vero-E6 hücrelerinde yetiştirilen SARS-CoV-2 örnekleri, insan genomik RNA'sının bir arka planında çivilendi ve tahlilleri geliştirmek için standart örnekler olarak kullanıldı. Tahliller geliştirilirken uygun astar ve prob dizileri esastır. SARS-CoV-2...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu araştırma, Çin Sağlık Bakanlığı'ndan Bulaşıcı Hastalık Kontrolü Mega Projesi, hibe numarası 2017ZX10302301-005 ve Çin-Afrika Ortak Araştırma Merkezi, hibe numarası SAJC201605 tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
32 kanallı tam otomatik nükleik asit çıkarıcı Temizleyici 32Genfine BiotechFHT101-32RNA için otomatik çıkarıcı
Problar için AutoDG YağıBioRad12003017QX200 AutoDG sarf malzemesi
ddPCR 96 Kuyulu PlakalarBioRad12003185
ddPCR Problar için Supermix (dUTP yok)BioRad1863024ddPCR testi mastermix yapımı
DG32 AutoDG KartuşlarıBioRad1864108QX200 AutoDG sarf malzemesi
Elektronik termostatik su küvetiPekin Changfeng Enstrüman ve Metre ŞirketiXMTD-8000Numunelerin ısıyla inaktivasyonu
FineMag Hızlı Boncuk Virüsü DNA/RNA Ekstraksiyon KitiGenfine BiotechFMY502T5İnaktive edilmiş RNA örneklerinin manyetik boncuk ekstraksiyonu Delinebilir
Folyo Isı ContalarıAutoDG için BioRad1814040
Pipet UçlarıBioRad1864120QX200 AutoDG sarf malzemesi
AutoDG için Pipet Ucu Çöp KutularıBioRad1864125QX200 AutoDG sarf malzemesi
PrimeScript RT Master Mix (Mükemmel Gerçek Zamanlı)TaKaRaRR036AcDNA üretimi
PX1 PCR Plaka KapatıcıBioRad1814000Damlacık plakasını kapatın AutoDG
QuantaSoft 1.7 YazılımıBioRad10026368Veri toplama ve analizi
QuantaSoft Analysis Pro 1.0BioRadN/AVeri analizi
QX200 Otomatik Damlacık Gererator (AutoDG)BioRad1864101QX200 AutoDG sarf malzemesi
QX200 Damlacık OkuyucuBioRad1864003Damlacık okuma ve veri toplama
T100 Termal DöngüleyiciBioRad1861096Damlacık hedef amplifikasyonu (PCR) ve cDNA üretimi

Kaynaklar

  1. Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
  2. Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
  3. Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: a technology review. Sensors. 18 (4), Basel, Switzerland. 1271(2018).
  4. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236(1999).
  5. Kuypers, J., Jerome, K. R. Applications of digital PCR for clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621(2017).
  6. Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
  7. Liu, X., et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).
  8. Suo, T., et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).
  9. Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).
  10. Lv, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR. Science of The Total Environment. 742, 140370(2020).
  11. Yu, F., et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).
  12. Scutari, R., et al. Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis. Life. 10 (11), 302(2020).
  13. Nyaruaba, R., et al. Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection. Preprints. , (2020).
  14. Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).
  15. Dobnik, D., Štebih, D., Blejec, A., Morisset, D., Žel, J. Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection. Scientific Reports. 6 (1), 35451(2016).
  16. Nyaruaba, R., et al. Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis. Microorganisms. 8 (5), 701(2020).
  17. VDC Institute. Specific primers and probes for detection 2019 novel coronavirus. , Available from: http://www.chinaivdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html (2020).
  18. Lu, R., et al. SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge. medRxiv. , (2020).
  19. Nyaruaba, R., et al. Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing. Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ters Transkripsiyon PCRMultiplex ddPCR Analiziki A amal RT ddPCRViral KantifikasyonD pleks AnalizTripleks Prob Kar mKuadrupleks AnalizMutlak Kantifikasyon

İlgili makaleler