İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Retinal Organoidlerin Yönlendirilmiş İndüksiyonu

Summary

Kendi kendini organize eden bir yöntem kullanarak, fotoreseptörlerin oluşumunu önemli ölçüde artırabilecek COCO ilavesiyle bir protokol geliştiriyoruz.

Abstract

Retina hücre transplantasyonu, retina mimarisini geri yükleyebilen ve dejenere olmuş retinanın görsel yeteneklerini stabilize edebilen veya hatta geliştirebilen umut verici bir terapötik yaklaşımdır. Bununla birlikte, hücre replasman tedavisindeki ilerleme, şu anda yüksek kaliteli ve standartlaştırılmış insan retinalarının hazır bir kaynağına ihtiyaç duymanın zorluklarıyla karşı karşıyadır. Bu nedenle, deneyler için kolay ve kararlı bir protokole ihtiyaç vardır. Burada, eksojen moleküllerin ve reaktif A'nın yanı sıra üç boyutlu insan retina organoidlerini (RO) üretmek için manuel eksizyonun kullanıldığı kendi kendini organize eden bir yönteme dayanan optimize edilmiş bir protokol geliştiriyoruz. İnsan Pluripotent Kök Hücreleri (PSC'ler) kaynaklı RO, fotoreseptörler için spesifik belirteçleri ifade eder. Çok fonksiyonlu bir antagonist olan COCO'nun eklenmesiyle, fotoreseptör öncüllerinin ve konilerinin farklılaşma etkinliği önemli ölçüde artar. Hücre hatlarının ve birincil hücrelerin faydalarına sahip olan ve ikincisiyle ilişkili kaynak sorunları olmadan bu sistemin verimli kullanımı, özellikle fotoreseptörler olmak üzere akan retinal hücreler üretebilir. Bu nedenle, PSC'lerin RO'ya farklılaşması, hastalık modellemesi, ilaç taraması ve hücre nakli için optimal ve biyoilgili bir platform sağlar.

Introduction

Pluripotent kök hücreler (PSC'ler), kendilerini yenilemeleri ve her türlü somatik hücreye farklılaşma yetenekleri ile karakterize edilir. Böylece, PSC'lerden türetilen organoidler, rejeneratif tıp araştırmalarında önemli bir kaynak haline gelmiştir. Retina dejenerasyonu, fotoreseptörlerin (çubuklar ve koniler) ve retinal pigment epitelinin kaybı ile karakterizedir. Retinal hücre replasmanı bu hastalık için cesaret verici bir tedavi olabilir. Bununla birlikte, hastalık araştırması ve tedavisi için insan retinası elde etmek mümkün değildir. Bu nedenle, çok katmanlı doğal retina hücrelerini etkili ve başarılı bir şekilde özetleyen PSC'lerden türetilen retinal organoidler....

Protocol

Bu çalışma Capital Medical Üniversitesi, Pekin Tongren Hastanesi Kurumsal Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. H9 hESC'ler WiCell Araştırma Enstitüsü'nden elde edildi ve genetik olarak tdTomato etiketli hücre hattına göre tasarlandı.

1. İnsan RO'larının üretimi

1. hESC'leri besleyicisiz koşullar altında kültürleyin.
   1. 6 delikli bir plakanın bir oluğunu, üreticinin talimatlarını izleyerek en az yarım saat boyunca 37 ° C'de 1 mL 0.1 mg / mL reaktif A (Malzeme Tablosu) ile kaplayın. 1x10⁶ hESC'lik bir aliquot'u çözün.
      NOT: 3 mL önceden ısıtılmış reaktif B (Malzeme Tablosu) hazırlayın....

Results

Şematik çizim, COCO ile öncü hücreleri geliştirmek için farklılaşma protokolünü göstermektedir (Şekil 1). PSC'den RO'lara kadar çok sayıda ayrıntı sonuç farklılıklarına neden olabilir. Tüm prosedürü izlemek için her adımın ve hatta her ortamın katalog numarasının ve lot numarasının kaydedilmesi önerilir.

Burada, 6, 12, 18 ve 45. günler için parlak alan görüntüleri sağlıyoruz (Şekil 2). 6. günde, organoidler genellikle 96 delikli bir p.......

Discussion

Retinal organoid farklılaşması, bol fonksiyonel retina hücrelerinin oluşumu için arzu edilen bir yöntemdir. RO, pluripotent kök hücreler tarafından nöral retinaya doğru üretilen gangliyon hücreleri, bipolar hücreler ve fotoreseptörler gibi farklı retinal hücrelerin bir bileşimidir 4,5,8,9. Akıcı RO'lar hasat edilebilse de, uzun kültürleme süreleri (180 güne kadar) gerektirebilecek zaman alıcıdı.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-merkaptoetanol	Yaşam Teknolojileri	21985-023
COCO	R& D Systems	3047-CC-050	DAN Domain BMP antagonistleri ailesi
DMEM/F-12	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Fetal Sığır Serumu (FBS), İnsan Embriyonik Kök Hücreleri için Nitelikli	Biyolojik Endüstri	04-002-1A
GMEM	Gibco	11710-035
Nakavt Serum Değiştirme-Çok Türlü	Gibco	A3181502
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100X)	sigma	M7145
Kalem Strep	Gibco	15140-122
Primesurface 96 V-plaka	Sbio	MS9096SZ	1.2.7 Pirüvatta hücre agregasyonu
	Sigma	S8636
Reaktif A	BD	356231	Matrigel 1.1.1
Reaktif B	Kök Hücre	5990	mTeSR-E8, 1.1.2
Reaktif C	Gibco	12563-011	TrypLE Express 1.2
Reaktif D	Roche	11284932001	DNase I, 1.2
Retinoik asit	Sigma	R2625-100MG	içinde
SAG	Enzo Yaşam Bilimleri	ALX-270-426-M001
Ek 1	Yaşam Teknolojileri	17502-048	N-2 Takviyesi (100X), Sıvı, medum III'te supplemet
Taurin	Sigma	T-8691-25G
Tripsin-EDTA (% 0.25), fenol kırmızısı	Gibco	25200056	organoidlerin ayrışması 2.1.3
Wnt Antagonisti I, IWR-1-endo - Calbiochem'de	Sigma	681669	Wnt inhibitörü
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049