Genetik Olarak Hedeflenmiş Retinal Hücre Popülasyonlarının Seyrek Adeno İlişkili Virüs Etiketlemesi Kullanılarak Nöronal Arborizasyonun Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Retinal nöronların dendritleri, nöral devreler içindeki işlevlerini etkileyen karmaşık, ancak spesifik kalıplar oluşturur. Omurgalı retinasında, çeşitli tipte retinal ganglion hücreleri (RGC'ler) ve amakrin hücre internöronları, ağaç dikme boyutu, yeri, dal uzunluğu ve yoğunluğu bakımından farklılık gösteren benzersiz dendritik morfolojiler ^taşır1. Postnatal gelişim sırasında, RGC'ler ve amakrin hücreler, coşkulu dendritik süreçleri, fotoreseptör sinyallerini ileten bipolar hücre girdilerini aldıkları iç pleksiform tabaka (IPL) adı verilen bir nöropil içine ^{genişletirler2}. Civciv veya zebra balığı larvalarında floresan olarak etiketlenmiş retinal popülasyonların hızlandırılmış görüntülenmesiyle yakalandığı gibi, dendrit morfogenezi oldukça dinamiktir3,4,5. Birkaç gün içinde, dendritik arborslar IPL'nin dar alt katmanlarına genişler, yeniden şekillenir ve yükselir, burada seçkin ortaklarla sinaps yaparlar. Arbors, gelişim üzerinde farklı yapısal dinamikler sergiler ve göreceli dal ilavesi, geri çekme ve stabilizasyon oranlarındaki değişikliklerle birlikte. Amakrin ve RGC dendritleri ayrıca tipe özgü ağaçlandırmayı yansıtabilecek farklı büyüme ve yeniden şekillendirme davranışları sergiler. Bununla birlikte, bu çalışmalar geniş amakrin veya RGC popülasyonlarını izlemiş ve morfolojinin sadece bir yönü olan laminer hedeflemeye odaklanmıştır.

Retinal alt tiplerde gözlenen geniş morfolojik çeşitliliği üreten mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu grubun amacı, farelerde tanımlanmış retinal alt tiplerin dendrit dinamiklerini ve arbor yeniden şekillenmesini yakalamak için bir yöntem geliştirmekti. Dendrit desenlemesinin hücre tipine özgü mekanizmalarını tanımlamak, ilgilenilen hücrelerin dendrit davranışlarını görselleştirmek ve ölçmek için yöntemler gerektirir. Fare retinalarının organotipik kültürleri, konfokal veya multifoton mikroskopi kullanan canlı hücre görüntüleme çalışmaları için çok uygundur. Gelişmekte olan retinalar diseke edilir ve bir kayıt odasında birkaç saat boyunca görüntülenebilen veya devre üzerinde sınırlı etkilerle birkaç gün boyunca kültürlenebilen düz bir eksplanta monte ^edilir6,7. Canlı retinal nöronlar, elektrotlarla boya doldurma, elektroporasyon, lipofilik boyalarla kaplanmış parçacıkların biyolistik iletimi veya floresan proteinleri kodlayan plazmidler (örneğin, Gen Tabancası) ve genetik olarak kodlanmış hücre etiketleri7,8,9,10 dahil olmak üzere çeşitli tekniklerle etiketlenebilir7,8,9,10 . Bununla birlikte, bu yaklaşımlar spesifik retinal alt tiplerin dendrit dinamiklerini görüntülemede verimsizdir. Örneğin, boya doldurma yöntemleri düşük verimlidir ve ilgilenilen hücreleri güvenilir bir şekilde hedeflemek için elektrofizyoloji aparatı ve ek genetik etiketler gerektirir. Dahası, somadaki güçlü floresan sinyalleri yakındaki dendritleri gizleyebilir.

Biyolistik gen verme yöntemleri aynı anda düzinelerce hücreyi etiketleyebilir, ancak yüksek basınçlı parçacık dağıtımını ve izole retinanın gece boyunca inkübasyonunu içeren adımlar hücre fizyolojisini ve dendritik büyümeyi tehlikeye atabilir. Bu makale, aşağıdaki deneysel kriterler göz önüne alındığında, hücre tipi ve yapısal çözünürlük ile erken dendrit dinamiklerini yakalamak için son genetik araçların kullanılabileceğini önermektedir. İlk olarak, gelişmekte olan arborslara hakim olan ince dalları ve filopodia'yı çözmek için, yöntem nöronları tüm çardaktaki süreçleri dolduran parlak, floresan proteinlerle etiketlemelidir. Görüntüleme süresi boyunca fotobeyazlatma nedeniyle floresan etiketleme solmamalıdır. Çeşitli floresan protein varyantları üretilmiş ve parlaklık ve fotostabiliteye dayalı olarak in vivo/ex vivo ^{görüntülemeye11} uygunluk açısından karşılaştırılmıştır. İkincisi, floresan proteinler (XFP'ler), dendrit morfogenezinin en erken aşaması ile yeterince yüksek seviyelerde eksprese edilmelidir, böylece dar gelişim penceresi kaçırılmaz. Fare retinasındaki statik zaman noktalarının analizlerinde, dendrit gelişimi doğum sonrası ilk haftada meydana gelir ve büyüme, yeniden modelleme ve stabilizasyon aşamalarını içerir10,12,13,14,15. Üçüncüsü, yöntem seçici etiketlemeye veya ilgilenilen nöronal alt popülasyonun etiketlenme olasılığının artmasına yol açmalıdır. Dördüncüsü, hedef alt popülasyonun etiketlenmesi yeterince seyrek olmalıdır, böylece tüm nöronal ağaç dikme tanımlanabilir ve izlenebilir. RGC ve amakrin alt tipleri olgun morfolojik özellikleri ve IPL tabakalaşma paternleri16,17,18,19,20 ile ayırt edilebilse de, zorluk^, olgunlaşmamış yapılara dayanarak gelişim sırasında alt tipleri tanımlamaktır. Bu görev, geliştirme sırasında spesifik retinal hücre tiplerini etiketlemek için transgenik araçların genişletilmesiyle kolaylaştırılmıştır.

Floresan proteinlerin veya Cre'nin hücresel ve zamansal ekspresyonunun gen düzenleyici elementler tarafından belirlendiği transgenik ve knock-in fare çizgileri, retinal hücre tiplerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır13,21,22,23. Dendrit gelişiminin alt tipe özgü kalıpları üzerine yapılan temel gözlemler, statik zaman noktalarında transgenik fare retinaları üzerine yapılan çalışmalardan ^{gelmiştir10,14,24,25}. Özellikle Cre-Lox sistemi, çeşitli rekombinaze bağımlı muhabirler, sensörler ve optogenetik aktivatörler kullanarak alt tiplerin mükemmel gen manipülasyonunu ve izlenmesini sağlar. Bu araçlar, retinal devre düzeneğinin altında yatan alt tipe özgü moleküler programların ve fonksiyonel özelliklerin keşfedilmesine yol açmıştır26,27,28,29,30. Bununla birlikte, fare retinasındaki alt tipe özgü dendrit dinamiklerini incelemek için henüz kullanılmamışlardır. Düşük yoğunluklu etiketleme, Cre fare çizgilerinin elektroporasyon veya rekombinant AAV'ler tarafından tanıtılan transgenlerle birleştirilmesiyle elde edilebilir. Varsa, tamoksifen ile indüklenebilir Cre hatları veya kesişimsel genetik stratejiler de kullanılabilir. Son olarak, hücre minimal invaziv bir şekilde etiketlenmeli ve dokudan ödün vermemek veya dendrit morfogenezi için gerekli hücresel fonksiyona müdahale etmemek için edinim parametreleri kullanılarak görüntülenmelidir.

Burada canlı fare retinal eksplantlarında dendrit dinamiklerini araştırmak için transgenik araçlar ve konfokal mikroskopi uygulamak için bir yöntem sunulmaktadır. Cre transgenik fare çizgileri, Cre rekombinasyonu üzerine floresan proteinleri eksprese eden AAV vektörleri ile birleştirilmiştir, bu da ilgilenilen retinal hücrelerin seyrek etiketlenmesine izin verir. Ticari olarak temin edilebilen AAV'ler intravitreal enjeksiyonlarla yenidoğan retinasına verilir. Bu makale, AAV'lerin 4 dpi ile önemli ölçüde yüksek ve hücre tipine özgü floresan ekspresyonu ürettiğini ve doğum sonrası zaman noktalarına erişime izin verdiğini göstermektedir. Bu yaklaşımı göstermek için, kolinerjik "starburst" amakrin internöron, yenidoğan farelerde kolin asetiltransferaz (ChAT)-internal ribozom giriş bölgesi (IRES)-Pre transgenini eksprese eden Brainbow AAV verilerek ^{etiketlendi31,32}. Starburst amakrin hücreleri, kümelenmiş protokadherinlerin aracılık ettiği dendrit kendinden kaçınma ile şekillenen stereotipli ve radyal bir ağaç dikme morfolojisi ^{geliştirir33,34}. Bu makale, yıldız patlaması dendritlerinin ve filopodia'nın çözünürlüğünün, Brainbow AAV'ler için kullanıldığı gibi, farzesilasyona uğrayan CAAX motifinin eklenmesiyle XFP'ler tarafından plazma zarına önemli ölçüde iyileştirildiğini ^{göstermektedir31}. Son olarak, dendrit rekonstrüksiyonu ve morfometrik niceleme için uygun yüksek kaliteli görüntüler üreten hızlandırılmış görüntüleme ve işlem sonrası protokoller belirlenmiştir. Bu protokol, dendrit morfogenezini kontrol eden faktörleri tanımlamak ve sağlam retinadaki çeşitli hücresel davranışları yakalamak için kullanılabilir.

NOT: Bu protokol, deney günleri arasında viral transdüksiyon için minimum 4-5 günlük bir süre ile 2 güne yayılmaktadır (Şekil 1A). Hayvan deneyleri, Kanada Hasta Çocuklar Hastanesi (Toronto, Kanada) Hayvan Hizmetleri Laboratuvarı Hayvan Kullanımı ve Bakım Komitesi tarafından onaylanan protokoller kapsamında Araştırma ve Laboratuvar Hayvan Bakımında Hayvanların Kullanımı için Hayvan Bakım Kılavuzları Konseyi'ne uygun olarak gerçekleştirilir.

1. Yenidoğan AAV enjeksiyonları ve görüntüleme deneyleri için hazırlıklar

1. İlgilenilen retinal hücre popülasyonlarını etiketlemek için bir Cre fare çizgisi seçin. AAV enjeksiyonları sırasında Cre rekombinaz ekspresyonunu bir Cre transgenik muhabirine geçerek veya bir Cre antikoru ile immün boyama yoluyla onaylayın.
2. Cre-pozitif yenidoğan hayvanları üretmek için transgenik Cre farelerini (8-16 haftalık) yetiştirin.
   NOT: Bu gösteri için, kolinerjik Starburst amakrin hücrelerini hedeflemek için ChAT-IRES-Cre knock-in fareleri kullanılmıştır.
3. Rekombinaz-bağımlı AAV virüsü kodlayan floresan protein(ler)i elde edin. İnce proseslerin optimum şekilde etiketlenmesi için, plazma membranını hedefleyen modifiye XFP'leri ifade eden vektörleri seçin.
   NOT: Bu çalışmada, çok renkli etiketleme seçeneği sunan Brainbow virüsü (BBV), AAV-EF1a-BbTagBY ve AAV9-EF1a-BbChT (bkz. Malzeme Tablosu) kullanılmıştır (Şekil 1B). Farnesile geliştirilmiş sarı floresan protein (eYFP) ve monomerik Kiraz (mCherry) ekspresyonu, canlı görüntüleme için en güçlü floresan sinyallerini üretti. Tek bir BBV, tek tek arborları görüntülemek için kullanılabilirken, BBV'lerin birlikte enjeksiyonu, daha fazla hücreyi veya komşu arborsları farklı floroforlarla etiketlemek için kullanılabilir. Birden fazla floresan proteini kullanılıyorsa, minimum emisyon spektrumu çakışmasını sağlayın (Şekil 1C). Mikroskop toplama parametreleri, farklı XFP sinyallerini yakalamak için ayarlanmalıdır.
4. Donma/çözülme döngülerini önlemek için tek kullanımlık stoklar için ayrı ayrı düşük bağlayıcı tüplerde ∼3-5 μL AAV alikotları hazırlayın. -80 °C'de saklayın.
5. Bir mikropipet çektirici kullanarak çok ince uçlu borosilikat cam mikropipetler hazırlayın.
   NOT: Çektirme ayarları, kullanılan filament ve çektirmeye bağlı olarak değişir; Son uç boyutu ve şekli için Şekil 2A'ya bakınız. Tipik damlacık çapları 600 μm'dir.
6. Bir mikroenjeksiyon sistemi ve ilgili boruları edinin. Mikroenjektörü basınçlı bir hava portuna bağlayın.

Şekil 1: Deneysel genel bakış . (A) Bu protokol, deney günleri arasında en az 4-5 günlük enfeksiyon süresi olan 2 günlük deneyleri kapsar. Göz içi enjeksiyonları, doğum sonrası 3. günden daha eski olmayan yenidoğan farelerde gerçekleştirilir. Retinalar daha sonra istenen gelişimsel pencereyi yakalamak için disseke edilir, düz monte edilir ve canlı olarak görüntülenir. Etiketli hücreler, viral ekspresyon için gerekli 4-5 gün sonra herhangi bir zamanda görüntülenebilir, çünkü uzun süreli AAV ekspresyonunun dendrit morfolojisi üzerinde belirgin bir etkisi yoktur. (B) Cre-dependent Brainbow AAV vektörleri (BBV), ^Cre31'i ifade eden hayvanlara enjekte edilir. Bu çalışmada, yıldız patlaması amakrin hücrelerinde Cre rekombinasyonunu sürmek için ChAT-Cre knock-in fareleri kullanılmıştır. İki BBV, membran lokalizasyonu için sıralı olarak farnesilleştirilen bir CAAX motifinde sona eren değiştirilmiş eYFP veya tagBFP veya mCherry ve mTFP'yi kodlar. Lox siteleri üçgenlerle tasvir edilmiştir. Vektörler, farzesillenmiş XFP'leri Cre rekombinasyonuna bağlı olarak stokastik ve kombinatoryal bir şekilde eksprese eder. EF1α promotörü, uzama faktörü 1α geninden düzenleyici elementler içerir. W, woodchuck hepatit virüsü posttranskripsiyonel düzenleyici elementinden elementleri temsil eder ve pA, poliadenilasyon dizisini gösterir. (C) Bu çalışmada görüntülenen BBV floroforları olan mCherry ve eYFP'nin uyarılması ve emisyon spektrumları. Çoklu floresan proteinleri canlı görüntülerken, algılama parametreleri emisyon spektrumlarını farklı kanallara yeterince ayıracak şekilde düzenlenmelidir. Kısaltmalar: AAV = adeno ilişkili virüs; BBV = Brainbow AAV; ChAT = kolin asetiltransferaz; iRES = dahili ribozom giriş sitesi; eYFP = gelişmiş sarı floresan proteini; iTR = ters çevrilmiş terminal tekrarı; tagBP = Tag-blue floresan proteini; mCherry = monomerik Kiraz; mTFP = deniz mavisi floresan proteini; XFP = herhangi bir floresan protein; EF1α= uzama faktörü 1 alfa. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Yenidoğan farelerde AAV'lerin intravitreal enjeksiyonları

1. Buz üzerinde bir AAV aliquot çözün. Steril salin veya fosfat tamponlu salin kullanarak ~ 1: 4 AAV seyreltme hazırlayın. Mikropipetin kırılması ve yeni bir pipetin doldurulması gerekmesi durumunda hayvan başına ~0,5 μL AAV seyreltme (göz başına ~0,25 μL) hazırlayın. Kalan seyreltilmemiş AAV'yi 4 ° C'de saklayın ve 2 hafta içinde kullanın.
   NOT: Bu deneyde, tedarikçi AAV konsantrasyonu ~ 1-2 × ¹⁰¹³ genom içeriği (GC) / mL idi ve 4 × ¹⁰¹² GC / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltildi. İstenilen etiketleme yoğunluğunu elde etmek için viral konsantrasyonu optimize edin.
2. Enjeksiyonları görselleştirmek için, çözeltiyi maviye boyamak üzere her 15 μL AAV seyreltme için yaklaşık 1 μL% 0.02 Hızlı Yeşil FCF boya çözeltisi ekleyin.
3. Barajlı ve yenidoğan çöplü bir fare kafesini (doğum sonrası gün (P) 0.5-3) mikroenjeksiyon ekipmanı olan bir prosedür odasına aktarın. Anne stresini ve yavruların reddedilmesini en aza indirmek için hayvanları yuvalar ve yataklarla aynı kafeste tutun.
4. Enjeksiyon alanını% 70 etanol ile sterilize edin ve steril bebek bezi pedlerini tezgah yüzeylerine yerleştirin. Hipotermiye bağlı anesteziden kurtulmak için sıcak bir platform (örneğin, bir ısıtma yastığı) hazırlayın.
5. Mikropipeti bir mikroşırınga kullanarak AAV seyreltme ile doldurun. Bir stereomikroskop altında, ucun mührünü açmak için mikropipet ucunu 30 G'lik bir iğneyle kırın.
   NOT: Şekil 2A , hem kapalı (üstte) hem de mühürsüz (ortada) arkadan doldurulmuş ucu göstermektedir.
6. Yenidoğan farelerini buz üzerine 1-2 hayvan yerleştirerek hipotermi ile anestezi altına alın. Cildi buzla doğrudan temastan korumak için hayvanları lateks eldiven üzerine yerleştirin. Hayvan artık pençe sıkışmasına (~ 2 dakika) yanıt olarak hareket etmediğinde, hayvanı bir stereomikroskop altına yerleştirin. İstenirse, dövme mürekkebi ve 30 G iğneli dövme pençesi pedleri ve DNA izolasyonu için kuyruk kırpıntıları toplayarak hayvanları genotipleme ile tanımlayın.
   NOT: Anestezi derinliğinin uygun şekilde izlenmesi prosedür boyunca yapılmalıdır.
7. Gözlerin üzerindeki cildi% 70 etanol ile silin. Kaynaşmış göz kapağını açmak için 30 G'lık bir iğne kullanın (Şekil 2B). Gözü açmak için parmaklarınızla hafif basınç uygulayın ve kornea-sklera kavşağında korneadan küçük bir delik açın (Şekil 2C).
8. Cam mikropipeti deliğe yerleştirin ve AAV'yi intravitreal boşluğa enjekte etmek için mikroenjektör ayak pedalına 2-4 kez basın. Mikropipeti yavaşça çıkarın ve mavi boyayı göz bebeğinden görselleştirerek AAV enjeksiyonunu onaylayın (Şekil 2D).
   NOT: 6-8 psi ejeksiyon basıncı ve 600-800 ms darbe süresi ile 600 μm çapında bir damlacık dışarı atılır (Şekil 2A, alt). Göz başına yaklaşık 0.23-0.45 μL AAV çözeltisi enjekte edilir. Gözün dışındaki mavi çözelti, AAV'nin göze enjekte edilmediğini gösterir. Enjeksiyon bölgesinden sızan mavi çözelti, AAV'nin dışarı sızmış olabileceğini ve transfeksiyon verimliliğini azalttığını gösterir.
9. Yeniden kapatmak için göz kapaklarını yavaşça birbirine bastırın ve yavruyu ısıtılmış bir pedin üzerine yerleştirin. Hayvanlar pembemsi bir renge kavuştuktan ve duyarlı olduktan sonra, yavaşça onları muhafaza kafesine geri aktarın.
   NOT: Yavruların çok hızlı bir şekilde yeniden ısınmasını önlemek için uygun önlemlerin alındığından emin olun.
10. Çöpte kalan hayvanlar için enjeksiyon prosedürünü tekrarlayın. Retinayı görüntülemeden önce viral transdüksiyon için en az 4-5 gün bekleyin.

Şekil 2: Yenidoğan göz içi enjeksiyonları . (A) Geri doldurulmuş mikropipet, pipet ucunun kapatıldığında (üstte) ve uç açıldıktan sonra (altta, solda) şeklini gösterir. 6-8 psi'lik piko enjeksiyon basıncı ve 600-800 ms'lik darbe süresi, 600 μm çapında bir damlacık üretir (alt, sağ). Ölçek çubuğu = 1 mm.(B) 16x büyütme altında anestezi uygulanmış P0 yavrusu. Kaynaşmış göz kapağı bağlantısı (beyaz), keskin bir 30 G iğne kullanılarak yarık açılır. Ölçek çubuğu = 2 mm. (C) Göze uygulanan hafif basınç korneayı açığa çıkarır; ölçek çubuğu = 2 mm. Yakınlaştırılmış bölüm (kırmızı), 30 G'lik bir iğne ile oluşturulan kornea-sklera kavşağındaki (sarı) küçük deliği gösterir; ölçek çubuğu = 0,5 mm. (D) Enjeksiyondan sonra pipet ucunun çekilmesi (solda). AAV çözeltisindeki Hızlı Yeşil boya, enjeksiyondan önceki açık göz bebeği rengine kıyasla (sağda) göz bebeği boyunca mavi-gri olarak görünür (ortada). Ölçek çubuğu = 1 mm. (E) 4 gün sonra, göz kapağı iyileşti ve kaynaşarak kapandı (solda); ölçek çubuğu = 2 mm. Enükleasyon üzerine, iyileşmiş enjeksiyon bölgesi görülebilir (sarı); ölçek çubuğu = 1 mm. Enjeksiyon bölgesinin kornea ve sklera arasındaki sınırdaki konumuna dikkat edin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Görüntüleme deneyi için retina diseksiyonları

1. Retinal aCSF (119 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.3 mM MgCl2·6H2O, 2.5 mM _CaCl2·2H2O, 1 mM NaH2PO4, 11 mM glikoz ve 20 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit (HEPES serbest asit)³⁵ hazırlayın. İstenirse, 10x çözeltisini hazırlayın ve dondurun; çözülür ve gerektiğinde 1x'e kadar seyreltilir.
2. 
   

Yukarıdaki protokolü kullanarak, yıldız patlaması hücresi dendritlerinin geliştirilmesinin yüksek çözünürlüklü bir 3D videosu elde edildi, deconvolved edildi ve 3D sürüklenme için düzeltildi. Analiz için 2D videolar yapmak üzere Z-düzlemi maksimum projeksiyonları üretildi (Ek Video 1, Şekil 5A). Her zaman noktasının 3D dekonvolüsyonu, ince filopodia projeksiyonlarının çözünürlüğünü arttırmıştır (Şekil 5B, C). İnce filopodia çıkıntıları, retinal dendritlerin36 gelişmesinin bir özelliğidir ve görüntüleme sırasında görülebilmelidir. AAV transfeksiyonu, hücre etiketleme yoğunluğunda ve floresan yoğunluğunda değişkenlik üretecektir. Böylece, görüntüleme ve yüksek kaliteli videolar üretmek için yüksek floresan sinyallere sahip hücreleri seçmek üzere etiketli dokuyu tarayın. Loş etiketli hücreleri tespit etmek için lazer gücünün arttırılması önerilmez, çünkü hızlı fotobeyazlatmaya yol açabilir ve sinyale kıyasla yüksek gürültü getirebilir. Yeterince parlak hücreler 5 dpi içinde görülebilir. 12 dpi ve sonrasında, uzun süreli AAV enfeksiyon dönemleri mutlaka etiketli hücrelerin floresansının artmasına yol açmaz (Şekil 5D).

Yoğun hücre etiketlemesinden kaynaklanan aşırı floresan ve nörit kalabalığı, görüntü kalitesini etkiler ve tek hücreli rekonstrüksiyonları engelleyebilir. AAV seyreltme ve hacminin optimizasyonu, hedef hücre popülasyonunun geri kalanından ayrılabilen izole edilmiş ve floresan olarak etiketlenmiş arborların istenen derecesini elde etmek için gereklidir. Burada, yıldız patlaması amakrin hücrelerini hedeflemek için göz başına 9.2 × 108-1.8 × 109 viral GC enjekte edildi (4 × 1012 GC / mL titre ile 0.23-0.45 μL AAV). Bir floresan sinyalinin olmaması, verimsiz bir enjeksiyon tekniğini yansıtabilir. Enjekte ederken, mavi AAV çözeltisinin enjeksiyon bölgesinden sızması, virüsün retinaya verilmediğini veya enjeksiyon hacminin veya basıncının çok yüksek olduğunu gösterir. Aşırı enjeksiyon hacmi veya basıncı retina dekolmanı ve/veya oküler basınç kaybına neden olabilir, retina hücrelerine zarar verebilir ve hücre etiketleme verimliliğini azaltabilir. Her iki sorun da enjeksiyon tekniğinin uygulanması ve optimizasyonu ile çözülebilir. Sinyal eksikliğinin diğer potansiyel nedenleri, AAV'lerin yanlış depolamadan veya yetersiz Cre ekspresyonundan bozulmasıdır, çünkü Cre transgeni AAV transfeksiyonu döneminde aktif değildir.

Videolar çözüldükten sonra, dal ekleme, geri çekme veya stabilizasyon oranlarının hesaplanması gibi dinamik analizler gerçekleştirilebilir. Ek olarak, nöron rekonstrüksiyonu ve toplam dal uzunluğu, dal açıları, dal sırası veya terminal dal noktalarının sayısı gibi morfometrik nicelemeler dahil olmak üzere her zaman diliminde geleneksel statik analiz yapılabilir. Bu protokolün sonucu, yüksek çözünürlüklü 3D görüntü yığınlarının bir zaman serisidir. Çoğu 3D nörit dinamik video, ImageJ37 gibi açık kaynaklı bir görüntü görselleştirme yazılımı kullanılarak maksimum projeksiyon olarak manuel olarak ölçülür. Başka bir açık kaynaklı araç olan Vaa3D38, özellikle büyük hacimlerin görselleştirilmesi için geliştirilmiştir. Videolar 3D olarak analiz edilecekse, Vaa3D gibi bir 3D + zaman görselleştirici kullanılması önerilir. ImageJ ve Vaa3D, görüntüdeki piksellere veya voksellere doğrudan erişime izin verir, ancak genellikle piksel verilerini iskeletleştirilmiş ağaç rekonstrüksiyonlarına dönüştürerek nöron rekonstrüksiyonları oluşturulur. Tek zaman noktaları için otomatik veya yarı otomatik nöron rekonstrüksiyonları açık kaynaklı39,40,41 ve tescilli yazılımlarla gerçekleştirilebilir. Hızlandırılmış rekonstrüksiyonları analiz etmek için, rekonstrüksiyondaki her nokta önceki ve sonraki zaman noktalarına bağlanmalıdır. 500'den fazla veri noktası tarafından kodlanabilen karmaşık dendritik morfolojileri zaman içinde hizalamak zorlu bir sorun olmaya devam etmektedir. Farklı güçlü yönleri ve sınırlamaları olan birçok araç mevcuttur ve çalışma için gereken analizlere uyacak şekilde seçilmeleri gerekir.

Şekil 5: Yenidoğan göz içi enjeksiyonu, hızlandırılmış görüntüleme ve dekonvolüsyon sonrası temsili sonuçlar. (A) AAV enjeksiyonundan 5 gün sonra P6 starburst amakrin hücresinin deconvolved time-lapse görüntüleme serisinin (h:min) maksimum projeksiyonları. İnce filopodia dinamikleri artık geleneksel ImageJ araçları kullanılarak analiz edilebilir. Bir dendritik arıtma alanı (kırmızı kutu) ve bir dendritik büyüme alanı (yeşil kutu) vurgulanır. (B, C) AAV enjeksiyonundan 5 gün sonra membran etiketli eYFP (dpi) ile etiketlenmiş tek P6 yıldız patlaması amakrin hücresi, parlak tek hücreli etiketleme gösterir. Üst paneller için ölçek çubukları = 50 μm; alt paneller için ölçek çubukları = 25 μm. ImageJ ile (A) ve sonra (B) dekonvolüsyonu. Kümeler (kırmızı), başarılı dekonvolüsyonun bir sonucu olarak bulanıklaştırmayı gösterir. (D) P6 starburst amakrin hücresi 5dpi (solda), P12 starburst hücresi 11 dpi ile karşılaştırıldığında, benzer seviyelerde floresan protein ekspresyonu gösterir. AAV inkübasyon sürelerinin arttırılması floresan sinyalini arttırmaz. Floresan sinyaller daha uzun AAV enfeksiyon süreleri ile azalmaz. Her iki görüntüye de aynı edinme ve son işleme parametreleri uygulandı. P12'de gözlenen artan dal kalınlığı ve varisler, olgunlaşan yıldız patlaması hücrelerinin normal özellikleridir ve bir etiketleme veya görüntüleme eseri değildir. Ölçek çubukları = 10 μm. Kısaltmalar: AAV = adeno ilişkili virüs; eYFP = gelişmiş sarı floresan proteini; dpi = enfeksiyondan sonraki günler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Cre hattı seçimi ve floresan protein lokalizasyonu için dikkat edilmesi gerekenler.

(A-D) BBV'nin 9 dpi'sinde görüntülenen canlı P11 retinal ganglion hücreleri, Cre'nin RGC popülasyonunda seçici olarak eksprese edildiği Vglut2-iRES-Cre knock-in farelere enjekte edildi. (A) Karakteristik asimetrik morfolojisi ile tanımlanan JAM-B RGC24. (B-D) Dendrit tabakalaşma modellerinde farklılık gösteren farklı RGC alt tipleri. (E) Canlı P11 yıldız patlaması amakrin hücresinin biyostatik olarak sitozolik mCherry ile transfekte edilmiş ve 512 x 512 pikselde dönen disk konfokal ile yakalanmış görüntüsü. Sitozolik XFP, ince dendritik çıkıntılara göre somada yüksek floresan sinyaline yol açar. Soma'dan gelen odak dışı ışık, küçük proksimal projeksiyonları görüntülerken yüksek arka plan floresansına neden olur (yukarıdaki kırmızı kutuda yer alan kısım aşağıda gösterilmiştir). (F) Membran hedefli eYFP ile transfekte edilen ve 1024 x 1024 pikselde konfokal lazer tarama ile yakalanan canlı P11 yıldız patlaması amakrin hücresinin görüntüsü. Soma etrafındaki floresan membran halkasına, geliştirilmiş sinyal-gürültü oranına ve membran hedefli floresan proteinleri (inset) tarafından üretilen soma'ya yakın ince projeksiyonların kalitesine dikkat edin. Ölçek çubukları = 50 μm ve E ve F = 5 μm'lik alt paneller için. Kısaltmalar: IRES = iç ribozom giriş sitesi; BBV = Brainbow adeno ile ilişkili virüs; Vglut2 = veziküler glutamat taşıyıcı 2; XFP = herhangi bir floresan protein; eYFP = gelişmiş sarı floresan proteini; mCherry = monomerik Kiraz; RGC = retinal ganglion hücreleri; JAM-B = bağlantı adezyon molekülü B. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 1: P6'nın yıldız patlaması amakrin dendritleri geliştirdiği hızlandırılmış video, enjeksiyondan 5 gün sonra. Video zaman adımı 2 dakikadır. Dekonvolüsyon ve 3D sapma düzeltmesi ImageJ kullanılarak uygulandı. Üst sarı kutular büyüme alanlarını vurgular ve alt kutu geçici filopodia büyümesi, kendi kendine temas ve geri çekilme bölgesini özetler. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 1: Toplu Paralel Yinelemeli Dekonvolüsyon için ImageJ makrosu. Makro, Wiener Filtresi Önceden Koşullandırılmış Landweber (WPL) yinelemeli algoritmasının 25 yinelemesini çalıştırır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.