Genetik Olarak Hedeflenmiş Retinal Hücre Popülasyonlarının Seyrek Adeno İlişkili Virüs Etiketlemesi Kullanılarak Nöronal Arborizasyonun Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Summary

Burada, postnatal fare retinal eksplantlarında nörit morfogenezini hızlandırılmış konfokal mikroskopi ile araştırmak için bir yöntem sunuyoruz. Membran hedefli floresan proteinlerini Cre'e bağımlı bir şekilde eksprese eden rekombinant adeno ilişkili virüs vektörlerini kullanarak retina hücre tiplerinin ve ince süreçlerinin seyrek etiketlenmesi ve edinilmesi için bir yaklaşım tanımladık.

Abstract

Dendritik arborsları modelleyen mekanizmaları keşfetmek, gelişim sırasında dendritleri görselleştirmek, görüntülemek ve analiz etmek için yöntemler gerektirir. Fare retinası, nöronal morfogenez ve bağlantının hücre tipine özgü mekanizmalarının araştırılması için güçlü bir model sistemidir. Retinal alt tiplerin organizasyonu ve bileşimi iyi tanımlanmıştır ve gelişim sırasında belirli tiplere erişmek için genetik araçlar mevcuttur. Birçok retinal hücre tipi ayrıca dendritlerini ve / veya aksonlarını dar tabakalarla sınırlar, bu da hızlandırılmış görüntülemeyi kolaylaştırır. Fare retina eksplant kültürleri, konfokal veya multifoton mikroskopisi kullanarak canlı hücre görüntüleme için çok uygundur, ancak dendrit dinamiklerini zamansal ve yapısal çözünürlükle görüntülemek için optimize edilmiş yöntemler eksiktir. Burada Cre-Lox sistemi tarafından işaretlenmiş spesifik retinal popülasyonların gelişimini seyrek olarak etiketlemek ve görüntülemek için bir yöntem sunulmaktadır. Burada kullanılan ticari olarak temin edilebilen adeno ilişkili virüsler (AAV'ler), membran hedefli floresan proteinlerini Cre'ye bağımlı bir şekilde ifade etti. Yenidoğan farelerde AAV'lerin göz içi doğumu, enjeksiyondan 4-5 gün sonra (dpi) hedeflenen hücre tiplerinin floresan etiketlemesini sağlar. Membran floresan sinyalleri konfokal görüntüleme ile algılanabilir ve ince dal yapılarını ve dinamiklerini çözer. 2-4 saate yayılan yüksek kaliteli videolar, oksijenli yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) ile perfüze edilmiş görüntüleme retinal düz montajlarından elde edilir. Ayrıca, dekonvolüsyon ve üç boyutlu (3B) sapma düzeltmesi için bir görüntü son işleme ardışık düzenidir. Bu protokol, sağlam retinadaki çeşitli hücresel davranışları yakalamak ve nörit morfogenezini kontrol eden yeni faktörleri tanımlamak için kullanılabilir. Retinada öğrenilen birçok gelişimsel strateji, merkezi sinir sisteminin başka yerlerinde nöral devrelerin oluşumunu anlamak için geçerli olacaktır.

Introduction

Retinal nöronların dendritleri, nöral devreler içindeki işlevlerini etkileyen karmaşık, ancak spesifik kalıplar oluşturur. Omurgalı retinasında, çeşitli tipte retinal ganglion hücreleri (RGC'ler) ve amakrin hücre internöronları, ağaç dikme boyutu, yeri, dal uzunluğu ve yoğunluğu bakımından farklılık gösteren benzersiz dendritik morfolojiler ^taşır1. Postnatal gelişim sırasında, RGC'ler ve amakrin hücreler, coşkulu dendritik süreçleri, fotoreseptör sinyallerini ileten bipolar hücre girdilerini aldıkları iç pleksiform tabaka (IPL) adı verilen bir nöropil içine ^{genişletirler2}. Civciv veya zebra balığı larvalarında floresan o....

Protocol

NOT: Bu protokol, deney günleri arasında viral transdüksiyon için minimum 4-5 günlük bir süre ile 2 güne yayılmaktadır (Şekil 1A). Hayvan deneyleri, Kanada Hasta Çocuklar Hastanesi (Toronto, Kanada) Hayvan Hizmetleri Laboratuvarı Hayvan Kullanımı ve Bakım Komitesi tarafından onaylanan protokoller kapsamında Araştırma ve Laboratuvar Hayvan Bakımında Hayvanların Kullanımı için Hayvan Bakım Kılavuzları Konseyi'ne uygun olarak gerçekleştirilir.

1. Yenidoğan AAV enjeksiyonları ve görüntüleme deneyleri için hazırlıklar

1. İlgilenilen retinal hücre popülasyonlarını etiketlemek için bir Cre fare çizgisi seçin. A....

Results

Yukarıdaki protokolü kullanarak, yıldız patlaması hücresi dendritlerinin geliştirilmesinin yüksek çözünürlüklü bir 3D videosu elde edildi, deconvolved edildi ve 3D sürüklenme için düzeltildi. Analiz için 2D videolar yapmak üzere Z-düzlemi maksimum projeksiyonları üretildi (Ek Video 1, Şekil 5A). Her zaman noktasının 3D dekonvolüsyonu, ince filopodia projeksiyonlarının çözünürlüğünü arttırmıştır (Şekil 5B, C). İnce filopodia çıkı.......

Discussion

Bu video, gelişmekte olan retinal nöronların dendrit dinamiklerini konfokal canlı görüntüleme ile görüntülemek için mevcut genetik araçları kullanan deneysel bir boru hattını göstermektedir. Ayrıca, membran hedefli floresan proteinlerini yenidoğan farelere kodlayan Cre-bağımlı AAV'lerin göz içi enjeksiyonları da gösterilmiştir. Genetik olarak hedeflenmiş popülasyonların tek hücreleri, 4-5 dpi kadar erken bir sürede parlak bir şekilde etiketlenir. Standart görüntüleme odalarının canlı hücre konfokal görüntülemesini gerçek.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Addgene viral hazırlık # 45185-AAV9
Addgene viral hazırlık # 45186-AAV9
< güçlü >Diseksiyon araçları < / strong>
selüloz filtre kağıdı	Whatman	1001-070
Dumont #5 ince forseps	FST	11252-20	Retinal mikro diseksiyon için iki Dumont # 5 forseps gereklidir
Dumont forseps	VWR	82027-426
İnce Makas	FST	14058-09
Karışık selüloz ester membran (MCE) filtre kağıtları, hidrofilik, 0.45 ve mikro; m gözenek boyutu	Millipore	HABG01 300
Petri Kabı, 50 > 15 mm	VWR	470313-352
Polietilen tek kullanımlık transfer pipeti	VWR	470225-034
Yuvarlak uçlu boya fırçası, boyut 3/0	Geleneksel sanat malzemeleri mağazası		Retinal düz montaj için iki boy 3/0 boya fırçası (veya daha küçük) gereklidir
Cerrahi Makas	FST	14007-14
Vannas Yaylı Makas - 2,5 mm Kesici Kenar	FST	15000-08
Canlı görüntüleme inkübasyon sistemi
hazneli polietilen boru, PE-160 10'Warner	Instruments	64-0755
Çift kanallı ısıtıcı kontrol cihazı, Model TC-344C	Warner Instruments	64-2401
HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR daldırma objektifi	Leica	15506374
Isıtıcı kontrol kablosu	Warner Instruments	CC-28
Dilim destekli büyük banyo inkübasyon odası	Warner Instruments	RC-27L
MPII Mini-Peristaltik Pompa	Harvard Aparatı	70-2027
PM-6D Manyetik Isıtmalı Platform (inkübasyon odası ısıtıcısı)	Warner Instruments	PM-6D
MPII Mini-Peristaltik Pompa Harvard Aparatı için Pompa Kafası Boru Parçaları		55-4148
Numune ankrajı (Harps)	Warner Instruments	64-0260	Numune ankrajı inkübasyon odası ile uyumlu olmalıdır
Sloflo Sıralı Çözelti Isıtıcı	Warner Instruments	SF-28
Yenidoğan Enjeksiyonları
10 ve mikro; L Mikrolitre Şırınga Serisi 700, Çıkarılabilir İğne	Hamilton Company	80314
30 G Hipodermik İğneler (0,5 inç)	BD PrecisionGlide	305106
4 inç ince duvarlı cam kılcal, filament yok (1,0 mm dış çap / 0,75 mm)	WPI World Precision Instruments	TW100-4
Etanol %99,8 (çift damıtılmış su ile %70'e seyreltmek için [ddH2O])	Sigma-Aldrich	V001229
AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF	Penn Vektör Çekirdeği	AV-9-PV2453	Addgene Plazmid #45185
AAV9.hEF1a.lox.mKiraz.lox.mTFP 1.lox. WPRE.hGH-InvCheTF	Penn Vektör Çekirdeği	AV-9-PV2454	Addgene Plazmid # 45186
ChAT-IRES-Cre knock-in transgenik fare hattı	Jackson Laboratuvarı	6410
Hızlı Yeşil FCF Boya içeriği &; %85	Sigma-Aldrich	F7252-25G
Alevli/Kahverengi Mikropipet Çektirme, model P-97	Sutter Instrument Co.	P-97
Yeşil dövme macunu	Ketchum MFG Co	329A
Fosfat Tamponlu Salin, pH 7.4, sıvı, steril filtreli, hücre kültürüne uygun	Sigma-Aldrich	806552
Pnömatik PicoPump	WPI World Hassas Aletler	PV-820
Oksijenli artifiyal beyin omurilik sıvısı (aCSF) Reaktifler
Kalsiyum klorür dihidrat (CaCl2· 2H2O)	Sigma-Aldrich	C7902
Karbojen (%5 CO2, %95 O2)	AirGas	X02OX95C2003102	Tedarikçi, bölgeye göre değişebilir
D- (+) - Glikoz	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES, Serbest Asit Bio	Basic	HB0264
Hidroklorik asit çözeltisi, 1 N	Sigma-Aldrich	H9892
Magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl2· 6H < alt > 2 < / alt > O)	Sigma-Aldrich	M2670
pH-Test şeritleri (6.0-7.7)	VWR	BDH35317.604
Potasyum klorür (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Sodyum klorür (NaCl)	Bio Basic	DB0483
Sodyum fosfat monobazik (NaH2< / sub>PO4< / sub>)	Sigma-Aldrich	RDD007
Software
ImageJ	Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH)	Açık kaynak