Method Article

Genetik Olarak Hedeflenmiş Retinal Hücre Popülasyonlarının Seyrek Adeno İlişkili Virüs Etiketlemesi Kullanılarak Nöronal Arborizasyonun Hızlandırılmış Görüntülenmesi

DOI:

10.3791/62308

⸱

March 19th, 2021

 , 
1Program for Neuroscience and Mental Health, Hospital for Sick Children, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, postnatal fare retinal eksplantlarında nörit morfogenezini hızlandırılmış konfokal mikroskopi ile araştırmak için bir yöntem sunuyoruz. Membran hedefli floresan proteinlerini Cre'e bağımlı bir şekilde eksprese eden rekombinant adeno ilişkili virüs vektörlerini kullanarak retina hücre tiplerinin ve ince süreçlerinin seyrek etiketlenmesi ve edinilmesi için bir yaklaşım tanımladık.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendritik arborsları modelleyen mekanizmaları keşfetmek, gelişim sırasında dendritleri görselleştirmek, görüntülemek ve analiz etmek için yöntemler gerektirir. Fare retinası, nöronal morfogenez ve bağlantının hücre tipine özgü mekanizmalarının araştırılması için güçlü bir model sistemidir. Retinal alt tiplerin organizasyonu ve bileşimi iyi tanımlanmıştır ve gelişim sırasında belirli tiplere erişmek için genetik araçlar mevcuttur. Birçok retinal hücre tipi ayrıca dendritlerini ve / veya aksonlarını dar tabakalarla sınırlar, bu da hızlandırılmış görüntülemeyi kolaylaştırır. Fare retina eksplant kültürleri, konfokal veya multifoton mikroskopisi kullanarak canlı hücre görüntüleme için çok uygundur, ancak dendrit dinamiklerini zamansal ve yapısal çözünürlükle görüntülemek için optimize edilmiş yöntemler eksiktir. Burada Cre-Lox sistemi tarafından işaretlenmiş spesifik retinal popülasyonların gelişimini seyrek olarak etiketlemek ve görüntülemek için bir yöntem sunulmaktadır. Burada kullanılan ticari olarak temin edilebilen adeno ilişkili virüsler (AAV'ler), membran hedefli floresan proteinlerini Cre'ye bağımlı bir şekilde ifade etti. Yenidoğan farelerde AAV'lerin göz içi doğumu, enjeksiyondan 4-5 gün sonra (dpi) hedeflenen hücre tiplerinin floresan etiketlemesini sağlar. Membran floresan sinyalleri konfokal görüntüleme ile algılanabilir ve ince dal yapılarını ve dinamiklerini çözer. 2-4 saate yayılan yüksek kaliteli videolar, oksijenli yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) ile perfüze edilmiş görüntüleme retinal düz montajlarından elde edilir. Ayrıca, dekonvolüsyon ve üç boyutlu (3B) sapma düzeltmesi için bir görüntü son işleme ardışık düzenidir. Bu protokol, sağlam retinadaki çeşitli hücresel davranışları yakalamak ve nörit morfogenezini kontrol eden yeni faktörleri tanımlamak için kullanılabilir. Retinada öğrenilen birçok gelişimsel strateji, merkezi sinir sisteminin başka yerlerinde nöral devrelerin oluşumunu anlamak için geçerli olacaktır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinal nöronların dendritleri, nöral devreler içindeki işlevlerini etkileyen karmaşık, ancak spesifik kalıplar oluşturur. Omurgalı retinasında, çeşitli tipte retinal ganglion hücreleri (RGC'ler) ve amakrin hücre internöronları, ağaç dikme boyutu, yeri, dal uzunluğu ve yoğunluğu bakımından farklılık gösteren benzersiz dendritik morfolojiler taşır1. Postnatal gelişim sırasında, RGC'ler ve amakrin hücreler, coşkulu dendritik süreçleri, fotoreseptör sinyallerini ileten bipolar hücre girdilerini aldıkları iç pleksiform tabaka (IPL) adı verilen bir nöropil içine genişletirler2. Civciv veya zebra balığı larvalarında floresan olarak etiketlenmiş retinal popülasyonların hızlandırılmış görüntülenmesiyle yakalandığı gibi, dendrit morfogenezi oldukça dinamiktir3,4,5. Birkaç gün içinde, dendritik arborslar IPL'nin dar alt katmanlarına genişler, yeniden şekillenir ve yükselir, burada seçkin ortaklarla sinaps yaparlar. Arbors, gelişim üzerinde farklı yapısal dinamikler sergiler ve göreceli dal ilavesi, geri çekme ve stabilizasyon oranlarındaki değişikliklerle birlikte. Amakrin ve RGC dendritleri ayrıca tipe özgü ağaçlandırmayı yansıtabilecek farklı büyüme ve yeniden şekillendirme davranışları sergiler. Bununla birlikte, bu çalışmalar geniş amakrin veya RGC popülasyonlarını izlemiş ve morfolojinin sadece bir yönü olan laminer hedeflemeye odaklanmıştır.

Retinal alt tiplerde gözlenen geniş morfolojik çeşitliliği üreten mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu grubun amacı, farelerde tanımlanmış retinal alt tiplerin dendrit dinamiklerini ve arbor yeniden şekillenmesini yakalamak için bir yöntem geliştirmekti. Dendrit desenlemesinin hücre tipine özgü mekanizmalarını tanımlamak, ilgilenilen hücrelerin dendrit davranışlarını görselleştirmek ve ölçmek için yöntemler gerektirir. Fare retinalarının organotipik kültürleri, konfokal veya multifoton mikroskopi kullanan canlı hücre görüntüleme çalışmaları için çok uygundur. Gelişmekte olan retinalar diseke edilir ve bir kayıt odasında birkaç saat boyunca görüntülenebilen veya devre üzerinde sınırlı etkilerle birkaç gün boyunca kültürlenebilen düz bir eksplanta monte edilir6,7. Canlı retinal nöronlar, elektrotlarla boya doldurma, elektroporasyon, lipofilik boyalarla kaplanmış parçacıkların biyolistik iletimi veya floresan proteinleri kodlayan plazmidler (örneğin, Gen Tabancası) ve genetik olarak kodlanmış hücre etiketleri7,8,9,10 dahil olmak üzere çeşitli tekniklerle etiketlenebilir7,8,9,10 . Bununla birlikte, bu yaklaşımlar spesifik retinal alt tiplerin dendrit dinamiklerini görüntülemede verimsizdir. Örneğin, boya doldurma yöntemleri düşük verimlidir ve ilgilenilen hücreleri güvenilir bir şekilde hedeflemek için elektrofizyoloji aparatı ve ek genetik etiketler gerektirir. Dahası, somadaki güçlü floresan sinyalleri yakındaki dendritleri gizleyebilir.

Biyolistik gen verme yöntemleri aynı anda düzinelerce hücreyi etiketleyebilir, ancak yüksek basınçlı parçacık dağıtımını ve izole retinanın gece boyunca inkübasyonunu içeren adımlar hücre fizyolojisini ve dendritik büyümeyi tehlikeye atabilir. Bu makale, aşağıdaki deneysel kriterler göz önüne alındığında, hücre tipi ve yapısal çözünürlük ile erken dendrit dinamiklerini yakalamak için son genetik araçların kullanılabileceğini önermektedir. İlk olarak, gelişmekte olan arborslara hakim olan ince dalları ve filopodia'yı çözmek için, yöntem nöronları tüm çardaktaki süreçleri dolduran parlak, floresan proteinlerle etiketlemelidir. Görüntüleme süresi boyunca fotobeyazlatma nedeniyle floresan etiketleme solmamalıdır. Çeşitli floresan protein varyantları üretilmiş ve parlaklık ve fotostabiliteye dayalı olarak in vivo/ex vivo görüntülemeye11 uygunluk açısından karşılaştırılmıştır. İkincisi, floresan proteinler (XFP'ler), dendrit morfogenezinin en erken aşaması ile yeterince yüksek seviyelerde eksprese edilmelidir, böylece dar gelişim penceresi kaçırılmaz. Fare retinasındaki statik zaman noktalarının analizlerinde, dendrit gelişimi doğum sonrası ilk haftada meydana gelir ve büyüme, yeniden modelleme ve stabilizasyon aşamalarını içerir10,12,13,14,15. Üçüncüsü, yöntem seçici etiketlemeye veya ilgilenilen nöronal alt popülasyonun etiketlenme olasılığının artmasına yol açmalıdır. Dördüncüsü, hedef alt popülasyonun etiketlenmesi yeterince seyrek olmalıdır, böylece tüm nöronal ağaç dikme tanımlanabilir ve izlenebilir. RGC ve amakrin alt tipleri olgun morfolojik özellikleri ve IPL tabakalaşma paternleri16,17,18,19,20 ile ayırt edilebilse de, zorluk, olgunlaşmamış yapılara dayanarak gelişim sırasında alt tipleri tanımlamaktır. Bu görev, geliştirme sırasında spesifik retinal hücre tiplerini etiketlemek için transgenik araçların genişletilmesiyle kolaylaştırılmıştır.

Floresan proteinlerin veya Cre'nin hücresel ve zamansal ekspresyonunun gen düzenleyici elementler tarafından belirlendiği transgenik ve knock-in fare çizgileri, retinal hücre tiplerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır13,21,22,23. Dendrit gelişiminin alt tipe özgü kalıpları üzerine yapılan temel gözlemler, statik zaman noktalarında transgenik fare retinaları üzerine yapılan çalışmalardan gelmiştir10,14,24,25. Özellikle Cre-Lox sistemi, çeşitli rekombinaze bağımlı muhabirler, sensörler ve optogenetik aktivatörler kullanarak alt tiplerin mükemmel gen manipülasyonunu ve izlenmesini sağlar. Bu araçlar, retinal devre düzeneğinin altında yatan alt tipe özgü moleküler programların ve fonksiyonel özelliklerin keşfedilmesine yol açmıştır26,27,28,29,30. Bununla birlikte, fare retinasındaki alt tipe özgü dendrit dinamiklerini incelemek için henüz kullanılmamışlardır. Düşük yoğunluklu etiketleme, Cre fare çizgilerinin elektroporasyon veya rekombinant AAV'ler tarafından tanıtılan transgenlerle birleştirilmesiyle elde edilebilir. Varsa, tamoksifen ile indüklenebilir Cre hatları veya kesişimsel genetik stratejiler de kullanılabilir. Son olarak, hücre minimal invaziv bir şekilde etiketlenmeli ve dokudan ödün vermemek veya dendrit morfogenezi için gerekli hücresel fonksiyona müdahale etmemek için edinim parametreleri kullanılarak görüntülenmelidir.

Burada canlı fare retinal eksplantlarında dendrit dinamiklerini araştırmak için transgenik araçlar ve konfokal mikroskopi uygulamak için bir yöntem sunulmaktadır. Cre transgenik fare çizgileri, Cre rekombinasyonu üzerine floresan proteinleri eksprese eden AAV vektörleri ile birleştirilmiştir, bu da ilgilenilen retinal hücrelerin seyrek etiketlenmesine izin verir. Ticari olarak temin edilebilen AAV'ler intravitreal enjeksiyonlarla yenidoğan retinasına verilir. Bu makale, AAV'lerin 4 dpi ile önemli ölçüde yüksek ve hücre tipine özgü floresan ekspresyonu ürettiğini ve doğum sonrası zaman noktalarına erişime izin verdiğini göstermektedir. Bu yaklaşımı göstermek için, kolinerjik "starburst" amakrin internöron, yenidoğan farelerde kolin asetiltransferaz (ChAT)-internal ribozom giriş bölgesi (IRES)-Pre transgenini eksprese eden Brainbow AAV verilerek etiketlendi31,32. Starburst amakrin hücreleri, kümelenmiş protokadherinlerin aracılık ettiği dendrit kendinden kaçınma ile şekillenen stereotipli ve radyal bir ağaç dikme morfolojisi geliştirir33,34. Bu makale, yıldız patlaması dendritlerinin ve filopodia'nın çözünürlüğünün, Brainbow AAV'ler için kullanıldığı gibi, farzesilasyona uğrayan CAAX motifinin eklenmesiyle XFP'ler tarafından plazma zarına önemli ölçüde iyileştirildiğini göstermektedir31. Son olarak, dendrit rekonstrüksiyonu ve morfometrik niceleme için uygun yüksek kaliteli görüntüler üreten hızlandırılmış görüntüleme ve işlem sonrası protokoller belirlenmiştir. Bu protokol, dendrit morfogenezini kontrol eden faktörleri tanımlamak ve sağlam retinadaki çeşitli hücresel davranışları yakalamak için kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokol, deney günleri arasında viral transdüksiyon için minimum 4-5 günlük bir süre ile 2 güne yayılmaktadır (Şekil 1A). Hayvan deneyleri, Kanada Hasta Çocuklar Hastanesi (Toronto, Kanada) Hayvan Hizmetleri Laboratuvarı Hayvan Kullanımı ve Bakım Komitesi tarafından onaylanan protokoller kapsamında Araştırma ve Laboratuvar Hayvan Bakımında Hayvanların Kullanımı için Hayvan Bakım Kılavuzları Konseyi'ne uygun olarak gerçekleştirilir.

1. Yenidoğan AAV enjeksiyonları ve görüntüleme deneyleri için hazırlıklar

  1. İlgilenilen retinal hücre popülasyonlarını etiketlemek için bir Cre fare çizgisi seçin. AAV enjeksiyonları sırasında Cre rekombinaz ekspresyonunu bir Cre transgenik muhabirine geçerek veya bir Cre antikoru ile immün boyama yoluyla onaylayın.
  2. Cre-pozitif yenidoğan hayvanları üretmek için transgenik Cre farelerini (8-16 haftalık) yetiştirin.
    NOT: Bu gösteri için, kolinerjik Starburst amakrin hücrelerini hedeflemek için ChAT-IRES-Cre knock-in fareleri kullanılmıştır.
  3. Rekombinaz-bağımlı AAV virüsü kodlayan floresan protein(ler)i elde edin. İnce proseslerin optimum şekilde etiketlenmesi için, plazma membranını hedefleyen modifiye XFP'leri ifade eden vektörleri seçin.
    NOT: Bu çalışmada, çok renkli etiketleme seçeneği sunan Brainbow virüsü (BBV), AAV-EF1a-BbTagBY ve AAV9-EF1a-BbChT (bkz. Malzeme Tablosu) kullanılmıştır (Şekil 1B). Farnesile geliştirilmiş sarı floresan protein (eYFP) ve monomerik Kiraz (mCherry) ekspresyonu, canlı görüntüleme için en güçlü floresan sinyallerini üretti. Tek bir BBV, tek tek arborları görüntülemek için kullanılabilirken, BBV'lerin birlikte enjeksiyonu, daha fazla hücreyi veya komşu arborsları farklı floroforlarla etiketlemek için kullanılabilir. Birden fazla floresan proteini kullanılıyorsa, minimum emisyon spektrumu çakışmasını sağlayın (Şekil 1C). Mikroskop toplama parametreleri, farklı XFP sinyallerini yakalamak için ayarlanmalıdır.
  4. Donma/çözülme döngülerini önlemek için tek kullanımlık stoklar için ayrı ayrı düşük bağlayıcı tüplerde ∼3-5 μL AAV alikotları hazırlayın. -80 °C'de saklayın.
  5. Bir mikropipet çektirici kullanarak çok ince uçlu borosilikat cam mikropipetler hazırlayın.
    NOT: Çektirme ayarları, kullanılan filament ve çektirmeye bağlı olarak değişir; Son uç boyutu ve şekli için Şekil 2A'ya bakınız. Tipik damlacık çapları 600 μm'dir.
  6. Bir mikroenjeksiyon sistemi ve ilgili boruları edinin. Mikroenjektörü basınçlı bir hava portuna bağlayın.

figure-protocol-1
Şekil 1: Deneysel genel bakış . (A) Bu protokol, deney günleri arasında en az 4-5 günlük enfeksiyon süresi olan 2 günlük deneyleri kapsar. Göz içi enjeksiyonları, doğum sonrası 3. günden daha eski olmayan yenidoğan farelerde gerçekleştirilir. Retinalar daha sonra istenen gelişimsel pencereyi yakalamak için disseke edilir, düz monte edilir ve canlı olarak görüntülenir. Etiketli hücreler, viral ekspresyon için gerekli 4-5 gün sonra herhangi bir zamanda görüntülenebilir, çünkü uzun süreli AAV ekspresyonunun dendrit morfolojisi üzerinde belirgin bir etkisi yoktur. (B) Cre-dependent Brainbow AAV vektörleri (BBV), Cre31'i ifade eden hayvanlara enjekte edilir. Bu çalışmada, yıldız patlaması amakrin hücrelerinde Cre rekombinasyonunu sürmek için ChAT-Cre knock-in fareleri kullanılmıştır. İki BBV, membran lokalizasyonu için sıralı olarak farnesilleştirilen bir CAAX motifinde sona eren değiştirilmiş eYFP veya tagBFP veya mCherry ve mTFP'yi kodlar. Lox siteleri üçgenlerle tasvir edilmiştir. Vektörler, farzesillenmiş XFP'leri Cre rekombinasyonuna bağlı olarak stokastik ve kombinatoryal bir şekilde eksprese eder. EF1α promotörü, uzama faktörü 1α geninden düzenleyici elementler içerir. W, woodchuck hepatit virüsü posttranskripsiyonel düzenleyici elementinden elementleri temsil eder ve pA, poliadenilasyon dizisini gösterir. (C) Bu çalışmada görüntülenen BBV floroforları olan mCherry ve eYFP'nin uyarılması ve emisyon spektrumları. Çoklu floresan proteinleri canlı görüntülerken, algılama parametreleri emisyon spektrumlarını farklı kanallara yeterince ayıracak şekilde düzenlenmelidir. Kısaltmalar: AAV = adeno ilişkili virüs; BBV = Brainbow AAV; ChAT = kolin asetiltransferaz; iRES = dahili ribozom giriş sitesi; eYFP = gelişmiş sarı floresan proteini; iTR = ters çevrilmiş terminal tekrarı; tagBP = Tag-blue floresan proteini; mCherry = monomerik Kiraz; mTFP = deniz mavisi floresan proteini; XFP = herhangi bir floresan protein; EF1α= uzama faktörü 1 alfa. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Yenidoğan farelerde AAV'lerin intravitreal enjeksiyonları

  1. Buz üzerinde bir AAV aliquot çözün. Steril salin veya fosfat tamponlu salin kullanarak ~ 1: 4 AAV seyreltme hazırlayın. Mikropipetin kırılması ve yeni bir pipetin doldurulması gerekmesi durumunda hayvan başına ~0,5 μL AAV seyreltme (göz başına ~0,25 μL) hazırlayın. Kalan seyreltilmemiş AAV'yi 4 ° C'de saklayın ve 2 hafta içinde kullanın.
    NOT: Bu deneyde, tedarikçi AAV konsantrasyonu ~ 1-2 × 1013 genom içeriği (GC) / mL idi ve 4 × 1012 GC / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltildi. İstenilen etiketleme yoğunluğunu elde etmek için viral konsantrasyonu optimize edin.
  2. Enjeksiyonları görselleştirmek için, çözeltiyi maviye boyamak üzere her 15 μL AAV seyreltme için yaklaşık 1 μL% 0.02 Hızlı Yeşil FCF boya çözeltisi ekleyin.
  3. Barajlı ve yenidoğan çöplü bir fare kafesini (doğum sonrası gün (P) 0.5-3) mikroenjeksiyon ekipmanı olan bir prosedür odasına aktarın. Anne stresini ve yavruların reddedilmesini en aza indirmek için hayvanları yuvalar ve yataklarla aynı kafeste tutun.
  4. Enjeksiyon alanını% 70 etanol ile sterilize edin ve steril bebek bezi pedlerini tezgah yüzeylerine yerleştirin. Hipotermiye bağlı anesteziden kurtulmak için sıcak bir platform (örneğin, bir ısıtma yastığı) hazırlayın.
  5. Mikropipeti bir mikroşırınga kullanarak AAV seyreltme ile doldurun. Bir stereomikroskop altında, ucun mührünü açmak için mikropipet ucunu 30 G'lik bir iğneyle kırın.
    NOT: Şekil 2A , hem kapalı (üstte) hem de mühürsüz (ortada) arkadan doldurulmuş ucu göstermektedir.
  6. Yenidoğan farelerini buz üzerine 1-2 hayvan yerleştirerek hipotermi ile anestezi altına alın. Cildi buzla doğrudan temastan korumak için hayvanları lateks eldiven üzerine yerleştirin. Hayvan artık pençe sıkışmasına (~ 2 dakika) yanıt olarak hareket etmediğinde, hayvanı bir stereomikroskop altına yerleştirin. İstenirse, dövme mürekkebi ve 30 G iğneli dövme pençesi pedleri ve DNA izolasyonu için kuyruk kırpıntıları toplayarak hayvanları genotipleme ile tanımlayın.
    NOT: Anestezi derinliğinin uygun şekilde izlenmesi prosedür boyunca yapılmalıdır.
  7. Gözlerin üzerindeki cildi% 70 etanol ile silin. Kaynaşmış göz kapağını açmak için 30 G'lık bir iğne kullanın (Şekil 2B). Gözü açmak için parmaklarınızla hafif basınç uygulayın ve kornea-sklera kavşağında korneadan küçük bir delik açın (Şekil 2C).
  8. Cam mikropipeti deliğe yerleştirin ve AAV'yi intravitreal boşluğa enjekte etmek için mikroenjektör ayak pedalına 2-4 kez basın. Mikropipeti yavaşça çıkarın ve mavi boyayı göz bebeğinden görselleştirerek AAV enjeksiyonunu onaylayın (Şekil 2D).
    NOT: 6-8 psi ejeksiyon basıncı ve 600-800 ms darbe süresi ile 600 μm çapında bir damlacık dışarı atılır (Şekil 2A, alt). Göz başına yaklaşık 0.23-0.45 μL AAV çözeltisi enjekte edilir. Gözün dışındaki mavi çözelti, AAV'nin göze enjekte edilmediğini gösterir. Enjeksiyon bölgesinden sızan mavi çözelti, AAV'nin dışarı sızmış olabileceğini ve transfeksiyon verimliliğini azalttığını gösterir.
  9. Yeniden kapatmak için göz kapaklarını yavaşça birbirine bastırın ve yavruyu ısıtılmış bir pedin üzerine yerleştirin. Hayvanlar pembemsi bir renge kavuştuktan ve duyarlı olduktan sonra, yavaşça onları muhafaza kafesine geri aktarın.
    NOT: Yavruların çok hızlı bir şekilde yeniden ısınmasını önlemek için uygun önlemlerin alındığından emin olun.
  10. Çöpte kalan hayvanlar için enjeksiyon prosedürünü tekrarlayın. Retinayı görüntülemeden önce viral transdüksiyon için en az 4-5 gün bekleyin.

figure-protocol-2
Şekil 2: Yenidoğan göz içi enjeksiyonları . (A) Geri doldurulmuş mikropipet, pipet ucunun kapatıldığında (üstte) ve uç açıldıktan sonra (altta, solda) şeklini gösterir. 6-8 psi'lik piko enjeksiyon basıncı ve 600-800 ms'lik darbe süresi, 600 μm çapında bir damlacık üretir (alt, sağ). Ölçek çubuğu = 1 mm.(B) 16x büyütme altında anestezi uygulanmış P0 yavrusu. Kaynaşmış göz kapağı bağlantısı (beyaz), keskin bir 30 G iğne kullanılarak yarık açılır. Ölçek çubuğu = 2 mm. (C) Göze uygulanan hafif basınç korneayı açığa çıkarır; ölçek çubuğu = 2 mm. Yakınlaştırılmış bölüm (kırmızı), 30 G'lik bir iğne ile oluşturulan kornea-sklera kavşağındaki (sarı) küçük deliği gösterir; ölçek çubuğu = 0,5 mm. (D) Enjeksiyondan sonra pipet ucunun çekilmesi (solda). AAV çözeltisindeki Hızlı Yeşil boya, enjeksiyondan önceki açık göz bebeği rengine kıyasla (sağda) göz bebeği boyunca mavi-gri olarak görünür (ortada). Ölçek çubuğu = 1 mm. (E) 4 gün sonra, göz kapağı iyileşti ve kaynaşarak kapandı (solda); ölçek çubuğu = 2 mm. Enükleasyon üzerine, iyileşmiş enjeksiyon bölgesi görülebilir (sarı); ölçek çubuğu = 1 mm. Enjeksiyon bölgesinin kornea ve sklera arasındaki sınırdaki konumuna dikkat edin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Görüntüleme deneyi için retina diseksiyonları

  1. Retinal aCSF (119 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.3 mM MgCl2·6H2O, 2.5 mM CaCl2·2H2O, 1 mM NaH2PO4, 11 mM glikoz ve 20 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit (HEPES serbest asit)35 hazırlayın. İstenirse, 10x çözeltisini hazırlayın ve dondurun; çözülür ve gerektiğinde 1x'e kadar seyreltilir.



figure-protocol-3





figure-protocol-4





Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıdaki protokolü kullanarak, yıldız patlaması hücresi dendritlerinin geliştirilmesinin yüksek çözünürlüklü bir 3D videosu elde edildi, deconvolved edildi ve 3D sürüklenme için düzeltildi. Analiz için 2D videolar yapmak üzere Z-düzlemi maksimum projeksiyonları üretildi (Ek Video 1, Şekil 5A). Her zaman noktasının 3D dekonvolüsyonu, ince filopodia projeksiyonlarının çözünürlüğünü arttırmıştır (Şekil 5B, C). İnce filopodia çıkı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu video, gelişmekte olan retinal nöronların dendrit dinamiklerini konfokal canlı görüntüleme ile görüntülemek için mevcut genetik araçları kullanan deneysel bir boru hattını göstermektedir. Ayrıca, membran hedefli floresan proteinlerini yenidoğan farelere kodlayan Cre-bağımlı AAV'lerin göz içi enjeksiyonları da gösterilmiştir. Genetik olarak hedeflenmiş popülasyonların tek hücreleri, 4-5 dpi kadar erken bir sürede parlak bir şekilde etiketlenir. Standart görüntüleme odalarının canlı hücre konfokal görüntülemesini gerçek...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Madison Gray'e, hiç sahip olmadığım zamanlarda bana yardım ettiği için teşekkür ederiz. Bu araştırma bir NSERC Keşif Bursu (RGPIN-2016-06128), Nörobilimde bir Sloan Bursu ve bir Kanada Araştırma Başkanı Tier 2 (J.L.L.'ye) tarafından desteklenmiştir. S. Ing-Esteves, Görme Bilimleri Araştırma Programı ve NSERC Yüksek Lisans Bursları-Doktora tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Addgene viral hazırlık # 45185-AAV9
Addgene viral hazırlık # 45186-AAV9
< güçlü >Diseksiyon araçları < / strong>
selüloz filtre kağıdıWhatman1001-070
Dumont #5 ince forsepsFST11252-20Retinal mikro diseksiyon için iki Dumont # 5 forseps gereklidir
Dumont forsepsVWR82027-426
İnce MakasFST14058-09
Karışık selüloz ester membran (MCE) filtre kağıtları, hidrofilik, 0.45 ve mikro; m gözenek boyutuMilliporeHABG01 300
Petri Kabı, 50 > 15 mmVWR470313-352
Polietilen tek kullanımlık transfer pipetiVWR470225-034
Yuvarlak uçlu boya fırçası, boyut 3/0Geleneksel sanat malzemeleri mağazasıRetinal düz montaj için iki boy 3/0 boya fırçası (veya daha küçük) gereklidir
Cerrahi MakasFST14007-14
Vannas Yaylı Makas - 2,5 mm Kesici KenarFST15000-08
Canlı görüntüleme inkübasyon sistemi
hazneli polietilen boru, PE-160 10'WarnerInstruments64-0755
Çift kanallı ısıtıcı kontrol cihazı, Model TC-344CWarner Instruments64-2401
HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR daldırma objektifiLeica15506374
Isıtıcı kontrol kablosuWarner InstrumentsCC-28
Dilim destekli büyük banyo inkübasyon odasıWarner InstrumentsRC-27L
MPII Mini-Peristaltik PompaHarvard Aparatı70-2027
PM-6D Manyetik Isıtmalı Platform (inkübasyon odası ısıtıcısı)Warner InstrumentsPM-6D
MPII Mini-Peristaltik Pompa Harvard Aparatı için Pompa Kafası Boru Parçaları55-4148
Numune ankrajı (Harps)Warner Instruments64-0260Numune ankrajı inkübasyon odası ile uyumlu olmalıdır
Sloflo Sıralı Çözelti IsıtıcıWarner InstrumentsSF-28
Yenidoğan Enjeksiyonları
10 ve mikro; L Mikrolitre Şırınga Serisi 700, Çıkarılabilir İğneHamilton Company80314
30 G Hipodermik İğneler (0,5 inç)BD PrecisionGlide305106
4 inç ince duvarlı cam kılcal, filament yok (1,0 mm dış çap / 0,75 mm) WPI World Precision InstrumentsTW100-4
Etanol %99,8 (çift damıtılmış su ile %70'e seyreltmek için [ddH2O])Sigma-AldrichV001229 
AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYFPenn Vektör ÇekirdeğiAV-9-PV2453Addgene Plazmid #45185 
AAV9.hEF1a.lox.mKiraz.lox.mTFP
1.lox. WPRE.hGH-InvCheTF		Penn Vektör ÇekirdeğiAV-9-PV2454Addgene Plazmid # 45186
ChAT-IRES-Cre knock-in transgenik fare hattıJackson Laboratuvarı6410
Hızlı Yeşil FCF Boya içeriği &; %85Sigma-AldrichF7252-25G
Alevli/Kahverengi Mikropipet Çektirme, model P-97Sutter Instrument Co.P-97
Yeşil dövme macunuKetchum MFG Co329A
Fosfat Tamponlu Salin, pH 7.4, sıvı, steril filtreli, hücre kültürüne uygunSigma-Aldrich806552
Pnömatik PicoPumpWPI World Hassas AletlerPV-820
Oksijenli artifiyal beyin omurilik sıvısı (aCSF) Reaktifler
Kalsiyum klorür dihidrat (CaCl2· 2H2O)Sigma-AldrichC7902
Karbojen (%5 CO2, %95 O2)AirGasX02OX95C2003102Tedarikçi, bölgeye göre değişebilir
D- (+) - GlikozSigma-AldrichG7021
HEPES, Serbest Asit BioBasicHB0264
Hidroklorik asit çözeltisi, 1 NSigma-AldrichH9892
Magnezyum klorür hekzahidrat (MgCl2· 6H < alt > 2 < / alt > O)Sigma-AldrichM2670
pH-Test şeritleri (6.0-7.7)VWRBDH35317.604
Potasyum klorür (KCl)Sigma-AldrichP9541
Sodyum klorür (NaCl)Bio BasicDB0483
Sodyum fosfat monobazik (NaH2< / sub>PO4< / sub>)Sigma-AldrichRDD007
Software
ImageJUlusal Sağlık Enstitüleri (NIH)Açık kaynak

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lefebvre, J. L., Sanes, J. R., Kay, J. N. Development of dendritic form and function. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 741-777 (2015).
  2. Graham, H. K., Duan, X. Molecular mechanisms regulating synaptic specificity and retinal circuit formation. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental biology. 10 (1), 379(2021).
  3. Godinho, L., et al. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. 132 (22), 5069-5079 (2005).
  4. Mumm, J. S., et al. In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells. Neuron. 52 (4), 609-621 (2006).
  5. Wong, W. T., Faulkner-Jones, B. E., Sanes, J. R., Wong, R. O. Rapid dendritic remodeling in the developing retina: dependence on neurotransmission and reciprocal regulation by Rac and Rho. The Journal of Neuroscience. 20 (13), 5024-5036 (2000).
  6. Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nature Protocols. 5 (7), 1347-1352 (2010).
  7. Morgan, J. L., Wong, R. O. L. Ballistic labeling with fluorescent dyes and indicators. Current Protocols in Neuroscience. 43 (1), 1-10 (2008).
  8. Nickerson, P. E. B., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Developmental Biology. 13, 24(2013).
  9. Morgan, J. L., Dhingra, A., Vardi, N., Wong, R. O. L. Axons and dendrites originate from neuroepithelial-like processes of retinal bipolar cells. Nature Neuroscience. 9 (1), 85-92 (2006).
  10. Coombs, J. L., Van Der List, D., Chalupa, L. M. Morphological properties of mouse retinal ganglion cells during postnatal development. The Journal of Comparative Neurology. 503 (6), 803-814 (2007).
  11. Cranfill, P. J., et al. Quantitative assessment of fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (7), 557-562 (2016).
  12. Stacy, R. C., Wong, R. O. L. Developmental relationship between cholinergic amacrine cell processes and ganglion cell dendrites of the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 456 (2), 154-166 (2003).
  13. Kay, J. N., et al. Retinal ganglion cells with distinct directional preferences differ in molecular identity, structure, and central projections. The Journal of Neuroscience. 31 (21), 7753-7762 (2011).
  14. Liu, J., Sanes, J. R. Cellular and molecular analysis of dendritic morphogenesis in a retinal cell type that senses color contrast and ventral motion. The Journal of Neuroscience. 37 (50), 12247-12262 (2017).
  15. Diao, L., Sun, W., Deng, Q., He, S. Development of the mouse retina: emerging morphological diversity of the ganglion cells. Journal of Neurobiology. 61 (2), 236-249 (2004).
  16. Coombs, J., vander List, D., Wang, G. Y., Chalupa, L. M. Morphological properties of mouse retinal ganglion cells. Neuroscience. 140 (1), 123-136 (2006).
  17. Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
  18. Sümbül, U., et al. A genetic and computational approach to structurally classify neuronal types. Nature Communications. 5, 3512(2014).
  19. Lin, B., Masland, R. H. Populations of wide-field amacrine cells in the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 499 (5), 797-809 (2006).
  20. Macneil, M. A., Heussy, J. K., Dacheux, R. F., Raviola, E., Masland, R. H. The shapes and numbers of amacrine cells: Matching of photofilled with Golgi-stained cells in the rabbit retina and comparison with other mammalian species. Journal of Comparative Neurology. 413 (2), 305-326 (1999).
  21. Ivanova, E., Hwang, G. S., Pan, Z. H. Characterization of transgenic mouse lines expressing Cre recombinase in the retina. Neuroscience. 165 (1), 233-243 (2010).
  22. Jo, A., Xu, J., Deniz, S., Cherian, S., DeVries, S. H., Zhu, Y. Intersectional strategies for targeting amacrine and ganglion cell types in the mouse retina. Frontiers in Neural Circuits. 12, 66(2018).
  23. Siegert, S., et al. Genetic address book for retinal cell types. Nature Neuroscience. 12 (9), 1197-1204 (2009).
  24. Kim, I. -J., Zhang, Y., Meister, M., Sanes, J. R. Laminar restriction of retinal ganglion cell dendrites and axons: subtype-specific developmental patterns revealed with transgenic markers. The Journal of Neuroscience. 30 (4), 1452-1462 (2010).
  25. Peng, Y. -R., Tran, N. M., Krishnaswamy, A., Kostadinov, D., Martersteck, E. M., Sanes, J. R. Satb1 regulates contactin 5 to pattern dendrites of a mammalian retinal ganglion cell. Neuron. 95 (4), 869-883 (2017).
  26. Duan, X., Krishnaswamy, A., Dela Huerta, I., Sanes, J. R. Type II cadherins guide assembly of a direction-selective retinal circuit. Cell. 158 (4), 793-807 (2014).
  27. Ray, T. A., et al. Formation of retinal direction-selective circuitry initiated by starburst amacrine cell homotypic contact. eLife. 7, 34241(2018).
  28. Krishnaswamy, A., Yamagata, M., Duan, X., Hong, Y. K., Sanes, J. R. Sidekick 2 directs formation of a retinal circuit that detects differential motion. Nature. 524 (7566), 466-470 (2015).
  29. Caval-Holme, F., Zhang, Y., Feller, M. B. Gap junction coupling shapes the encoding of light in the developing retina. Current Biology. 29 (23), 4024-4035 (2019).
  30. Lucas, J. A., Schmidt, T. M. Cellular properties of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells during postnatal development. Neural Development. 14 (1), 8(2019).
  31. Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. 10 (6), 540-547 (2013).
  32. Rossi, J., et al. Melanocortin-4 receptors expressed by cholinergic neurons regulate energy balance and glucose homeostasis. Cell Metabolism. 13 (2), 195-204 (2011).
  33. Lefebvre, J. L., Kostadinov, D., Chen, W. V., Maniatis, T., Sanes, J. R. Protocadherins mediate dendritic self-avoidance in the mammalian nervous system. Nature. 488 (7412), 517-521 (2012).
  34. Ing-Esteves, S., et al. Combinatorial effects of alpha- and gamma-protocadherins on neuronal survival and dendritic self-avoidance. The Journal of Neuroscience. 38 (11), 2713-2729 (2018).
  35. Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. L. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (1), (2013).
  36. Ramoa, A. S., Campbell, G., Shatz, C. J. Transient morphological features of identified ganglion cells in living fetal and neonatal retina. Science. 237 (4814), 522-525 (1987).
  37. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  38. Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nature Biotechnology. 28 (4), 348-353 (2010).
  39. Cuntz, H., Forstner, F., Borst, A., Häusser, M. One rule to grow them all: a general theory of neuronal branching and its practical application. PLoS Computational Biology. 6 (8), 1000877(2010).
  40. Xiao, H., Peng, H. APP2: automatic tracing of 3D neuron morphology based on hierarchical pruning of a gray-weighted image distance-tree. Bioinformatics. 29 (11), 1448-1454 (2013).
  41. Nanda, S., et al. Design and implementation of multi-signal and time-varying neural reconstructions. Scientific data. 5, 170207(2018).
  42. Sherry, D. M., Wang, M. M., Bates, J., Frishman, L. J. Expression of vesicular glutamate transporter 1 in the mouse retina reveals temporal ordering in development of rod vs. cone and ON vs. OFF circuits. The Journal of Comparative Neurology. 465 (4), 480-498 (2003).
  43. Johnson, J., et al. Vesicular neurotransmitter transporter expression in developing postnatal rodent retina: GABA and glycine precede glutamate. The Journal of Neuroscience. 23 (2), 518-529 (2003).
  44. Jüttner, J., et al. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).
  45. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  46. Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (31), e1333(2009).
  47. Lye, M. H., Jakobs, T. C., Masland, R. H., Koizumi, A. Organotypic culture of adult rabbit retina. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e190(2007).
  48. Pignatelli, V., Strettoi, E. Bipolar cells of the mouse retina: a gene gun, morphological study. The Journal of Comparative Neurology. 476 (3), 254-266 (2004).
  49. Huckfeldt, R. M., et al. Transient neurites of retinal horizontal cells exhibit columnar tiling via homotypic interactions. Nature Neuroscience. 12 (1), 35-43 (2009).
  50. Prahst, C., et al. Mouse retinal cell behaviour in space and time using light sheet fluorescence microscopy. eLife. 9, 49779(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Neuronal ArborizationTime Lapse ImagingRetinal Cell PopulationsAdeno Associated VirusSparse LabelingConfocal MicroscopyCre Lox SystemDendrite DynamicsRetinal Flat Mount3D Deconvolution

Related Articles