Method Article

Küçük Moleküllerin Mikrokristal Elektron Kırınımı

DOI:

10.3791/62313

⸱

March 15th, 2021

 , 
1Howard Hughes Medical Institute, University of California Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, University of California Los Angeles, 3Department of Physiology, University of California Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, mikrokristal elektron kırınımı (MicroED) deneyleri için küçük moleküllü kristallerin tozlarının hazırlanması için laboratuvarımızda geliştirilen prosedürleri açıklıyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrokristal elektron kırınımı (MicroED) deneyleri için küçük molekül örnekleri hazırlamak için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. MicroED, standart elektron kriyo-mikroskopi (cryo-EM) ekipmanı kullanılarak proteinlerin ve küçük moleküllerin yapılarını çözmek için geliştirilmiştir. Bu şekilde, küçük moleküller, peptitler, çözünür proteinler ve membran proteinleri son zamanlarda yüksek çözünürlüklerde belirlenmiştir. Örnek olarak karbamazepin ilacını kullanarak küçük moleküllü farmasötiklerin ızgaralarını hazırlamak için protokoller burada sunulmuştur. Verilerin taranması ve toplanmasına yönelik protokoller sunulmaktadır. Veri entegrasyonu, yapı belirleme ve iyileştirme gibi genel süreçteki ek adımlar başka yerlerde sunulmaktadır. Küçük moleküllü ızgaraları hazırlamak için gereken sürenin 30 dakikadan az olduğu tahmin edilmektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrokristal elektron kırınımı (MicroED), mikrometre altı boyutlu kristallerdenatomik çözünürlük yapılarını belirlemek için kullanılan bir elektron kriyo-mikroskopi (cryo-EM) yöntemidir 1,2. Kristaller standart transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ızgaralarına uygulanır ve sıvı etan veya sıvı azota daldırılarak dondurulur. Izgaralar daha sonra kriyojenik sıcaklıklarda çalışan bir TEM'e yüklenir. Kristaller ızgarada bulunur ve ilk kırınım kalitesi için taranır. Sürekli rotasyon MicroED verileri, verilerin film olarak hızlı bir kamera kullanılarak kaydedildiği taranmış kristallerin bir alt kümesinden toplanır

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Küçük molekül örneklerinin hazırlanması

  1. Az miktarda (0.01 - 1 mg) toz, sıvı veya katı maddeyi küçük bir şişeye veya tüpe aktarın.
  2. Zaten toz halinde olan numuneler için, numuneye ihtiyaç duyulana kadar kapağı kullanarak tüpü kapatın. Yöntem 1 (adım 3) veya 2 (adım 4) denemelerinden önce sıvı numuneleri tozlar halinde kurutun.
    NOT: Sıvı içinde çözünmüş numuneler aşağıdaki yöntem 3'ü (5.X) kullanabilir

2. TEM ızgaralarının hazırlanması

NOT: Otomatik yükleyici sistemli bazı TEM'ler, TEM kolonuna yüklenmeden önce ızgaraların kırpılmasını ve bir kasete yerleştirilmesini gerektirir. Kırpma,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroED, elektronlar ve madde arasındaki güçlü etkileşimlerden yararlanan ve kaybolan küçük kristallerin araştırılmasına izin veren bir kriyoEM yöntemidir12,13. Bu adımlardan sonra, mikrokristallerden toplanan kristalografik formatta bir kırınım filmine sahip olması beklenmektedir (Film 1). Burada, teknik karbamazepin12 kullanılarak gösterilmiştir. Sonuçlar, bir TEM ızgarasında tanımlanan bir karbamazepin mikrokristalinden.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Numune hazırlama tipik olarak, tarama ve veri toplama oturumlarından sonra optimizasyonların yapıldığı yinelemeli bir işlemdir. Küçük moleküllü numuneler için, birçok farmasötik hidrofobik olma eğiliminde olduğundan, ızgaraları kızdırmadan ilk önce ızgara hazırlamayı denemek genellikle ihtiyatlıdır10,11. Izgaralarda çok az nanokristal birikintisi varsa, ızgaraları ilk kez kızdırdıktan sonra tekrar denemek iyi bir fikirdir. Liyofilize tozlardan elde edilen kristal.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gonen laboratuvarı, Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nün fonlarıyla desteklenmektedir. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri P41GM136508 tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-1.5mL Eppendorf tüpleriFisher Scientific14-282-300Herhangi bir flakon veya tüp yapacaktır.
Otomatik ızgara klipsleriThermo-Fisher1036173MicroED için kırpılmış ızgaralar gerekli değildir. Otomatik yükleyici sistemi ile donatılmış Thermo-Fisher TEM'ler için gereklidirler.
Otomatik ızgara C-halkalarıThermo-Fisher1036171
KarbamazapinSigmaC4024-1GBu deneyler için herhangi bir miktar yeterli olacaktır
CMOS tabanlı dedektörThermo-FisherCetaD 16MBir CetaD 16M kullandık, ancak deklanşör modu veya yeterince hızlı okuma ile herhangi bir dedektör kabul edilebilir.
Delphi yazılımıThermo-FisherN/AThermo-Fisher TEM sistemlerinde numune aşamasının manuel olarak döndürülmesine izin veren yazılım
EPU-D yazılımıThermo-FisherN/AMicroED verilerinin elde edilmesi için ticari yazılım
Cam kapak slaytlarıHamptonHR3-231
Kızdırma boşaltıcıPelcoeasiGlow
Yüksek Hassasiyetli CımbızEMS78325-ACHerhangi bir yüksek hassasiyetli cımbız işinizi görecektir
Sıvı nitrojen kabıMızrak LaboratuvarıFD-800Sıvı nitrojen altında numunelerin işlenmesi için standart bir köpük kap - 800mL
SerialEM yazılımıUC BoulderN/AD. Mastronarde tarafından dağıtılan ücretsiz yazılım. Moleküler, Hücresel ve Gelişimsel Biyoloji Bölümü
TEM ızgaralarıBurada Quantifoil/EMSQ310CMAMulti-A 300 gözenekli ızgaralar kullanıldı, ancak herhangi bir ince karbon ızgara işe yarayacaktır. Bu küçük moleküller için sürekli karbon ile başlamanızı öneririz.
transmisyon elektron mikroskobu (TEM)Thermo-FisherTalos Arctica
Whatman dairesel filtre kağıdıMillipore-SigmaWHA1001090 90mm veya daha büyük

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345(2013).
  2. Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. High-resolution structure determination by continuous-rotation data ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microcrystal Electron DiffractionSmall Molecule StructureMicroED ProtocolElectron Cryo MicroscopyTEM Grid PreparationHigh Resolution StructureDiffraction Data CollectionCrystallographic SoftwareSample PreparationAtomic Resolution

Related Articles