Ligand Tahlilinin Diferansiyel Radyal Kılcal Etkisi ile Küçük Ligandların Bağlayıcı Proteinlerinin Tanımlanması (DRaCALA)

Özet

Ligand Assay'ın Diferansiyel Radyal Kılcal Etkisi (DRaCALA), orfeome kütüphanesi kullanarak bir organizmanın küçük ligand bağlayıcı proteinlerini tanımlamak için kullanılabilir.

Özet

Son on yılda bakteriyel fizyolojide küçük sinyal moleküllerinin anlaşılmasında muazzam bir ilerleme kaydedildi. Özellikle, nükleotid türevi ikincil habercilerin (NSM) hedef proteinleri sistematik olarak tanımlanmış ve model organizmalarda incelenmiştir. Bu başarılar esas olarak, bu küçük moleküllerin hedef proteinlerini sistematik olarak tanımlamak için kullanılan ligand tahlilinin (DRaCALA) yakalama bileşik tekniği ve diferansiyel radyal kılcal etkisi de dahil olmak üzere birkaç yeni tekniğin geliştirilmesinden kaynaklanmaktadır. Bu makalede, DRaCALA tekniğinin bir örneği ve video gösterimi olarak NSM'lerin, guanosine penta ve tetrafosfatların (p)ppGpp kullanımı açıklanmaktadır. DRaCALA kullanılarak, bu tahlilin gücünü gösteren Escherichia coli K-12 model organizmasında bilinen 20'den 9'u ve (p)ppGpp'nin 12 yeni hedef proteini tanımlanmıştır. Prensip olarak, DRaCALA radyoaktif izotoplar veya floresan boyalar ile etiketlenebilen küçük ligandların incelenmesi için kullanılabilir. Bu tekniğin daha fazla uygulanması için DRaCALA'nın kritik adımları, artıları ve eksileri burada tartışılmaktadır.

Giriş

Bakteriler sürekli değişen ortamlara uyum sağlamak için birkaç küçük sinyal molekülü kullanır^1,2. Örneğin, otoindüserler, N-acylhomoserine lactones ve modifiye oligopeptidleri, popülasyon davranışını koordine etmek için bakteriler arasındaki hücreler arası iletişime aracılık eder, çekirdek algılama olarak bilinen bir fenomen². Bir diğer küçük sinyal molekülü grubu, yaygın olarak çalışılan döngüsel adenozin monofosfat (cAMP), döngüsel di-AMP, döngüsel di-guanosine monofosfat (döngüsel di-GMP) ve guanosine penta ve tetra fosfatları (p)ppGpp¹dahil olmak üzere NSM'lerdir. Bakteriler bu NSM'leri çeşitli stres koşullarına yanıt olarak üretirler. Üretildikten sonra, bu moleküller hedef proteinlerine bağlanır ve karşılaşılan streslerle başa çıkmak ve bakteriyel sağkalımını artırmak için birkaç farklı fizyolojik ve metabolik yolu düzenler. Bu nedenle, hedef proteinlerin tanımlanması, bu küçük moleküllerin moleküler fonksiyonlarını çözmek için kaçınılmaz bir ön koşuldur.

Son on yıl, esas olarak bu küçük moleküllerin hedef proteinlerini ortaya çıkaran çeşitli teknik yenilikler nedeniyle, bu küçük sinyal molekülleri hakkında bir bilgi patlamasına tanık oldu. Bunlar arasında yakalama bileşik tekniği^3,4,5ve ligand tahlil (DRaCALA)^6'nın diferansiyel radyal kılcal etkisi bu makalede tartışılacaktır.

Vincent Lee ve iş arkadaşları tarafından 2011^6'daicat edilen DRaCALA, nitroselüloz membran yeteneğini farklı olarak sequester serbest ve proteine bağlı ligandlara dağıtır. Proteinler gibi moleküller nitroselüloz bir zar üzerinde yayılamazken, NSM'ler gibi küçük ligandlar yayılabilir. NSM'yi(örneğin,ppGpp) test edilecek proteinle karıştırarak ve membran üzerinde tespit ederek, iki senaryo beklenebilir (Şekil 1): Eğer (p)ppGpp proteine bağlanırsa, radyolabeled (p)ppGpp protein tarafından noktanın merkezinde tutulur ve dışarı doğru dağılmasın, yoğun bir küçük nokta (yani. güçlü radyoaktif sinyal) bir fosforimager altında. Bununla birlikte, (p)ppGpp proteine bağlanmazsa, tekdüze arka plan radyoaktif sinyali olan büyük bir nokta üretmek için serbestçe dışa doğru dağılacaktır.

Ayrıca, DRaCALA, protein yeterli miktarda mevcutsa, tüm hücre lisatında küçük bir molekül ile amaçlanmamış bir protein arasındaki etkileşimi tespit edebilir. Bu basitlik, bir ORFeome ifade kitaplığı kullanarak protein hedeflerini hızla tanımlamada DRaCALA'nın kullanılmasına izin verir. Nitekim, cAMP⁷, siklik di-AMP⁸, döngüsel di-GMP^9,10ve (p)ppGpp 11^,12,13hedef proteinleri DRaCALA kullanılarak sistematik olarak tanımlanmıştır. Bu video makalesi, başarılı bir DRaCALA taraması gerçekleştirmedeki kritik adımları ve dikkat edilmesi gerekenleri göstermek ve açıklamak için örnek olarak (p)ppGpp kullanır. Not olarak, DRaCALA^14'ün daha kapsamlı bir açıklamasının, DRaCALA'yı gerçekleştirmeden önce bu makaleyle birlikte okunması şiddetle tavsiye edilir.

Şekil 1: DRaCALA prensibi. (A) DRaCALA tahlilinin şeması. Ayrıntılar için metne bakın. (B) Bağlama fraksiyonunun nicelleştirilmesi ve hesaplanması. Ayrıntılar için metne bakın. Kısaca, DRaCALA lekeleri, tüm noktayı ve iç koyu noktayı(yani,test edilen proteinin bağlanması nedeniyle tutulan (p)ppGpp) çevreleyen iki daire çizilerek analiz edilecektir. Spesifik bağlama sinyali, spesifik olmayan arka plan sinyalini çıkardıktan sonra iç dairenin (S1) radyoaktif sinyalidir (A₁ × ((S₂-S₁)/(A 2 -A₁))) tarafından hesaplanır). Bağlama fraksiyonu, toplam radyoaktif sinyale (S2) bölünen belirli bağlama sinyalidir. Kısaltmalar: DRaCALA = Ligand Tahlilinin Diferansiyel Radyal Kılcal Hareketi; (p)ppGpp = guanosine penta ve tetrafosfatlar; RT = oda sıcaklığı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

1. Tüm hücre lysates hazırlanması

1. E. coli K-12 ASKA ORFeome toplama suşlarını 96 kuyu derinliğindeki kuyu plakalarında 25 μg/mL kloramfenikol içeren¹⁵ ile 1,5 mL Lysogeny et suyu (LB) içine aşılayın. 30 °C'de 18 saat boyunca gece boyunca (O/N) büyüyün ve 160 rpm'de sallanın. Ertesi gün, 6 saat boyunca 30 °C'de protein ekspresyona neden olmak için O/N kültürlerine izopropil β-d-1-tiyogalactopyranoside (IPTG) (son 0,5 mM) ekleyin.
2. Pelet hücreleri 10 dakika boyunca 500 x g'da. Peletleri kullanıma kadar -80 °C'de dondurun. Hücreleri lyse etmek için 150 μL lizis tamponU L1 (40 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl_2,peletin yeniden diriltmek için 2 mM fenillemetilsülfonil florür (PMSF), 40 μg / mL DNaz 1 ve 0.5 mg / mL lizozim) ile desteklenmiştir.
3. Hücreleri -80 °C'de 30 dakika dondurun ve ardından 37 °C'de 20 dakika çözün. Hücreleri renksiz etmek için bu döngüyü üç kez tekrarlayın. Kullanımdan önce lysates'i -80 °C'de saklayın.

2. Rel_seq ve GppA'nın Saflaştırılması

NOT: Streptococcus equisimilis'ten Rel_seq ve E. coli K-12'den GppA proteinleri sırasıyla radyolabeled pppGpp ve ppGpp'yi sentezlemek için kullanılır.

1. Her proteini aşırı ifade eden hücreleri büyütün ve toplayın.
   1. E. coli BL21 DE3 zorluğunu LB suyunda üstel faza (optik yoğunluk (OD) ~0,3-0,4) kadar büyütün ve 5 dakika boyunca 6000 x g'da 1 mL kültür aşağı çevirin. Süpernatantı deklare edin ve hücreleri 100 μL buz gibi TSB suyu ile yeniden depola (LB suyu 0.1 g/mL PEG3350, 0.05 mL/ mL dimetilsüllfoksit, 20 mM MgCl₂ile desteklenmiştir).
   2. Histidin etiketli rel_seq ve gppAtaşıyan plazmidleri, her 100 ng'yi TSB'deki yukarıdaki hücre süspansiyonlarıyla karıştırın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın. Hücreleri 40 s için 42 °C'de ısı şoku. Karışımı 2 dakika boyunca buza yerleştirin ve hücrelerin 160 rpm'de ajitasyonla 37 °C'de 1 saat boyunca iyileşmesini sağlamak için oda sıcaklığında 1 mL LB suyu ekleyin.
   3. Kurtarılan hücreleri LB agar plakalarında ilgili antibiyotiklerle birlikte plakalayın (Rel_seq:100μg/mL ampisilin; GppA: 30 μg/mL kanamycin). Ertesi gün, LB suyundaki kolonileri aşılayıp her iki türün de 37 °C'de O/N ön kültürlerine başlayın.
   4. 18 saat sonra, 500 mL LB ortamını 10 mL O/N kültürleri ve ilgili antibiyotiklerle aşıla. 37 °C'de 160 rpm'de titreyerek kültürleri büyütün. OD_600nm 0.5-0.7'ye ulaştığında, 0.5 mM IPTG ekleyerek ve 30 °C'de 3 saat boyunca 160 rpm'de sallanarak protein ekspresyona neden olan protein ekspresyona neden olan.
   5. 4 °C'de 10 dakika boyunca 6084 x g'da dönerek hücreleri toplayın. Peleti 20 mL buz gibi 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ve 1912 x g'da 4 °C'de 20 dakika boyunca yeniden santrifüjle yeniden depola. Süpernatantı dekant ve kullanmadan önce peletleri -20 °C'de dondurun.
2. Nikel-nitrilotriyastik asit (Ni-NTA) benzeşim saflaştırması
   NOT: Bu noktadan sonra numunelerin soğuk olduğundan emin olun.
   1. 40 mL buz gibi lizis tamponU L2 ekleyin (50 mM Tris pH 7.5, Peletin yeniden canlandırmak için proteaz inhibitörleri (EDTA içermeyen tablet; Malzeme Masasınabakın) ile desteklenmiş 150 mM NaCl, %5 gliserol, 10 mM imidazol, 10 mM β-mercaptoethanol. Hücreleri sonikasyon yoluyla lyse (60% genlik, 2 s ON / 4 s OFF 8 dk ON). 4 °C'de 40 dakika boyunca 23.426 x g'da dönerek lisatı temizleyin ve saflaştırma için süpernatant ile devam edin.
   2. Yukarıdaki santrifüjleme sırasında Ni-NTA reçinesini hazırlayın.
      1. 500 μL homojenize Ni-NTA reçinesini ayakta duran bir polipropilen kromatografi sütununa aktarın ve 15 dakika yetinip depolama çözeltisinin akmasına izin verin. Reçineyi iki kez 15 mL ultra saf suyla yıkayın ve ardından sütunu 15 mL lizis tamponU L2 ile yıkayın.
   3. Temizlenmiş hücre likırını 1. Kolonu 30 mL yıkama tamponu ile yıkayın (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, % 5 gliserol, 20 mM imidazol).
   4. Proteinleri 400 μL elution tamponu (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, % 5 gliserol, 500 mM imidazol) ile üç kez elute edin. Ardından, başka bir 300 μL elution tamponu ile tekrarlayın. Eluted proteinleri 700 μL'lik son bir hacimde birleştirin.
3. Jel filtrasyonu
   1. Jel filtrasyon tamponu hazırlayın (50 mM Tris, pH 7.5; 200 mM NaCl; % 5 gliserol). Boyut dışlama sütununu jel filtrasyon arabelleği bir sütun hacmi (25 mL) ile yıkayın.
   2. Yukarıdaki 700 μL örneğini 500 μL döngü kullanarak yükleyin, 0,5 mL / dak'ta çalıştırın ve ilgili proteinleri içeren her biri 0,5 mL hacimde 2-3 fraksiyon toplayın.
   3. Bir spin sütunu kullanarak proteinlerin her birini içeren fraksiyonları birleştirin ve konsantre edin ve Bradford testini kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün.

3. ³²P etiketli pppGpp ve ppGpp sentezi

1. Küçük ölçekli bir Rel_seq reaksiyonını bir vida kapağı tüpüne monte edin (bkz. Tablo 1).
   NOT: Radyoaktif reaktiflerle yalnızca lisanslı bir yerde ve kişisel koruyucu ekipmanlarla çalışın.

	Hacim (μL)
	Küçük ölçekli	Büyük ölçekli
Ultra saf su
10x Relseq arabelleği*	2	50
ATP (8 mM finali)
Relseq (4 μM finali)
32 P-α-Guanosine trifosfat (GTP) (son 120 nM) (DİkKAT)	0.2	5
toplam	20	500

Tablo 1: ³²P etiketli pppGpp'nin küçük ve büyük ölçekli sentez reaksiyonları için bilgilerin bir araya getirilir. *10x Relseq tamponu 250 mM Tris-HCl, pH 8.6 içerir; 1M NaCl; 80 mM MgCl₂. Kısaltma: pppGpp = guanosin pentafosfat.

2. Tüpü 37 °C'de bir termomikserde 1 saat, daha sonra 95 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın ve 5 dakika boyunca buza yerleştirin. Çökeltilmiş proteini 5 dakika boyunca 15.700 x g'da aşağı çevirin ve süpernatantı (sentezlenmiş ³²P-pppGpp) yeni bir vida kapağı tüpüne aktarın.
3. ³²P-pppGpp'den ³²P-ppGpp sentezlemek için, ³²p-pppGpp ürününün yarısını yeni bir vidalı kapak tüpüne aktarın ve 1 μM GppA ekleyin. Tüpü 37 °C'de 10 dakika, 95 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından 5 dakika boyunca buza yerleştirin.
4. Çökeltilmiş proteini 5 dakika boyunca 15.700 x g'da aşağı çevirin ve süpernatantı (sentezlenmiş ³²P-ppGpp) yeni bir vida kapağı tüpüne aktarın.
5. ³²P-pppGpp ve ³²P-ppGpp'yi, 1,5 M KH₂PO 4 , pH 3.4'ü mobil faz olarak kullanarak ince tabaka kromatografisi (TLC) plakasında (polietileninemiilen modifiye selüloz TLC plakaları) 1 μL çalıştırarak analiz edin.
   NOT: Kontrol olarak α-³²P etiketli guanosin 5'-trifosfat⁽³²P-α-GTP) kullanın.
6. TLC plakasını tamamen kurulayın, şeffaf bir plastik klasör arasına yerleştirin ve 5 dakika boyunca bir depolama fosfor ekranına maruz bırakın. Fosforimager kullanarak sinyalleri görselleştirin ve ölçün.
   NOT: ³²P-pppGpp ve ³²P-ppGpp oranları% 85'ten yüksek olduğunda, büyük ölçekli bir reaksiyon (500 μL, tarama için yeterli 20 96 kuyu plakası) Masa 1kullanılarak monte edilebilir ve sentezlenebilir.

4. (p)ppGpp hedef proteinlerinin DRaCALA taraması

1. 20 μL tüm hücre lysates'i çözün ve 96 kuyulu V tabanlı bir mikroter plakasına aktarın. Serratia marcescens'ten2,5 U/well endonuclease ekleyin ve lysate viskozitesini azaltmak için 15 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Lysates'i 20 dakika boyunca buza yerleştirin.
2. ³²P-pppGpp ve ³²P-ppGpp'yi 1:1 oranında karıştırın ve (p)ppGpp'nin son konsantrasyonunun 4 nM'ye eşit olmasını sağlamak için 1x lizis tampon L1 ekleyin.
   NOT: pppGpp ve ppGpp arasındaki kimyasal benzerlik göz önüne alındığında, her iki kimyasalın bir karışımı tarama işlemini basitleştirecektir.
3. (p)ppGpp karışımının 10 μL'sini hücre lisatıyla eklemek ve karıştırmak için çok kanallı pipet ve filtrelenmiş pipet uçları kullanın. Oda sıcaklığında (RT) 5 dakika kuluçkaya yaslanın.
4. 96 x pin aletini 30 s için %0,01 iyonik olmayan deterjan çözeltisine yerleştirerek yıkayın ve 30 sn boyunca bir kağıt mendil üzerinde kurulayın. Pim aletinin yıkanması 3x'i tekrarlayın.
5. Pim aletini yukarıdaki 96 kuyulu numune plakalarının içine yerleştirin ve 30 sn bekleyin. Pim aletini düz bir şekilde kaldırın ve 30 sn boyunca bir nitroselüloz zarı üzerine yerleştirin.
   NOT: Bir nokta eksikse, ilgili numunelerin 2 μL'sini pipet ve filtrelenmiş uçlarla tespit edin. Aşağıda belirtildiği gibi aynı numunenin bir kopyasının yapılması önerilir.
6. Rt'de membranı 5 dakika kurutun. Membranı şeffaf bir plastik klasör arasına yerleştirin ve 5 dakika boyunca bir depolama fosfor ekranına maruz bırakın. Fosforimager kullanarak görselleştirin.

5. Potansiyel hedef proteinlerin ölçülmesi ve tanımlanması

1. Görselleştirilmiş plakaların .gel dosyasını açmak için fosforimager ile ilişkili analiz yazılımını kullanın. 12 sütun x 8 satırlık bir kılavuz ayarlayarak 96 noktayı tanımlamak için Dizi çözümleme işlevini kullanın.
2. Tüm noktaların dış kenarını çevrelemek için büyük daireler tanımlayın (bkz. Şekil 1B). Tanımlanan büyük dairelerin Volumn+Arka Planını ve Alanını dışa aktarın ve bir elektronik tabloya kaydedin.
   NOT: Gerekirse, her bir daireyi lekelerle mükemmel bir şekilde örtüşecek şekilde yeniden konumlandırın ve her bir daireyi gerçek noktadan biraz daha büyük hale getirmek için yeniden boyutlandırın.
3. Küçük iç noktaları çevrelemek için tanımlanan daireleri küçültün. Tanımlanan küçük dairelerin Volumn+Backgroundve Area alanlarını dışarı verin ve elektronik tabloya kaydedin.
4. Şekil 1B'dekidenklemi kullanarak elektronik tablodaki bağlama kesirlerini hesaplayın ve verileri çizin. Diğer kuyuların çoğuna kıyasla yüksek bağlayıcı fraksiyonlar gösteren kuyulardaki potansiyel bağlayıcı proteinleri tanımlayın.

Şekil 2: DRaCALA tarama sürecinin genel iş akışı. Bir Escherichia coli ASKA koleksiyonundan protein üretimi indüklenir ve hücreler lysed edilir. Bu arada, rekombinant proteinler Rel_seq-His ve GppA-His saflaştırılarak ³²P-α-GTP'den ³²P etiketli pppGpp ve ppGpp sentezlemek için kullanılır. Radyoaktif olarak etiketlenmiş (p)ppGpp molekülleri daha sonra lysates ile karıştırılır ve 96 pin aracı, daha sonra bir fosfor depolama ekranına, görüntülemeye ve radyoaktif sinyallerin niceliğine maruz kalmak için karışımları nitroselüloz bir zara tespit etmek için kullanılır. Kısaltmalar: DRaCALA = Ligand Tahlilinin Diferansiyel Radyal Kılcal Hareketi; (p)ppGpp = guanosine penta ve tetrafosfatlar; RT = oda sıcaklığı; IPTG = izopropil β-d-1-tiyogalactopyranoside; GTP = guanosin 5'-trifosfat; SDS-PAGE = sodyum dodecylsulfate-poliakrilamid jel elektroforez; TLC = ince tabaka kromatografisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan protokolün ardından genellikle iki tür sonuç verecektir (Şekil 3).

Şekil 3A, kuyuların çoğundan nispeten düşük arka plan bağlama sinyallerine (bağlama fraksiyonları < 0.025) sahip bir plaka göstermektedir. Kuyu H3'ten gelen pozitif bağlama sinyali, diğer kuyular için gözlemlenenden çok daha yüksek olan ~0.35'in bağlayıcı bir kısmını verir. Niceleme olmadan bile, iyi H3 dikkat çekicidir, bu da iyi H3 ile ifade edi...

Tartışma

DRaCALA taramasının yapılmasında kritik adımlardan biri iyi tüm hücre lysates elde etmektir. İlk olarak, test edilen proteinler büyük miktarlarda ve çözünür formlarda üretilmelidir. İkincisi, hücrelerin lizisi eksiksiz olmalı ve lizat viskozitesi minimum olmalıdır. Lysozyme'ın dahil edilmesi ve üç donma-çözülme döngüsünün kullanılması genellikle hücreleri tamamen iyse etmek için yeterlidir. Bununla birlikte, serbest bırakılan kromozomal DNA lizozu viskoz yapar ve yüksek arka plan bağlama sinyali oluşturur, bu da

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
32P-&alfa;-GTP	Perkinelmer	BLU006X250UC
96 x pin aracı	V& P Scientific	VP 404	96 Cıvata Çoğaltıcı, 9 mm merkezlerde, 4,2 mm Cıvata Çapı, 24 mm uzunluğunda
96 oyuklu V-tabanlı mikrotitre plakası	Sterilin	MIC9004	Sterilin Mikroplaka V Kuyusu 611V96
Agar	OXOID - Thermo Fisher	LP0011	Agar no. 1
ASKA toplama suşu	NBRP, SHIGEN, JAPONYA		Ref: DNA Research, Cilt 12, Sayı 5, 2005, sayfa 291–299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012
Benzonaz	SIGMA	E1014-25KU,	Serratia marcescens
Bradford Protein Tahlili Boyası	Bio-Rad	5000006	Reaktif Konsantresi
DMSO	SIGMA	D8418	&ge'den genetik olarak tasarlanmış endonükleaz; %99,9
DNase 1	SIGMA	DN25-1G
jel filtrasyonu10x300 sütun	GE Healthcare	28990944	koruyucu olarak %20 etanol içerir
Analiz için Gliserol	PanReac AppliChem	122329.1214	Gliserol %87
Hiperkaset	Amersham	RPN 11647	20 x 40 cm
İmidazol	SIGMA	56750	puriss. p.a., ≥ %99,5 (GC)
IP Depolama Fosfor Ekran	FUJIFILM	28956474	BAS-MS 2040 20x 40 cm
İzopropil ve beta;-d-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG)	SIGMA	I6758	İzopropil ve beta;-D-tiyogalaktosid
Lizojen Suyu (LB)	İnvitrojen - Thermo Fisher	12795027	Miller'ın LB Et Suyu
Tabanı Lizozim	SIGMA	L4949	tavuk yumurtası beyazından; BioUltra, liyofilize toz, & %98
MgCl2 (Magnezyum klorür)	SIGMA	208337
MilliQ su			ultra saf su
çok kanallı pipet	Thermo Scientific	4661110	F1 - Klips Ucu; 1-10 ul, 8 x kanal
NaCl	VWR Kimyasalları	27810	AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30230
Nitroselüloz Kurutma Membranı	Amersham Protran	10600003	Premium 0.45 um 300 mm x 4 m
PBS	OXOID - Thermo Fisher	BR0014G	Fosfat tamponlu salin (Dulbecco A), Tabletler
PEG3350 (Polietilen glikol 3350)	SIGMA	202444
fenilmetilsülfonil florür (PMSF)	SIGMA	93482	Fenilmetansülfonil florür çözeltisi - etanol içinde 0,1 M (T)
Fosfor görüntüleyici	GE Healthcare	28955809	Typhoon FLA-7000 Fosfor görüntüleyici
Pipet Uçları, filtreli	Thermo Scientific	94410040	ClipTip 12.5 & mu; l steril olmayan
Poly-Prep Kromatografi sütunu	Bio-Rad	7311550	polipropilen kromatografi sütunu
Proteaz inhibitörü Mini	Pierce	A32955	Tabletler, EDTA içermeyen
vidalı kapaklı tüp	Thermo Scientific	3488	Mikrosantifuge Tüpleri, 2.0 ml vidalı kapaklı, steril olmayan
SLS 96 derin Kuyu plakaları	Greiner	780285	MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Alt, Doğal
döndürme sütunu	Millipore	UFC500396	Amicon Ultra -0.5 ml Santrifüj Filtreler
Thermomixer	Eppendorf	5382000015	Thermomixer C
TLC plakası (PEI-selüloz F TLC plakaları)	Merck Millipore 105579		DC PEI-selüloz F (20 x 20 cm)
Tris	SIGMA	BP152	Moleküler Biyoloji için Tris Tabanı
Tween 20	SIGMA	P1379	viskoz iyonik olmayan deterjan
ve beta;-merkaptoetanol	SIGMA	M3148	%99 (GC/titrasyon)