Gen ve Protein İfade Analizi için Murin İnterskapüler Kahverengi Yağ Dokusundan Kahverengi Adipositlerin İzolesi

Hem fareler hem de insanlar iki tür yağ dokusuna sahiptir: beyaz yağ dokusu (WAT) ve kahverengi yağ dokusu (BAT)¹. WAT enerjiyi beyaz adipositlerde trigliseritler şeklinde depolar ve BAT'ın kahverengi adipositleri (BA'lar) kimyasal enerjiyi ısı² olarak dağıtır. Gelişimsel kökenlerine bağlı olarak, BA'lar embriyo gelişimi sırasında oluşan klasik BA'lar (cBA'lar) ve beyaz adipositler türevi BA'lar (stres koşulları altında beyaz adipositlerden dönüştürülen bej / brit hücreleri) olarak kategorize ^edilir3. BA'lar multilokülerdir ve termojenik protein ayrışma proteini 1'i (UCP1)⁴ eksprese eder. İnterskapüler BAT (iBAT) deposu, küçük memelilerde birincil cBA depolarından biridir⁵, bej hücreler ise WAT⁶ içinde dağılmıştır.

Enerjiyi dağıtma doğası gereği, BA'lar obeziteyi azaltmak için terapötik bir hedef olarak çok dikkat çekmiştir⁷. Obeziteyi tedavi etmek amacıyla BA'lardan yararlanmak için, BA'ların işlevini, hayatta kalmasını ve işe alımını kontrol eden moleküler mekanizmaları anlamak önemlidir. BAT ve WAT gibi yağ dokuları heterojendir. Adipositler dışında, yağ dokuları endotel hücreleri, mezenkimal kök hücreler ve makrofajlar⁸ gibi birçok başka hücre tipi içerir. UCP1: Cre hat⁹ gibi farelerde aday genleri spesifik olarak tüketmek için genetik araçlar mevcut olsa da, BA'ları BAT veya WAT'tan arındırma teknikleri sınırlıdır ve bu da BA'ları tek hücreli tip düzeyinde incelemeyi zorlaştırmaktadır. Ek olarak, saf BA'lar elde edilmeden, BA'lar ve BA'lar olmayanlar arasındaki ilişki açıkça tanımlanmayacaktır. Örneğin, trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü alfa (PDGFRa), farklılaşmamış mezenkimal hücreler için bir belirteç olarak kullanılmıştır ve BAT'nin endotel ve interstisyel hücrelerinde eksprese edilir. Soğuk stresli BAT'ta, PDGFRα pozitif progenitör hücreler yeni BA^10'a yol açar. PDGFRa, mezenkimal hücrelerin büyümesini ve çoğalmasını düzenleyen bir büyüme faktörü olan ligand PDGF'si tarafından aktive edilir¹¹; Bununla birlikte, BA'ların PDGF'yi salgılayarak PDGFRα pozitif progenitör hücrelerin davranışını etkileyip etkilemediği açık değildir.

Son zamanlarda, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralamaya (FACS) dayanan bir BA izolasyon protokolü ^{yayınlanmıştır12}. Bu protokolde, BA'ları BA olmayanlardan ayırmak için% 3 sığır serum albümini (BSA) çözeltisi kullanıldı ve zenginleştirilmiş BA'lar FACS tarafından daha da saflaştırıldı. Bu protokolün uygulanması, hem ekipmana hem de FACS operasyon deneyimlerine dayanan FACS sürecinin gerekliliği ile sınırlıdır. Bu çalışmada, BA'ları BAT'tan izole etmek için yeni bir protokol geliştirilmiştir. Bu protokol tarafından izole edilen BA'lar doğrudan gen ve protein ekspresyon çalışmaları için kullanılabilir. Ayrıca, bu çalışmadan elde edilen veriler, BA'ların önemli bir PDGF kaynağı olduğunu göstermektedir.

Tüm fareler patojensiz koşullarda tutuldu ve tüm prosedürler Masonik Tıbbi araştırma Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. UCP1::Cre⁹ ve Rosa 26^tdDomates fareleri hatları¹³ daha önce bildirilmişti. Tüm fareler 12 saatlik bir ışık / karanlık döngüsü ile oda sıcaklığında tutuldu.

1. Solüsyonların ve kahverengi yağ dokusunun (BAT) hazırlanması

1. 15 mL santrifüj tüplerinde sindirim çözeltisi ve ayırma çözeltisi hazırlayın.
2. 10 mL BAT Sindirim çözeltisi: 10 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) için, BAT sindirim çözeltisi yapmak için 3.5 mg / mL Dispase II, 1 mg / mL Kollajenaz II ve 10 mM CaCl₂ ekleyin.
3. 10 mL% 12 iyodiksanol çözeltisi (ayırma çözeltisi): % 12 iyodiksanol elde etmek için 1 mL 10x PBS, 2 mL% 60 iyodiksanol, 0.01 mL 1 M MgCl 2, 0.025 mL 1 M KCl, 0.1 mL 0.2 M etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve 6.865 mL ddH₂O karıştırın.
4. CO₂ doz aşımı ile bir yetişkin fareyi ötenazileştirin. Kısaca, fare kafesini min/min% 10-30 kafes hacmi yer değiştirme oranında% 100 CO₂ ile doldurun. 5 dakika sonra, gözle görülür nefes alıp almadığınızı kontrol ederek ölümü onaylayın.
5. Hayvanı disseke edin ve interskapular BAT'yi toplayın. WAT ve kas katmanlarını stereo mikroskop altında çıkarın.
6. Yeterli sindirime sahip olmak için, her BAT lobunu ~ 3^mm3 parçalara bölün ve metal bir karıştırma çubuğu ve 5 mL sindirim çözeltisi ile temiz bir 50 mL şişeye yerleştirin. Sindirime başlamadan önce, BAT ve sindirim tamponu içeren şişenin 1 saat boyunca buz üzerinde oturmasına izin verin.
   NOT: Aşağıdaki adımlarda, kahverengi adiposit izolasyonu için yaklaşık 80 mg BAT kullanılmıştır.

2. BA'ların izolasyon prosedürü

1. Şişeyi bir inkübatörün içine yerleştirilmiş manyetik bir karıştırıcıya yerleştirin. Karıştırma hızını sırasıyla 60 rpm'ye ve inkübatörün sıcaklığını 35 ° C'ye ayarlayın. Sindirim yaklaşık 30 dakika sürecektir. BAT dilimleri sindirim sırasında karıştırıcı çubuğun etrafında kümeler oluşturursa, toplanan dokuları bozmak için 1 mL'lik bir pipet ucu kullanın.
2. Temiz bir 50 mL santrifüj tüpünün üzerine 70 μm'lik bir süzgeç filtresi yerleştirin. Pipet, süzgeçten yaklaşık 4 mL hücre süspansiyonu sağlar. Süzgeci 4 mL% 12 iyodiksanol çözeltisi ile yıkayın. Hücreleri ve iyodiksanol çözeltisini karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre karışımını iki berrak 5 mL polistiren test tüpüne aktarın.
   NOT: Sindirimin sonunda, sindirim çözeltisi bulanık olmalı ve yeterli sindirimi göstermelidir. Her seferinde taze sindirim çözeltisi kullanın. Hazırlandıktan sonra, sindirim çözeltisi 2 saat içinde kullanılmalıdır.
3. Sindirim yeterli değilse, adım 2.2 ve 2.3'ü bir kez daha tekrarlayın.
4. Ayırma çözeltisini ve BA'ları içeren şeffaf polistiren tüpleri 1 saat boyunca buz üzerinde bırakın. BA'lar üstte bir katman oluşturacaktır.
5. Mikroskop incelemesi için izole edilmiş BA'ların 20 μL'sini çıkarın.

3. BA'lardan RNA ve protein izolasyonu

1. BA'ları RNA ve protein izolasyonu için iki adet 1.7 mL mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. BA tabakasını bozmadan aşırı iyodiksanol çözeltisini dikkatlice çıkarın.
2. RNA, DNA ve proteini hücre çözeltisine aynı anda izole etmek için 1 mL Trizol ekleyin. Hücreleri lize etmek için yeterince karıştırın.
3. Fazları ayırmak için 200 μL Kloroform ekleyin.
4. Tüpü 4 ° C'de 10 dakika boyunca 9.981 x g santrifüj edin.
5. Santrifüjlemeden sonra, RNA izolasyonu için sulu fazı kullanın. Bu çalışmada ters transkripsiyon için total RNA kullanılmış ve Gerçek Zamanlı PCR ile kantitatif RT-PCR gerçekleştirilmiştir. Astar dizileri Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
6. Organik fazın 300 μL'sini 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
7. Organik faza, 10 s için 2.5 hacimli% 100 etanol ve vorteks ekleyin.
8. 10 s için 200 μL 1-Bromo-3-kloropropan ve vorteks ekleyin.
9. 600 μL çift damıtılmış su ve 10 sn için vorteks ekleyin.
10. Karışık çözeltinin oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.
11. 4 °C'de 10 dakika boyunca 9.981 x g'de santrifüj. Bu adımda, aşamalar ayrılacaktır. Protein fazı orta tabakada lokalizedir.
12. Üst sulu çözeltiyi çıkarın. Kalan çözeltiye 1 mL% 100 etanol ekleyin.
13. 10 dakika, 9.981 x g, 4 °C santrifüj. Santrifüjlemeden sonra, protein peleti oluşacaktır. Süper natantı atın.
14. Peleti 1 mL% 100 etanol ile yıkayın.
15. 10 dakika, 9981 x g, 4 °C santrifüj. Peleti kurtarın ve süpernatanı atın.
16. Peleti oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hava ile kurulayın.
17. Islak peletin ağırlığını ölçün. 20 μL/mg pelet oranında %1 SDS çözeltisi ekleyin.
18. Tüpü ısıtılmış bir çalkalayıcıya koyarak peleti çözün. Sıcaklığı 55 ° C'ye ve hızı 11 x g'ye ayarlayın. Protein peletinin tamamen çözülmesi genellikle 5-10 dakika sürer.
    NOT: Çözünmüş proteinin konsantrasyonu BCA testi¹⁴ ile ölçülebilir.

Kahverengi adiposit izolasyonu için interakapuler BAT'ın hazırlanması
Kahverengi adipositler (BA'lar) izolasyon süreci Şekil 1A'da gösterilmiştir. BAT ve sindirim / ayırma çözeltilerinin hazırlanmasından izole edilmiş BA'ların elde edilmesine kadar tüm süreç yaklaşık 4 saat sürecektir.

Yetişkin farelerde, interskapuler bölgede bol miktarda BAT bulunur. Bu interskapuler BAT (iBAT) kas katmanları ve WAT ile kaplıdır (Şekil 1B). Sindirim prosedürüne başlamadan önce, temiz iBAT elde etmek için kas katmanlarının ve WAT'ın çıkarılması gerekir (Şekil 1C). Yayınlanmış bir BA izolasyon protokolünde, BA'ların izolasyonu12 için kıyılmış BAT kullanılmıştır. Bu çalışmada,3 mm3 boyutunda BAT'ın sindirimi (Şekil 1D), kıyılmış BAT'den daha fazla BA vermiştir.

BA'ların BA olmayanlardan %3 BSA çözeltisi ile ayrılması
iBAT sindiriminden sonra, ayrışmış BA'lar, sindirim ürünündeki BA olmayanlarla karıştırıldı. BA'lar lipit damlacıkları içerdiğinden, yoğunlukları BA olmayanlardan daha düşüktür; Bununla birlikte, BA'ların yoğunluğu, normal bir PBS çözeltisinin tepesine verimli bir şekilde yüzmelerine izin verecek kadar düşük değildir. BA'ları BA olmayanlardanayırmak için %3 sığır serum albümini (BSA) içeren PBS kullanılmış ve bu çalışmada başarıyla tekrarlanmıştır (Şekil 2A).

Rosa 26 tdTomato, Cre-mediated rekombinasyon13'ü takiben güçlü tdDomates (tdTom) floresan proteinini ifade eden bir muhabir fare hattıdır. Ucp1::Cre transgenik fareler, BA'larda Cre rekombinazını eksprese eder9. Ucp1::Cre fare çizgisi, BA'ları tdTom ile genetik olaraketiketlemek için Rosa 26 tdTomato fareleri ile geçildi (Şekil 2B). BA'ların izolasyon prosedürünü doğrulamak için, Ucp1::Cre;tdTom/+ farelerden iBAT ayrıldı. BSA çözeltisinin üst tabakasında zenginleştirilmiş hücrelerin çoğu ahududu şeklindeydi ve çok loküler lipit damlacıkları içeriyordu. Ayrıca, bu ahududu şeklindeki hücrelerin çoğu tdTom pozitifti (Şekil 2C), kahverengi adipositler olduklarını doğruladı.

BA'ların BA olmayanlardan% 6 iyodiksanol çözeltisi ile ayrılması
%3 BSA ayırma çözeltisi zenginleştirilmiş BA'lar. Bu izole BA'ların gen ve protein ekspresyon analizi için kullanılıp kullanılamayacağı belirsizdi. RNA ve protein daha sonra zenginleştirilmiş BA'lardan ekstrakte edildi. RNA ekstraksiyonu, standart RNA izolasyon prosedürüne göre başarıyla gerçekleştirildi. Bununla birlikte, Guanidinium tiyosiyanat-fenol-kloroform yöntemi (GTPC yöntemi) olarak da bilinen standart Trizol protein izolasyon protokolü, sıkıcı ve çok düşük protein verimine sahip olan iyi çalışmadı. Bu nedenle, Trizol-lize BA'lardan protein çıkarmak için geliştirilmiş bir protein izolasyon yöntemi benimsenmiştir.

Bu geliştirilmiş GTPC protokolünde, organik faz15'ten protein çıkarmak için etanol, bromo-kloropropan ve su kullanılmıştır. Organik faza etanol, bromo-kloropropan ve su eklendikten sonra ve santrifüjlemeden sonra, sulu faz ile organik faz arasında protein peleti oluşur (Şekil 3A). Protein peleti daha sonra% 100 etanol ile yıkandı ve% 1 SDS içinde çözüldü. Bu geliştirilmiş GTPC yöntemi, iBAT ve BSA çözeltisi ile zenginleştirilmiş BA'lardan protein çıkarmak için kullanıldı. BAT protein peleti% 1 SDS'de kolayca çözünmesine rağmen, izole edilmiş BA protein peletinin büyük bir kısmı çözünmezdi. Daha sonra çözünmüş protein SDS-PAGE jeli ile incelendi. Bir Coomassie mavisi lekeli SDS-PAGE jelinde (Şekil 3B) gösterildiği gibi, izole edilmiş BA'larda 60 kDa civarında büyük bir protein bandı mevcuttu, ancak BAT örneklerinde mevcut değildi. BSA'nın moleküler ağırlığı 66 kDa olduğundan ve BA'ların ayırma çözeltisinde bol miktarda BSA bulunduğundan, bu baskın protein bandı BSA olmalıdır. Bu veriler, BA'ların ayırma çözeltisinden BSA'nın protein ekstraksiyonuna müdahale ettiğini göstermektedir.

İyodiksanol, hücre17 ve adeno ilişkili virüs (AAV) saflaştırması18 için yaygın olarak kullanılan noniyonik ve izo-ozmotik gradyan bir ortam16'dır. Protein ekspresyon çalışmalarının BSA girişimini önlemek için, yeni bir BA ayırma çözeltisinde BSA'nın yerini almak için iyodiksanol kullanılmıştır. % 3 BSA çözeltisi,% 6 iyodiksanole benzer olan 1.03'lük bir yoğunluğa sahiptir. % 6 iyodiksanol çözeltisinde, BA'lar 30-60 dakika içinde tepeye doğru yüzdü (Şekil 3C). Bu çözelti ile izole edilen BA'lar tipik ahududu şekli gösterdi ve multiloküler lipid damlacıkları içeriyordu (Şekil 3D). Bu izole BA'lardan ekstrakte edilen proteinler SDS-PAGE jelinde güzel bir şekilde ayrıldı (Şekil 3E).

% 6'lık iyotiksanol çözeltisinin BA'ları BA olmayanlardan verimli bir şekilde ayırıp ayırmadığını doğrulamak için, BA'ları genetik olarak tdTom ile etiketledik ve% 6'lık berrak iyodiksanol çözeltisinde bulunan hücreleri inceledik. BA'ları BA olmayanlardan ayırdıktan sonra (adım 2.4), BA tabakasının altındaki %6'lık iyotiksanol çözeltisi PBS ile 6 kez seyreltildi ve daha sonra 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj edildi. Santrifüjlemeden sonra, altta stromal vasküler fraksiyon hücreleri olabilecek küçük bir kırmızı hücre peleti oluşturuldu. Şekil 3'te gösterildiği gibi, BA'lar katmanındaki hücreler tdTom pozitif hücrelerdi (Şekil 3F); ancak peletten elde edilen hücreler tdTom negatifti (Şekil 3G). Ek olarak, tdTom negatif hücrelerinde belirgin bir lipit damlacığı görülmedi. Bu veriler, yeni protokolümüzün BA'ları yağ olmayan hücrelerden verimli bir şekilde ayırabileceğini göstermektedir.

Birlikte, bu veriler BA'ların% 3 BSA çözeltisi ile izole edilmesinin, takip eden biyokimya çalışmalarına müdahale ettiğini ve% 6 iyodiksanol çözeltisinin, BA'ları izole etmek için% 3 BSA çözeltisinden daha iyi olduğunu göstermektedir.

İzole BA'larla gen ve protein ekspresyon analizi.
Bu yeni BA izolasyon prosedürünü moleküler düzeyde doğrulamak için, BAT ve izole BA'lar arasında üç genin ekspresyonu karşılaştırıldı: Ucp1, Pdgfa ve Pdgfra. BAT'de, Pdgfra endotel hücrelerinde ve interstisyel hücrelerde eksprese edilir ve PDGFRa pozitif hücreler varsayılan progenitör hücrelerdir10. Ucp1 ve Pdgfa'nın mRNA düzeyleri, izole BA'larda BAT'a göre anlamlı derecede yüksekti (Şekil 4A, B). Aksine, Pdgfra'nın mRNA'sı sadece BAT'ta tespit edildi (Şekil 4B).

PPARγ, yağ dokusu gelişimini kontrol eden bir transkripsiyonel faktördür, UCP1 bir mitokondri proteinidir ve PDGFRα bir membran reseptör proteinidir. Bu üç protein, farklı hücresel bölmelerde dağılmış proteinleri temsil eder. Trizol-lize BA'lardan ve BAT'tan ekstrakte edilen proteinin protein ekspresyon analizi için uygun olup olmadığını test etmek için Western lekeleri yapıldı. UCP1 ve PPARγ hem BA'larda hem de BAT'ta tespit edildi (Şekil 4C, D), Trizol-lize BA'lardan veya BAT'tan izole edilen toplam proteinin batı lekesi için uygun olduğunu doğruladı. Ayrıca, qRT-PCR sonuçlarıyla tutarlı olarak, UCP1 proteini BA'larda zenginleştirilmiştir (Şekil 4C); PDGFRα ise sadece BAT'ta saptandı, ancak saf BA'larda tespit edilmedi (Şekil 4D). Özetle, bu veriler yeni BA izolasyon yöntemimizin etkili olduğunu göstermekte ve bu yöntemle zenginleştirilmiş BA'ların gen ve protein ekspresyon çalışmaları için doğrudan kullanılabileceğini göstermektedir.

Şekil 1: Kahverengi adiposit izolasyonu için iBAT'ın hazırlanması. (A) Kahverengi adiposit izolasyon prosedürünün iş akışı. (B) BAT, WAT ve kas tabakalarını içeren interskapuler dokunun ventral görünümü. (C) İnterskopüler BAT (iBAT). iBAT'a bitişik kas tabakaları ve WAT çıkarıldı. (D) Kahverengi adiposit izolasyonu için kullanılan iBAT parçalarının temsili bir görüntüsü. B-D, Ölçek çubuğu = 5 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Kahverengi adipositlerin sindirim çözeltisinden ayrılması. (A) Ayrışmış kahverengi adipositlerin ayrılmadan önce ve sonra görüntüleri. Kahverengi adipositleri kahverengi olmayan adipositlerden ayırmak için% 3 BSA çözeltisi kullanıldı. Ölçek çubuğu = 1 cm. (B) Kahverengi adipositlerin tdDomates floresan proteini ile etiketlenmesinin şematik görünümü. (C) İzole kahverengi adipositlerin görüntüleri. DIC, diferansiyel girişim kontrastı. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Lize kahverengi adipositlerden toplam proteinin ekstraksiyonu . (A) Protein fazının organik fazdan ayrılması. (B) SDS-PAGE jelinin Coomassie boyaması. Toplam protein, BAT veya% 3 BSA çözeltisi saflaştırılmış kahverengi adipositlerden ekstrakte edildi. BSA protein bandı bir okla gösterildi. (C) %6 iyodiksanol çözeltisi üzerine oluşan kahverengi adiposit tabakası. Ölçek çubuğu = 1 cm. (D) %6 iyodiksanol çözeltisi ile izole edilmiş kahverengi adipositler. Kahverengi adipositler sarı oklarla belirtildi. Ölçek çubuğu = 50 μm. (E) SDS-PAGE jelinin Coomassie boyaması. Toplam protein, BAT veya% 6 iyodiksanol çözeltisi ile zenginleştirilmiş BA'lardan ekstrakte edildi. (F) Kahverengi adipositler etiketli tdTom görüntüleri. (G) BA tabakasının altındaki iyodiksanol çözeltisinden elde edilen hücrelerin görüntüleri. F ve G, ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: İzole kahverengi adipositlerin gen ve protein ekspresyon analizi. Bu gen ve protein ekspresyon çalışmalarında iyodiksanol yöntemi ile izole edilen kahverengi adipositler kullanılmıştır. (A,B) gen ekspresyonunun qRT-PCR ölçümü. mRNA seviyeleri 36B4'e normalleştirildi. N=3. Öğrenci t testi, *, P<0.01; **, P<0.01. (C) PPARγ ve UCP1'in batıda lekelenmesi. (D) PDGFRa'nın batı lekelenmesi. Yükleme kontrolü olarak C ve D, Ponceau S-boyalı membran kullanıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Hiç kimse