Bu çalışmada, gen ve protein ekspresyon analizi için murin kahverengi adipositlerin izole edilmesinde yeni bir yöntem açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Gen ve Protein İfade Analizi için Murin İnterskapüler Kahverengi Yağ Dokusundan Kahverengi Adipositlerin İzolesi
Bu makalede
Özet
Özet
Kahverengi yağ dokusu (BAT) memelilerde titremeyen termojenezden sorumludur ve kahverengi adipositler (BA'lar) BAT'ın fonksiyonel birimleridir. BA'lar hem multiloküler lipid damlacıkları hem de bol miktarda mitokondri içerir ve ayrışma proteini 1'i (UCP1) eksprese ederler. BA'lar, kökenlerine göre iki alt tipe ayrılır: embriyo kaynaklı klasik BA'lar (cBA'lar) ve beyaz adipositlerden türetilmiş BA'lar. Nispeten düşük yoğunlukları nedeniyle, BA'lar geleneksel santrifüjleme yöntemiyle BAT'tan izole edilemez. Bu çalışmada, gen ve protein ekspresyon analizi için BA'ları farelerden izole etmek için yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Bu protokolde, yetişkin farelerden interskapuler BAT, Kollajenaz ve Dispase çözeltisi ile sindirildi ve ayrışmış BA'lar% 6 iyodiksanol çözeltisi ile zenginleştirildi. İzole BA'lar daha sonra RNA, DNA ve proteinin eşzamanlı izolasyonu için Trizol reaktifi ile lize edildi. RNA izolasyonundan sonra, lizatın organik fazı protein ekstraksiyonu için kullanıldı. Verilerimiz,% 6'lık iyotiksanol çözeltisinin, takip geni ve protein ekspresyon çalışmalarına müdahale etmeden BA'ları verimli bir şekilde zenginleştirdiğini göstermiştir. Trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF), mezenkimal hücrelerin büyümesini ve çoğalmasını düzenleyen bir büyüme faktörüdür. Kahverengi yağ dokusu ile karşılaştırıldığında, izole BA'lar Pdgfa'nın anlamlı derecede daha yüksek ekspresyonuna sahipti. Özetle, bu yeni yöntem, kahverengi adipositlerin biyolojisini tek bir hücre tipi seviyesinde incelemek için bir platform sağlar.
Giriş
Hem fareler hem de insanlar iki tür yağ dokusuna sahiptir: beyaz yağ dokusu (WAT) ve kahverengi yağ dokusu (BAT)1. WAT enerjiyi beyaz adipositlerde trigliseritler şeklinde depolar ve BAT'ın kahverengi adipositleri (BA'lar) kimyasal enerjiyi ısı2 olarak dağıtır. Gelişimsel kökenlerine bağlı olarak, BA'lar embriyo gelişimi sırasında oluşan klasik BA'lar (cBA'lar) ve beyaz adipositler türevi BA'lar (stres koşulları altında beyaz adipositlerden dönüştürülen bej / brit hücreleri) olarak kategorize edilir3. BA'lar multilokülerdir ve termojenik protein ayrışma proteini 1'i (UCP1)4....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm fareler patojensiz koşullarda tutuldu ve tüm prosedürler Masonik Tıbbi araştırma Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. UCP1::Cre9 ve Rosa 26tdDomates fareleri hatları13 daha önce bildirilmişti. Tüm fareler 12 saatlik bir ışık / karanlık döngüsü ile oda sıcaklığında tutuldu.
1. Solüsyonların ve kahverengi yağ dokusunun (BAT) hazırlanması
- 15 mL santrifüj tüplerinde sindirim çözeltisi ve ayırma çözeltisi hazırlayın.
- 10 mL BAT Sindirim çözeltisi: 10 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) için, BAT sindirim çözeltisi yapmak için....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kahverengi adiposit izolasyonu için interakapuler BAT'ın hazırlanması
Kahverengi adipositler (BA'lar) izolasyon süreci Şekil 1A'da gösterilmiştir. BAT ve sindirim / ayırma çözeltilerinin hazırlanmasından izole edilmiş BA'ların elde edilmesine kadar tüm süreç yaklaşık 4 saat sürecektir.
Yetişkin farelerde, interskapuler bölgede bol miktarda BAT bulunur. Bu interskapuler BAT (iBAT) kas katmanları ve WAT ile kaplıdır (Şekil 1B.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışmada, gen ve protein ekspresyon analizi için BA'ları izole etmek için yeni bir yöntem geliştirilmiştir.
Yayınlanmış bir BA izolasyon protokolünde, BA'ları zenginleştirmek için% 3 BSA çözeltisi kullanılmıştır12. Bununla birlikte, bu yayınlanmış protokol ile elde edilen zenginleştirilmiş BA'lar, protein ekspresyon analizi için doğrudan kullanılamamıştır. Bunun nedeni, BA çözeltisinde bulunan konsantre BSA'nın, takip eden protein ekstraksiyonuna müdahale etmesidir........
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Teşekkürler
Z. Lin, Ulusal Sağlık Enstitüleri HL138454-01 ve Masonik Tıbbi Araştırma Enstitüsü fonları tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Antikorlar< / güçlü > | |||
| < güçlü >Antijen< / güçlü > | < güçlü > Şirket< / güçlü > | < güçlü > Katalog< > | |
| PPAR ve gama; | LSBio | Ls-C368478 | |
| PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
| UCP1 | Ar-Ge D sistemi | IC6158P | |
| Kimyasal ve çözeltiler | |||
| Kollajenaz, Tip II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| 1-Bromo-3-kloropropan | Sigma-Aldrich | B62404 | |
| Sığır Serumu Albümini (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
| Kalsiyum klorür | Bio Basic | CT1330 | |
| Kloroform | IBI Bilimsel | IB05040 | |
| Dispas II, proteaz | Sigma-Aldrich | D5693 | |
| EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
| Etanol | IBI Bilimsel | IB15724 | |
| LiQuant Evrensel Yeşil qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
| Magnezyum Klorür Hekzahidrat | Boston BioProducts | P-855 | |
| OneScrip Plus cDNA Sentezi SuperMix | ABM | G454 | |
| OptiPrep (İodiksanol) | Cosmo Bio Türkiye | AXS-1114542 | |
| PBS (10x) | Keson Laboratuvarları | PBL07 | |
| PBS (1x) | Keson Laboratuvarları | PBL06 | |
| Pierce BCA Protein Test Kiti | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Potasyum Klorür | Boston BioProducts | P-1435 | |
| SimplyBlue güvenli Leke | Invitrogen | LC6060 | |
| Sodyum dodesil sülfat (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Trizol reaktifi | Yaşam teknolojileri | 15596018 | |
| Primers | |||
| Gen adı (Tür) | İleri | Geri Pdgfra | |
| (Fare) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
| Pdgfa (Fare) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
| 36B4(Fare) | TGCTGAACATCCCCCTTCTC | TCTCCACACACAATGCCAGGAC | |
| Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
| güçlü > Ekipman< / güçlü > | |||
| < güçlü > Adı< / güçlü > | < güçlü > Şirket< / güçlü > | < güçlü > Uygulama< / güçlü > | |
| Anahtar BZ-X700 | Keyence | Görüntüleme kahverengi adipositler | |
| Manyetik karıştırıcı | VWR | Ayrışması BAT | |
| QuantStudio 6 Flex Gerçek Zamanlı PCR Sistemi | Uygulandı Biyosistem | Kantitatif PCR | |
| Odyssey Fc Görüntüleme sistemi | LI-COR | Western blot görüntüleme |
Kaynaklar
- Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
- Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, Cairo. 305763(2013)....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
