Yöntem makalesi

Ekstrakorporeal Şok Dalgası Tedavisinin İndüklenen Yumuşak Doku Rejenerasyonunun Standardize Bir Murin Modeli

897 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/62338

⸱

28 Haziran 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department for Cardiac Surgery, Innsbruck Medical University, 2Institute of Clinical and Functional Anatomy, Innsbruck Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu makale, şok dalgası tedavisi yoluyla doku rejenerasyonunun standartlaştırılmış bir murin modelini açıklamaktadır.

Özet

Shockwave tedavisi (SWT) birkaç farklı dokuda umut verici rejeneratif etkiler gösterir. Bununla birlikte, altta yatan moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Yeni kan damarı oluşumu süreci olan anjiyogenez, SWT'nin yakın zamanda keşfedilen bir etkisinin yanı sıra daha yumuşak dokularda rejenerasyonun önde gelen bir itici gücüdür. SWT'nin mekanik uyaranının anjiyogenez ve rejenerasyonu nasıl indüklediği ve hangi yolakların dahil olduğu tam olarak anlaşılamamıştır. SWT'nin klinik kullanımını daha da geliştirmek ve mekanik stimülasyonun doku ve doku rejenerasyonunu nasıl etkileyebileceği hakkında değerli bilgiler edinmek için standart bir SWT modeline ihtiyaç vardır. Bu vesileyle, arka bacak iskemi modelini kullanarak, şok dalgası tedavisine bağlı rejenerasyonun standartlaştırılmış, uygulaması kolay bir murin modelini açıklıyoruz.

Giriş

Shockwave tedavisi (SWT) klinik pratikte ilk olarak ekstrakorporeal uygulama ile böbrek taşlarını parçalamanın bir yolu olarak tanıtılmıştır. 1990'larda, tekrarlanan litotripsiyi takiben X-ışını kayıtlarında iliak kret kalınlaşmasının tesadüfi bir bulgusu, SWT1'in kemik morfojenik etkisini ortaya çıkardı. Bu, ortopedik kullanımda yeni uygulamaların artmasına neden oldu. SWT, böylece uzun kemik kaynamamaları, lateral epikondilit ve aşil tendiniti 2,3,4,5 için kabul edilen bir tedavi seçeneği haline geldi. Son kanıtlar şimdi tekrar aparey spektrumunu ortopedinin ötesine, daha yumuşak dokulara ve yara iyileşme bozukluklarına genişletiyor 6,7. Burada çalışmalar, örneğin inme sonrası erektil disfonksiyon veya spastisite dahil olmak üzere heterojen bir koşul meclisinde SWT'nin etkinliğini gösterebilir 8,9,10.

Bununla birlikte, SWT'nin altında yatan moleküler mekanizmalar hala tam olarak anlaşılamamıştır ve daha fazla araştırma gerektirmektedir. Kardiyovasküler hastalığa odaklanan önceki çalışmamız, miyokard enfarktüsünün murin modelinde SWT'nin umut verici bir etkisini göstermektedir. Böylece, SWT11'i takiben miyokardiyal rejenerasyonun temel bir itici gücü olarak anjiyogenez keşfedildi.

Anjiyogenez, önceden var olan damarların filizlenmesi ve bölünmesi yoluyla yeni damarların gelişimini tanımlar. Yaralanma durumunda, bu yeni damarlar hasarlı bölgeye kan akışının yeniden sağlanmasını ve böylece rejenerasyonu kolaylaştırır12.

Bu nedenle anjiyogenez, doku rejenerasyonunun ayırt edici bir özelliğini ve daha yumuşak dokulardaki SWT etkileri için potansiyel bir açıklamayı temsil eder. Bununla birlikte, rejenerasyon, çok sayıda indüktör ve efektör mekanizmasına sahip karmaşık bir süreçtir. Bunları izole edilmiş bir hücre kültürü ortamında araştırma olasılığı olsa da, hayvan modelleri bu karmaşık süreçleri taklit etmek için en uygun olanlardır. Arka ekstremite iskemisi, in vivo13 anjiyogenez ve rejenerasyonu araştırmak için iyi bilinen bir modeldir. SWT'nin rejeneratif etkisinin daha fazla araştırılmasını desteklemek için, burada arka ekstremite iskemisinde SWT'nin uygulanabilir, standartlaştırılmış, murin bir modelini sunuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Deneyler, Innsbruck Tıp Üniversitesi'ndeki kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi ve Avusturya bilim bakanlığı tarafından onaylandı (BMWF-66.011/0110-V/3b/2019).

1. Anestezi indüksiyonu ve operasyonel kurulum

  1. Hayvan prosedürleri için uygun bir ortam hazırlayın: ekipmanı sterilize edin, yüzeyleri dezenfekte edin, tek kullanımlık maskeler, izolasyon önlükleri ve eldivenler kullanın.
  2. 18-12 haftalık bir fareyi (deney ortamına bağlı olarak suş ve cinsiyet)% 4'te bir izofluran buharlaştırıcıya bağlı bir odada sakinleştirin.
  3. Derin ağrı tanıma göstergesi olarak pedal veya kulak kepçesi refleksi ile yeterli sedasyonu kontrol edin.
  4. Hayvan yeterince sedasyona maruz kaldığında, izofluran akışını kapatın ve onaylanmış hayvan bakımı ve kullanım protokolüne göre analjezi ve anestezikler uygulayın, örneğin anestezik olarak ketamin hidroklorür (80 mg / kg vücut ağırlığı) ve ksilazin hidroklorür (5 mg / kg vücut ağırlığı) intra-peritoneal olarak analjetik olarak.
    NOT: Hayvanı anestezi odasına yerleştirmeden önce intraperitoneal ilaçla şırınga hazırlayın.
  5. Enjeksiyondan 5 dakika sonra pedal çekme refleksini değerlendirerek anestezi derinliğini inceleyin.
  6. Kornea hasarını önlemek için göz merhemi (ör., 0,5 g Retinolpalmitat) uygulayın.
  7. Cerrahi alanın içindeki ve yakınındaki, özellikle sol arka bacak ve kasıktaki tüyleri alın. Cilt yaralanmasını önlemek için jilet veya düzeltici yerine tüy dökücü krem kullanılabilir.
  8. Hayvanı, yapışkan bant kullanarak bir ısıtma plakası üzerine uzatılmış uzuvlarla sırtüstü pozisyonda sabitleyin.
  9. Ameliyat bölgesini %10 povidon-iyot veya benzeri dezenfektan ile dezenfekte edin ve temizleyin. Steril saha örtüsü kullanın.

2. Prosedür

  1. Ameliyatı gerçekleştirmek için 10x ile 20x büyütme arasında bir mikroskop kullanın.
  2. Cerrahi makas kullanarak diz ekleminin proksimalinde bir cilt kesisi (~ 1,5 cm) yapın.
  3. Künt forseps kullanarak cildi alttaki dokudan nazikçe ayırın.
  4. Femoral damarları tanımlayın. Forseps ve makas kullanarak arter, ven ve siniri dikkatlice ayırın.
  5. Proksimal olarak kasık ligamenti seviyesinden başlayarak, arter en iyi şekilde görüntülenene kadar çevredeki bağ dokusunu dikkatlice çıkarın. Distal son nokta olarak, safen ve popliteal artere arteriyel dallanma görünür olmalıdır.
  6. Proksimal femoral arteri inguinal ligament seviyesinde 7-0 polipropilen sütür kullanarak bağlayın.
  7. Femoral arterin distal ucunu 7-0 polipropilen sütür kullanarak safen ve popliteal artere dallanmaya kadar oklüte edin.
  8. Diyatermiyi kullanarak distal ve proksimal düğümler arasındaki femoral arter segmentini çıkarın.
    NOT: Femoral arterin cerrahi makasla kesilerek çıkarılması da mümkündür. Bununla birlikte, bir diyatermi kullanmak, düğümlerin başarısız olması durumunda dikişe ek olarak damarı tıkar.
  9. Femoral arterin güvenli bir şekilde tıkandığından ve ameliyat alanında herhangi bir kanama görünmediğinden emin olun.
    NOT: SWT uygulaması sırasında yaranın ultrasonik jel dekontaminasyonunu önlemek için cilt dikişleri arasında dar mesafe bırakılması önerilir.
  10. Tek düğümlü 5-0 emilmeyen naylon dikişler kullanılarak cilt kesisini dikin.
  11. Cerrahi bölgeyi pamuklu çubuklarla dezenfekte edin.

3. Shockwave terapi uygulaması

  1. Cilt kesisinin tamamen kapalı olduğundan emin olun.
  2. Shockwave cihazında tedavi parametrelerini tanımlayın. Bu deney ortamında, toplam 300 impuls için 3 Hz frekansta 0.1 mJ/mm2'lik bir enerji akısı yoğunluğu kullanıldı.
    NOT: Enerji seviyeleri, odaklanmış ekstrakorporeal şok dalgası tedavisi kullanılarak önceki sonuçlardan14 alınmıştır.
  3. Uygun bağlantı için iç uyluktaki tedavi alanına ultrasonik jel uygulayın.
  4. Jelin içinde hava kabarcığı sıkışmadığından emin olun.
    NOT: Yeterli SWT uygulaması için yeterli jel ile uygun bağlantı şarttır. Jel içindeki küçük hava kabarcıkları şok dalgalarını emecek ve etkilerini azaltacaktır.
  5. Aplikatörü uyluk üzerinde yavaşça hareket ettirirken ayak pedalını değiştirerek 300 darbe uygulayın.
    NOT: SWT ameliyattan hemen sonra uygulanmazsa, tedaviden önce çıkarılarak yeniden büyüyen tüyler nedeniyle olası şok dalgası enerji emiliminden kaçının.
  6. Tedaviden sonra, uyluğun soğumasını önlemek için kalan ultrasonik jeli silin.
  7. Hipotermiyi önlemek için hayvanı bir ısıtma lambasına maruz kalan bir kurtarma kafesine taşıyın.
  8. Uyanana kadar hayvanı dikkatlice izleyin ve yeterli analjezi için deri altına 0.05 mg / kg vücut ağırlığı dozunda buprenorfin uygulayın.
  9. Cerrahi insizyon tamamen iyileşene kadar hayvanların sağlığını ve refahını günlük olarak izleyin.
    NOT: Tedavi bir seans ile sınırlı olabileceği gibi birden çok kez tekrarlanabilir. Bu örnekte tek bir uygulama gerçekleştirilmiştir.

4. Kan akışı ölçümü

  1. Ameliyattan hemen sonra ve deney ayarına bağlı olarak daha sonra çeşitli zaman noktalarında kan akışı ölçümü yapın.
  2. Hayvanı% 4'te bir izofluran buharlaştırıcıya bağlı bir odada sakinleştirin.
  3. Hayvan sakinleştirildiğinde, izofluran akışını kapatın ve anestezikler ve analjezikler uygulayın. Onaylanmış hayvan bakımı ve kullanım protokolüne göre, ketamin hidroklorür (80 mg / kg vücut ağırlığı) ve ksilazin hidroklorür (5 mg / kg vücut ağırlığı) intraperitoneal olarak uygulayın.
  4. Enjeksiyondan 5 dakika sonra pedal çekme refleksini değerlendirerek anestezi derinliğini inceleyin.
  5. Kornea hasarını önlemek için göz merhemi (ör., 0,5 g Retinolpalmitat) kullanın.
  6. Hayvanı, yapışkan bant kullanarak bir ısıtma plakası üzerine uzatılmış uzuvlarla sırtüstü pozisyonda sabitleyin.
  7. Her iki arka bacaktaki tüyleri titizlikle alın.
  8. Üreticinin talimatına göre lazer doppler ile uzuv perfüzyonunu ölçün.
    NOT: İskemik uzuv ile iskemik olmayan uzuv kan akışının oranı ana parametre olarak kullanılmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokol kullanılarak, SWT müdahalesinden sonra arka ekstremite perfüzyonunda önemli farklılıklar gözlenebilir ve izlenebilir. Temsili görüntüler, SWT ile tedavi edilen uzuvlarda (Şekil 1B) tedavi edilmeyen kontrol uzuvlarına (Şekil 1A) kıyasla belirgin bir fark göstermektedir. Burada perfüzyon, düşük perfüzyonu temsil eden soğuk renkler ve yüksek perfüzyonu temsil eden sıcak renkler ile termal parlama yoluyla tasvir edilir. ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Shockwave tedavisi, çeşitli yumuşak doku rejenerasyon ortamlarında umut verici sonuçlar göstermektedir. Bununla birlikte, bu rejeneratif yetenekleri daha da artırmak, iyileştirmek veya izole etmek için, öncelikle SWT kaynaklı rejenerasyonun temelleri moleküler düzeyde ortaya çıkarılmalıdır. Doku rejenerasyonu karmaşıktır ve doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık, inflamasyon, hücre döngüsü ilerlemesi, apoptoz, hücresel farklılaşma, anjiyogenez ve diğerleri dahil olmak üzere birçok biyolo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Holfeld J. ve Grimm M., kardiyak şok dalgası tedavisini (www.heart-regeneration.com) teşvik etmeyi amaçlayan bir Innsbruck Tıp Üniversitesi yan kuruluşu olan Heart Regeneration Technologies GmbH'nin hissedarlarıdır. Diğer tüm yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, JH ve CGT'ye sınırsız bir AUVA araştırma hibesi ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 10 Povidone
5-0 Naylon sütürEthicon Inc.
7-0 ipek sütürEthicon Inc.
CauteryMartinME-102
tüy dökücü kremNivea
Gazlı BezGazin
Isıtma Plakası
Ketamin hidroklorüranestezi
Lazer DopplerMoor aletleri
Cerrahi Aletlerİnce Bilim Araçları
Ksilazin hidroklorüranestezisi

Kaynaklar

  1. Schaden, W., et al. Extracorporeal shockwave therapy (ESWT) - First choice treatment of fracture non-unions. International Journal of Surgery. 24, 179-183 (2015).
  2. Xu, Z. H., et al. Extracorporeal shock wave treatment in nonunions of long bone fractures. International Orthopaedics. 33, 789-793 (2009).
  3. Melegati, G., Tornese, D., Bandi, M., Rubini, M. Comparison of two ultrasonographic localization techniques for the treatment of lateral epicondylitis with extracorporeal shock wave therapy: A randomized study. Clinical Rehabilitation. 18, 366-370 (2004).
  4. Zhang, S., Li, H., Yao, W., Hua, Y., Li, Y. Therapeutic response of extracorporeal shock wave therapy for insertional achilles tendinopathy between sports-active and nonsports-active patients with 5-year follow-up. Orthopedic Journal of Sport Medicine. 8, 1-6 (2020).
  5. Dedes, V., et al. Effectiveness and safety of shockwave therapy in tendinopathies. Materia Socio Medica. 30, 141(2018).
  6. Surace, S. J., Deitch, J., Johnston, R. V., Shock Buchbinder, R. wave therapy for rotator cuff disease with or without calcification. Cochrane Database of Systematic Reviews. 3 (3), 008962(2020).
  7. Mittermayr, R., et al. Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) for wound healing: Technology, mechanisms, and clinical efficacy. Wound Repair Regeneration. 20, 456-465 (2012).
  8. Fode, M., Hatzichristodoulou, G., Serefoglu, E. C., Verze, P., Albersen, M. Low-intensity shockwave therapy for erectile dysfunction: Is the evidence strong enough. Nature Reviews Urology. 14, 593-606 (2017).
  9. Guo, P., et al. Positive effects of extracorporeal shock wave therapy on spasticity in poststroke patients: a meta-analysis. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 26 (11), 2470-2476 (2017).
  10. Vardi, Y., Appel, B., Jacob, G., Massarwi, O., Gruenwald, I. Can low-intensity extracorporeal shockwave therapy improve erectile function? A 6-month follow-up pilot study in patients with organic erectile dysfunction. European Urology. 58, 243-248 (2010).
  11. Gollmann-Tepeköylü, C., et al. miR-19a-3p containing exosomes improve function of ischaemic myocardium upon shock wave therapy. Cardiovascular Research. 116 (6), 1226-1236 (2019).
  12. Otrock, Z. K., Mahfouz, R. A. R., Makarem, J. A., Shamseddine, A. I. Understanding the biology of angiogenesis: Review of the most important molecular mechanisms. Blood Cells, Molecules and Diseases. 39, 212-220 (2007).
  13. Ahn, H., et al. A murine model of hind limb ischemia to study angiogenesis and arteriogenesis. Physiology and Behavior. 176, 139-148 (2017).
  14. Pölzl, L., et al. Defining a therapeutic range for regeneration of ischemic myocardium via shock waves. Science Reports. , 409(2021).
  15. Holfeld, J., et al. Low energy shock wave therapy induces angiogenesis in acute hind-limb ischemia via VEGF receptor 2 phosphorylation. PLoS One. 9, 1-7 (2014).
  16. Theurl, M., et al. The neuropeptide catestatin acts as a novel angiogenic cytokine via a basic fibroblast growth factor-dependent mechanism. Circulation Research. 107 (11), 1326-1335 (2010).
  17. Noonan, D. M., De Lerma Barbaro, A., Vannini, N., Mortara, L., Albini, A. Inflammation, inflammatory cells and angiogenesis: Decisions and indecisions. Cancer Metastasis Reviews. 27, 31-40 (2008).
  18. Aurora, A. B., Olson, E. N. Immune modulation of stem cells and regeneration. Cell Stem Cell. 15, 14-25 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

AnjiyogenezMekanik Stim lasyonArka Ekstremite skemisiRejeneratif T pKan Damar Olu umu
Video yakında

İlgili makaleler