Makale, mikroakışkanları dildeki bir intravital görüntüleme penceresine entegre ederek fonksiyonel tat hücresi görüntüleme in vivo için μTongue (dil üzerinde mikroakışkanlar) cihazını tanıtmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
μTongue: Dil In Vivo için Mikroakışkan tabanlı fonksiyonel görüntüleme platformu
Bu makalede
Özet
Özet
İntravital floresan mikroskopi, canlı bir hayvanda çok hücreli dinamikleri incelemek için yaygın olarak kullanılan bir araçtır. Ancak tat duyusal organda başarıyla kullanılmamıştır. μTongue, mikroakışkanları intravital dil görüntüleme penceresine entegre ederek, birden fazla şok tabancasına kontrollü maruz kalma altında vivo tat hücrelerinin güvenilir fonksiyonel görüntülerini sağlar. Bu yazıda, μTongue sistemini kullanmak için ayrıntılı bir adım adım prosedür sunulmuştur. Beş alt kategori vardır: lezzetli çözümlerin hazırlanması, mikroakışkan bir modülün kurulması, numune montajı, işlevsel görüntü verilerinin alınması ve veri analizi. μTongue kullanırken ortaya çıkabilecek pratik sorunları çözmek için bazı ipuçları ve teknikler de sunulmaktadır.
Giriş
Intravital floresan mikroskop, canlı dokular üzerindeki mekansal dinamikleri incelemek için yaygın olarak kullanılır. Araştırmacılar, biyolojik süreçlerin floresan sinyallerine belirli ve hassas dönüşümlerini sağlayan genetik olarak kodlanmış sensörler geliştiriyorlar - bu sensörler yaygın olarak bulunan floresan mikroskoplar kullanılarak kolayca kaydedilebilir1,2. Kemirgenlerdeki çoğu iç organ mikroskop kullanılarak araştırılmış olsa da, dile başarılı uygulaması henüz başarılı olmamıştır3.
Tat hücrelerinin kalsiyum görüntülemesi üzerine daha önceki çalış....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm cerrahi prosedürler Sungkyunkwan Üniversitesi ve Seul Ulusal Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.
1. Çözümlerin hazırlanması: yapay tükürük ve şok tabancaları
- 2 mM NaCl, 5 mM KCl çözünerek yapay tükürük hazırlayın, 3 mM NaHCO3,3 mM KHCO3,0,25 mM CaCl2,0,25 mM MgCl2,0,12 mM K2HPO4, damıtılmış suda 0,12 mM KH2PO4ve 1,8 mM HCl (>1 L) ve çözeltinin pH'ını 7 olarak ayarlayın(bkz. Malzeme Tablosu )12.
- Ekşi: 10 mM sitrik asit gibi uyarıcılar hazırla....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Pirt-GCaMP6f-tdTomato faresi tat alma tokası görüntüsü elde etmek için kullanıldı. Fare dilinin yüzeyi otofluoresan filiform papilla ile kaplıydı. Tat tomurcukları dilin yüzeyine seyrek olarak yayılır (Şekil 4A). Tat alma tomurcukunun ve yapısının görüntüleri üç farklı filtre dedektörü kullanılarak elde edildi. 607/70 nm filtre seti kullanılarak, oranmetrik analiz için tat hücrelerinden tdTomato sinyali elde edildi (Şekil 4B). 525/50 nm filtre seti kullanılarak,.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada açıklanan, vivo tat hücrelerinin fonksiyonel faaliyetlerinin araştırılmasına μTongue uygulamak için ayrıntılı bir protokoldür. Bu protokolde genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri kullanılarak tat hücreleri üzerinde fonksiyonel görüntüleme yapılmaktadır. Transgenik farelerin kullanımına ek olarak, kalsiyum boyalarının (veya voltaj algılama boyalarının) tat hücrelerine elektroforetik olarak yüklenmesi alternatif bir seçenek olabilir.
Bu deneyde kırılma indisinin 1.336'sı.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar rakip finansal çıkarları beyan ediyor: J. Han ve M. Choi, bu makalede açıklanan patentli μTongue teknolojisinin mucitleridir ve μTongue sistemi SciTech Kore aracılığıyla ticari olarak mevcuttur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Kore hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) hibesi olan Temel Bilimler Enstitüsü (IBS-R015-D1) tarafından desteklenmiştir (Hayır. 2019M3A9E2061789) ve Kore hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) hibesi (No. 2019M3E5D2A01058329). Eunsoo Kim ve Eugene Lee'ye teknik yardımları için minnettarız.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| asesülfam K | Sigma Aldrich | 04054-25G | Yapay tükürük / tastant |
| kalsiyum klorür çözeltisi | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Yapay tükürük / tastant |
| sitrik asit | Sigma Aldrich | C0759-100G | Yapay tükürük / tastant |
| sikloheksimid | Sigma Aldrich | 01810-5G | Yapay tükürük / tastant |
| denatonium | Sigma Aldrich | D5765-5G | Yapay tükürük / tastant |
| Diş yapıştırıcısı | Denkist | P0000CJT-A2 | Hayvan hazırlama |
| Resim J | NIH | ImageJ | Veri analizi |
| IMP | Sigma Aldrich | 57510-5G | Yapay tükürük / tastant |
| Anında yapıştırıcı | Loctite Loctite | 4161, Henkel | Hayvan hazırlama |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P3786-100G | Yapay tükürük / tastant |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | Yapay tükürük / tastant |
| Ketamin | Yuhan | Ketamin 50 | Hayvan hazırlama |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P0662-25G | Yapay tükürük / tastant |
| KHCO3 | Sigma Aldrich | 237205-500G | Yapay tükürük / tastant |
| MATLAB | Mathwork | MATLAB | Veri analizi |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100G | Yapay tükürük / tastant |
| MPG | Sigma Aldrich | 49601-100G | Yapay tükürük / tastant |
| Mutiphoton mikroskobu | Thorlab | Bergamo II | Mikroskop |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-500G | Yapay tükürük / tastant |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 792519-500G | Yapay tükürük / tastant |
| Objektif | Nikon | N16XLWD-PF | Mikroskop |
| Octaflow | ALA Bilimsel Aletler | OCTAFLOW II | Akışkan kontrol |
| PC | LG | Lg15N54 | Akışkan kontrolü |
| PH metre | Termobilimsel | ORION STAR AZ11 | Yapay tükürük / tastant |
| Fosfat tamponlu salin | Sigma Aldrich | 806562 | Yapay tükürük / tastant |
| kinin | Sigma Aldrich | Q1125-5G | Yapay tükürük / tastant |
| Şırınga pompası | Havard Aparatı | PHD ULTRA 4400 | Akışkan kontrolü |
| TRITC-dextran | Sigma Aldrich | 52194-1G | Hayvan hazırlama |
| Ultra hızlı fiber lazer | Toptica | FFultra920 01042 | Mikroskop |
| Ksilazin | Bayer Kore | Rompun | Hayvan hazırlama |
Kaynaklar
- Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
- Shih, A. Y., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
