Bu protokolde canlı hücre mikroskopisi esas alınarak yapılan test yayılan bir hücrenin deneysel prosedürlerini sunuyoruz. Floresan etiketli hücrelerin tarafsız segmentasyonu ve hücre yayılması sırasında lamellipodia dinamiklerinin nicel analizi için açık kaynaklı bir hesaplama aracı sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hücre Yayma Sırasında Hücre Kenarı Dinamiklerinin Nicel Analizi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Hücre yayma, medyada asılı bir hücrenin bir substrata bağlandığı ve yuvarlanmış bir şekilden ince ve yayılmış bir şekle düzleştirmesi dinamik bir işlemdir. Hücre-substrat ekini takiben, hücre gövdesinden yayılan ince bir lamellipodia tabakası oluşturur. Lamellipodia'da, globüler aktin (G-actin) monomerleri plazma zarına doğru iten yoğun bir filamentli aktin (F-actin) meshwork'e polimerize olur ve böylece hücrenin yayılması için gereken mekanik kuvvetleri sağlar. Özellikle, lamellipodia'daki aksin polimerizasyonunu kontrol eden moleküler oyuncular, hücre göçü ve endositoz gibi diğer birçok hücresel süreç için gereklidir.
Yayılan hücreler tüm hücre çevresini kapsayan ve sürekli olarak dışa doğru genişleyen sürekli lamellipodia oluşturduğundan, hücre yayma tahlilleri lamellipodial çıkıntıların kinetiğini değerlendirmek için etkili bir araç haline gelmiştir. Hücrenin yayılan tahlillerinin birkaç teknik uygulaması geliştirilmiş olsa da, iş akışının hem adım adım protokol hem de veri analizi için hesaplama araçlarını içerecek ayrıntılı bir açıklaması şu anda eksiktir. Burada, hücre yayılma tahlilinin deneysel prosedürlerini açıklıyoruz ve yayılma sırasında hücre kenar dinamiklerinin nicel ve tarafsız analizi için açık kaynaklı bir araç sunuyoruz. Farmakolojik manipülasyonlar ve/veya gen susturma teknikleri ile birleştirildiğinde, bu protokol lamellipodial çıkıntıları düzenleyen moleküler oyuncuların geniş ölçekli bir ekranına tabidir.
Giriş
Lamellipodial çıkıntılar, göç eden bir hücrenin önünde oluşan belirgin sitoskeletal yapılardır. Lamellipodia'da, Arp2/3 kompleksi ve forminlerin yardımıyla aktinin polimerizasyonu, plazma zarına1,2'ye karşı iten hızlı büyüyen dallı bir aksin meshwork oluşturur. Aktüen meshwork tarafından oluşturulan itme kuvveti, hücreyi fiziksel olarakileriye doğru iterek 1,3,4,5. Arp2/3 kompleksinin tükenmesi veya lamellipodial çıkıntılar için gerekli sinyal yollarının bozulması genellikle hücre gö....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Hücre Tohumlama
NOT: Açıklanan hücre yayma protokolü, PH-Akt-GFP (PIP3 /PI(3,4)P2için floresan belirteç) ifade eden fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler) kullanılarak gerçekleştirildi. Bu hücre hattı, CRISPR aracılı gen düzenleme ile PH-Akt-GFP (Addgene #21218) için bir ifade yapısı genomik olarak entegre edilmesiyle oluşturulmuştır. Bununla birlikte, geçici olarak ifade edilen veya genoma entegre edilen diğer floresan belirteçler de bu testte kullanılabilir. En iyi görüntü segmentasyonu için sitoplazmada eşit olarak dağıtılan floresan belirteçler kullanmanızı öneririz, örneğin sitosoleik GFP.
- ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yukarıdaki protokol, yayılan hücrelerin canlı hücre görüntülemesi için deneysel prosedürleri ve hücre yayma dinamiklerinin nicel analizi için bir hesaplama aracını açıklar. Hesaplama aracı, hücre lideri kenarındaki akrin polimerizasyon makinelerini düzenleyen moleküler oynatıcıları tanımlamak için düşük veya yüksek aktarım hızı biçiminde kullanılabilir.
Deneysel yordamların şematik gösterimi Şekil 1'de tasvir edilir. Test yayılan hücre, eGFP25
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Açıklanan hücre yayma tahlili, çoğu hücre yayma protokolünde eksik olan morfolojik değişikliklerin(örneğin, hücre büyüklüğü ve şekli) ve hücre kenar hareketlerinin(örneğin, çıkıntı hızı ve geri çekme sıklığı) sürekli izlenmesini sağlar19,24. Yaygın olarak kullanılan son nokta hücre yayma tahlilleri hücre yayılma hızının belirlenmesine izin verirken, bu tahliller hücre kenar hareketlerinin zamansal dinamiklerini çözememektedir. Zamansal bilgi eks.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma, Connaught Fund New Investigator Award to S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (RGPIN-2015-05114 ve RGPIN-2020-05881), Manchester Üniversitesi ve Toronto Üniversitesi Ortak Araştırma Fonu ve Toronto Üniversitesi XSeed Programı tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.05 Tripsin (% 0.05), 0.53 mM EDTA | Wisent Bioproducts | 325-042-CL | |
| 10.0 cm Petri Kabı, Polistiren, TC İşlemli, Havalandırmalı | Starstedt | 83.3902 | |
| 15 mL Yüksek Berraklıkta PP Santrifüj Tüpü, Konik Tabanlı, Kubbe Contalı Vidalı Kapaklı, Steril | Falcon | 352097 | |
| 22 mm x 22 mm Lamel Çekirdek Teknolojileri için 1 Kuyulu Chamlide CMS | CM-S22-1 | ||
| 35 mm TC ile işlenmiş Kolay Kavramalı Stil Hücre Kültürü Kabı | Falcon | 353001 | |
| 50 mL Santrifüj Tüpü, Şeffaf, Tapa Conta | Yuvası | 602002 | |
| 6.0 cm Hücre Kültürü Kapları, Artan Hücre Bağlanması için İşlem Görmüş, Steril VWR | 10861-658 | ||
| Arp2/3 Kompleks İnhibitör I, CK-666 | Millipore Sigma | 182515 | |
| Kamera, Prime 95B-25MM | Fotometri | ||
| Dimetil Sülfoksit, Steril BioShop | DMS666 | ||
| DMEM, 1x, 4.5 g/L Glikoz, L-Glutamin, Sodyum Pirüvat ve Fenol Kırmızısı | ile Wisent Bioproducts | 319-005 CL | |
| DMEM/F-12, HEPES, Fenol Yok Kırmızı | Gibco | 11039021 | |
| D-PBS, 1X | Wisent Biyoürünler | 311-425 CL | |
| Fetal Sığır Serumu | Wisent Bioproducts | 080-110 | |
| Fiji Software | ImageJ | ||
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| İnsan Plazma Fibronektin Saflaştırılmış Protein 1 mg | Millipore Sigma | FC010 | |
| Daldırma Yağı | Cargille | 16241 | |
| L-Glutamin Çözeltisi (200 mM) | Wisent Bioproducts | 609-065-EL | |
| MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Mikro Kapaklı Camlar, Kare, No. 11/2 22 x 22 mm | VWR | CA48366-227-1 | |
| Mikroskop Gövdesi, Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Objektif, CFI Plan Apo Lambda 60X Yağ | Nikon | MRD01605 | |
| Penisilin-Streptomisin | Sigma | P4333 | |
| İplik Diski, Tepe Işığı V2 | CrestOptics | ||
| Spyder | Anaconda | ||
| Sahne üstü inkübatör | Tokai Hit | ||
| İstatistik Yazılımı, Prizma | GraphPad | ||
| Cımbız, Stil 2 | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 78326-42 |
Kaynaklar
- Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).
- Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
