Bu çalışma, farklı yaşlarda farenin iç kulağından endolenfatik kesenin nasıl diseksiyon yapılacağını açıklamaktadır. Benzer bir diseksiyonun sonucu, endolenfatik kesenin genişlemesinin bir Slc26a4-null fare modelinde gösterilmiştir. Endolenfatik kese içinde eksprese edilen bir floresan raportöre sahip bir transgenik fare, endolenfatik kesesi kolayca görselleştirmek için bir model ve eğitim aracı olarak sunulmaktadır.
Yöntem makalesi
Farelerden Endolenfatik Kesenin Diseksiyonu
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
İnsan işitme ve denge bozukluklarının mutant fare modellerinin incelenmesi, insan fenotiplerine katkıda bulunabilecek birçok yapısal ve işlevsel değişikliği ortaya çıkarmıştır. Koklea ve vestivulanın nörosensoriyel epitelinin gelişimi ve fonksiyonunun anlaşılmasında önemli ilerlemeler kaydedilmiş olmasına rağmen, endolenfatik kesenin gelişimi, hücresel bileşimi, moleküler yolakları ve fonksiyonel özellikleri ile ilgili sınırlı bilgi mevcuttur. Bu, büyük ölçüde, sadece bir hücre katmanından oluşan bir epitel olan bu dokuyu görselleştirmenin ve mikrodiseksiyonun zorluğundan kaynaklanmaktadır. Burada sunulan çalışma, farklı yaşlarda vahşi tip fare iç kulağından endolenfatik keseye erişmek ve mikrodiseksiyon yapmak için bir yaklaşımı açıklamaktadır. Benzer bir diseksiyonun sonucu, vestibüler su kemerinin genişlemesi için pendrin eksikliği olan bir fare modelinde gösterilmiştir. Floresan endolenfatik kese ile transgenik bir fare sunulmaktadır. Bu raportör fare, sınırlı diseksiyon ile endolenfatik kesesi kolayca görselleştirmek ve boyutunu belirlemek için kullanılabilir. Endolenfatik kesenin nasıl diseksiyon yapılacağını öğretmek için bir eğitim aracı olarak da kullanılabilir. Bu diseksiyon prosedürleri, iç kulağın bu az çalışılmış kısmının daha fazla karakterizasyonunu kolaylaştırmalıdır.
Giriş
Memeli iç kulağı koklea, sakkül, utrikül, üç yarım daire kanal ve endolenfatik keseden oluşur (Şekil 1A). Bu organlar, membranöz labirent adı verilen sürekli, sıvı dolu bir epitel içerir ve bitişik organlar doğrudan veya duktus reuniens, sakküler kanal, utriküler kanal veya endolenfatik kanal gibi küçük kanal yapıları aracılığıyla bağlanır. İç kulağın diğer organlarıyla karşılaştırıldığında, endolenfatik kese benzersiz özelliklere sahiptir. Birincisi, duyusal epitel hücrelerinden yoksundur. Bunun yerine, endolenfatik kese, iyon taşınması için özelleşmiş hücrelere sahiptir. İkincisi, membranöz labirent kemikli labirent içinde olmasına rağmen, endolenfatik kese, kısmen petröz kemikten dışarı ve kafa içi boşluğa doğru çıkıntı yapan bir istisnadır. Bu morfoloji, iç kulağın evrimi sırasında yüksek oranda korunmuş gibi görünmektedir. Üçüncüsü, endolenfatik kese, diğer organların oluşumundan önce erken embriyonik aşamada otokistten gelişen ilk yapıdır. Ek olarak, çeşitli patolojiler genişlemiş bir endolenfatik kese veya anormal bir endolenfatik kompartman ile ilişkilendirilmiştir. SLC26A4 patojenik varyantların varlığı (pendrin geni olarak da bilinir), genişlemiş bir vestibüler su kemerinin (EVA) varlığıyla ilişkili endolenfatik kesenin genişlemesinin neden olduğu, nispeten yaygın bir sensörinöral işitme kaybı formuna yol açar1. Guatr ile ilişkili olduğunda, Pendred sendromu 2,3 olarak adlandırılır. Meniere hastalığının ayrıca bazıları tarafından endolenfatik kompartmanın (hidrops ) anormalliği ile ilişkili olduğu düşünülmektedir4. Endolenfatik kesenin benzersiz özellikleri ve morfolojisindeki bir değişiklikle ilişkili patolojiler, iç kulağın gelişimi ve bakımı için kritik bir rol ile tutarlıdır.
Önemine rağmen, endolenfatik kesenin gelişimi, hücresel bileşimi, moleküler yolakları ve fonksiyonel özellikleri ile ilgili bilgiler hala sınırlıdır. Bu, en azından kısmen, bu dokuyu görselleştirmenin ve mikrodiseksiyonun zorluğundan kaynaklanmaktadır. Endolenfatik kese, genellikle yarı saydam olan ve onu çevreleyen konjonktif dokudan hafif stereomikroskopi ile tanımlanması çok zor olan tek bir epitel hücresi katmanından oluşan kese şeklinde bir yapıdır. Az sayıda araştırmacı tam montajlı diseksiyon teknikleri geliştirmiş ve deneysel bulgularını yayınlamış olsa da 5,6,7,8,9,10, bu prosedürün teknik detaylarına odaklanan bir yayın bulunmamaktadır.
Bu çalışmada, farklı yaşlarda vahşi tip fare iç kulağından endolenfatik keseye erişmek ve izole etmek için geliştirilen mikrodiseksiyon yaklaşımları anlatılmıştır. Benzer bir diseksiyonun sonuçları, endolenfatik kanal ve kesenin genişlemesi olan SLC26A4 ifadesi olmayan bir fare modelinde gösterilmiştir. Endolenfatik kese içinde eksprese edilen bir Cre rekombinazı kodlayan bir transgene sahip bir fare hattı bildirilmiştir. Cre ekspresyonunun bir floresan raportörünün varlığında, burada tdTomato, floresans, sınırlı diseksiyon ile endolenfatik kesesi kolayca görselleştirmek ve boyutu hakkında bilgi elde etmek için kullanılabilir. Bu muhabir fare serisi, endolenfatik kese diseksiyonlarını uygulamak ve mükemmelleştirmek için bir eğitim aracı olarak da kullanılabilir. Endolenfatik kese dokusunu diseksiyon yeteneği, iç kulağın bu az çalışılmış ancak temel bileşeninin daha fazla karakterizasyonunu kolaylaştırmalıdır.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri ve prosedürleri, Ulusal Nörolojik Hastalıklar ve İnme Enstitüsü/Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü (#1264) Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komiteleri ve Tokyo Tıp ve Diş Hekimliği Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (A2020-058A) tarafından onaylanan protokollere göre gerçekleştirildi.
NOT: C57BL/6J fareler (stok numarası 000664), Slc26a4-/- fareler olarak da bilinen Pds-/-, fareler (129S-Slc26a4 tm1Egr/AjgJ, no. 018424) 11, B6; CBA-Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mm fareler12 ve Ai9(LSL-RCL-tdT) (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze, no. 007909) fareler13 Jackson Laboratuvarı'ndan ve talep üzerine temin edilebilir. Tüm genotipleme prosedürleri daha önce tanımlanmıştır. B6; CBA-Tg (ATP6V1B1-Cre) 1Rnel / Mm fareler, daha önce en az beş nesil boyunca C57BL / 6J'yi suşlamak için geri çaprazlandı, deneyler için yetiştirildi. Her iki cinsiyetten hayvanlar, belirgin bir fark olmaksızın bu yaklaşımla incelenebilir. Gece çiftleşmeden sonraki ilk gün embriyonik gün 0.5 (E0.5) olarak sayılır.
1. Kafatasındaki sağlam iç kulağın toplanması ve sabitlenmesi
- Örneğin, CO2 inhalasyonu kullanarak, kurumsal olarak onaylanmış bir prosedür kullanarak deney hayvanını veya zaman hamile barajı ötenazi yapın. Fare alerjenlerinin yayılmasını önlemek veya en aza indirmek için mümkünse çeker ocak altında çalışın. Pençe veya kuyruk tutamları gibi ağrılı uyaranlara yanıt verilmediğini doğruladıktan sonra, hayvanın kafasını kesin. Zaman hamile bir baraj için, iç kulakları daha ileri deneyler için kullanılmazsa, servikal çıkık dekapitasyona alternatif olarak kullanılabilir.
- İşlem sırasında embriyoları korumak için bilyeli uçlu arter makası kullanarak laparotomi14 ile embriyoları hasat edin. Halka forseps kullanarak embriyoları manipüle edin. Rahim boynuzlarını 4 °C PBS'de buz üzerine yerleştirin ve her embriyoyu daha önce tarif edildiği gibi15 izole edin.
- Kafayı arkadan öne doğru ikiye bölün: önce deriyi keserek önce başın üst kısmını, ardından kafatasının üst kısmını kesin, her kesikte yaklaşık üçte birini kesin, böylece kafatasının bükülmesi olmaz. Sonra kafatasının altını bir kerede kesin.
NOT: Embriyolar için makas yerine keskin bir bıçak kullanılması tavsiye edilir. Her yaşta, kafatasını ikiye bölerken deforme olmaması çok önemlidir. - Kafatasına dokunmadan veya bükmeden, kemikli labirenti ortaya çıkarmak için yarım beyni dikkatlice çıkarın (Şekil 1B, Ek Şekil 1A-B).
- Doğum sonrası 5. gün veya daha büyük fareler için, dış kulak kanalını kesin ve cildi buruna doğru öne doğru çekin. Kafatasını iç kulağın etrafından kesin (Ek Şekil 1C).
- Her hayvanın iki yarım kafatasını, iç kulağı mümkün olduğunca sağlam olacak şekilde, 1x PBS'de seyreltilmiş 10 mL 4 °C %4 paraformaldehit (PFA) içeren bir cam şişeye veya tüpe aktarın ve bir davlumbaz altında buz üzerinde tutun.
NOT: Bu adımda iç kulağı kafatasından çıkarmaya çalışmayın çünkü bu işlem yaparken endolenfatik kanala ve keseye zarar verebilir. - Sallanan bir çalkalayıcı üzerinde 4 °C'de 1 saat inkübe edin. Floresan raportör ile bir hayvandan alınan doku ile çalışıyorsanız, ışığa maruz kalmayı en aza indirmek için numuneyi içeren tüpü alüminyum folyoda veya bir kutuda tutun.
NOT: Mikrotübüller ve ilişkili moleküller üzerinde çalışmakla ilgileniyorsanız, doku fiksasyonu RT fiksatifi ile oda sıcaklığında (RT) yapılmalıdır. - PFA'yı çeker ocaktaki uygun bir kaba atın. Diseksiyondan önce fiksatifi ortadan kaldırmak için RT'de sallanan bir çalkalayıcı üzerinde her seferinde 15 dakika boyunca 10 mL 1x PBS ile üç kez yıkayın.
2. Endolenfatik kese mikrodiseksiyonu
- Her bir iç kulak preparatını 1x PBS içeren 35 mm'lik bir doku kültürü kabına aktarın.
- Hazırlığı, 8. kraniyal sinirin kökü yukarı bakacak şekilde tabağa yerleştirin. Kokleayı #4 forseps ile kavrayarak dokuyu bu pozisyonda tutun (Şekil 1C).
- Önemli yer işaretlerini tanımlayın: vestibüler su kemeri, ön ve arka yarım daire kanalları, ortak crus ve sigmoid sinüs (damar) (Şekil 1D).
NOT: Yabani tip faredeki endolenfatik kese yarı saydamdır ve görselleştirilmesi zordur. Endolenfatik kesenin başarılı bir mikrodiseksiyonu için anatomisini ve lokalizasyonunu anlamak önemlidir (Şekil 1E). - 1 mL'lik bir şırınga üzerinde 27 G'lik bir iğne kullanarak dura mater ve vestibüler su kemerinin yanı sıra endolenfatik kesesi çevreleyen alttaki bağ dokularını kesin (Şekil 1D, F).
NOT: Yetişkin bir fare için, vestibüler su kemerinin insizyonunu kolaylaştırmak için mikrodiseksiyondan önce% 10 EDTA (pH 7.4) kullanılarak preparatın dekalsifikasyonu yararlıdır, ancak gerekli değildir. Doğum sonrası 5. günden daha eski açılmış endolenfatik kesenin diseksiyonu için, endolenfatik kese lümenine bir insizyon yapmak için insizyon hattının vestibüler su kemeri üzerine hafif öne yerleştirilmesi önerilir (Şekil 2A). - Endolenfatik kesenin lateralinde bulunan bağ dokusunu forseps ile tutun ve dokuyu yukarı çekerek temporal kemikten ayırın (Şekil 1G).
- Kalan kalıntıları dikkatlice temizleyin. Preparat genellikle endolenfatik kese epiteli, çevresindeki bağ dokuları, vestibüler su kemerinin bir kısmı ve sigmoid sinüsü içerir (Şekil 1H-I). Gerekirse endolenfatik kese epitelini çevre dokulardan ayırın (Şekil 1J).
- (İsteğe bağlı) Açılan endolenfatik kesenin diseksiyonu için, lümenin enine kesiti görülebilecek şekilde preparatın gövde kısmını tutun. Lümene 27 G'lik bir iğne sokun ve endolenfatik kesesi iki tabaka halinde kesmek için hareket ettirin (Şekil 2B-C). Her yaprak benzeri dokunun kenarını forseps ile tutun ve birbirinden ayırın (Şekil 2D-F).
3. İmmünohistokimya
- Mikrodiseksiyondan sonra, endolenfatik keseleri 9 oyuklu bir spot cam plakaya aktarmak için # 5 forseps kullanın.
- Endolenfatik keselerin dokunulmadığından emin olmak için mikroskobu kullanarak, dokuyu içeren bir damla dışında tüm 1x PBS'yi çıkarmak için 200 μL'lik bir pipet kullanın. 200 μL geçirgenleştirici ve bloke edici çözelti (% 0.15 Triton X-100 (PBS-TX) ve% 5 sığır serum albümini (BSA) ile 1x PBS) ekleyin ve bir orbital çalkalayıcı üzerinde RT'de 1 saat inkübe edin.
- Dokuyu içeren bir damla hariç tüm bloke edici çözeltiyi çıkardıktan sonra, 200 μL primer antikor ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Bloke edici çözelti içinde 1:1000 oranında seyreltilmiş anti-pendrin antikorları6 , endolenfatik kesenin mitokondri açısından zengin hücrelerini tanımlamak için kullanılabilir, ancak ribozom açısından zengin hücrelerin16 bir alt kümesinde de soluk bir ekspresyon görülür (Şekil 5).
- RT'de 15 dakika boyunca 1x PBS'de üç yıkamadan sonra, ikincil antikorlarla inkübe edin. Burada sunulan etiketleme için, ticari stoktan 1:500'de bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş 200 μL floresan boya konjuge ikincil antikorları, doku karanlıkta RT'de 1 saat boyunca sallanan bir platform üzerinde inkübe edin. β-aktini (ACTB) tanıyan floresan boya konjuge falloidin, endolenfatik kese ve kanalın yanı sıra bunların etrafındaki konjonktürel dokunun varlığını vurgulamak için kullanılabilir (Şekil 5A, C, F-G).
- DAPI ile bir antifade montaj ortamı kullanarak endolenfatik keseleri bir cam slayt ve lamel arasına monte edin. Slaytları RT'de 1 saat ışıktan koruyarak kurumaya bıraktıktan sonra, lamel ile cam slayt arasındaki bağlantı yerine şeffaf oje sürün, böylece onları kapatın ve hava kabarcığı oluşumunu sınırlayın. Epitel hücrelerinin apikal ve bazolateral yüzeyindeki proteinlerin diferansiyel dağılımını görselleştirmeye çalışıyorsanız, montaj adımı sırasında kesenin bir kenarı keserek ve açarak açılması önerilir.
- Konfokal mikroskop kullanarak görüntü. İlk olarak, kese etiketlemesinin küresel bir görünümünü sağlamak için endolenfatik kese preparatlarını 10x hedefle görselleştirin (Şekil 5A-D). Ardından, endolenfatik kesenin mitokondri ve ribozom açısından zengin hücrelerinde ilgilenilen proteinin dağılımının ayrıntılı bir görünümünü elde etmek için 63x'lik bir hedef kullanın (Şekil 5F-G).
Sonuçlar
Doğum sonrası 5. gün (P5) faresinden alınan vahşi tip bir endolenfatik kesenin bu mikrodiseksiyonunun her adımı, ilgili videoda ayrıntılı olarak açıklanmıştır ve bu diseksiyonun ve endolenfatik kesenin açılmasının temel adımlarının anlık görüntüleri Şekil 1 ve Şekil 2'de sunulmuştur.
Bu protokolü takiben embriyonik gün 16.5 (E16.5), P5 ve P30'da tdTomato floresan ile endolenfatik kesenin diseksiyonlarının temsili sonuçları Şekil 3'te ve Ek Şekil 1 ve Ek Şekil 2'de sunulmuştur. Floresanslı bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak, Cre ekspresyonu raporlayıcısının varlığında transgen Tg (ATP6V1B1-Cre) taşıyan farelerde beynin çıkarılmasından sonra endolenfatik kese kafatasında kolayca görüntülenebilir: Ai9 (LSL-RCL-tdT) (bkz. Şekil 3A-B ve diseksiyonun farklı aşamalarında endolenfatik kesenin olay ışığında ve tdTomato floresansında yakalanan görüntüler için Ek Şekil 1). Bu farelerde Cre, endolenfatik kese ve kanal boyunca hücrelerde bir mozaik olarak ifade edilir (Şekil 3, ayrıca floresan raportör olmadan endolenfatik kesenin görselleştirilmesi için Ek Şekil 2'ye bakınız). Bu raportörün ekspresyonu, bu epitelin iki hücre tipinden biri olan endolenfatik kese16'nın mitokondri açısından zengin hücreleriyle sınırlı olan Atp6v1b1'in endojen ekspresyonu için spesifik olmasa da (Şekil 5E), endolenfatik kesenin tanımlanması ve diseksiyonu için yardımcı bir yardımcıdır.
Vestibüler su kemerinin genişletilmesi için bir fare modelinden diseke edilen iç kulaklar Şekil 4'te sunulmuştur. Kontrol çöpleriyle karşılaştırıldığında, SLC26A4 eksikliği olan farelerin endolenfatik keseleri ve kanalları (pendrin) genişler.
Konjonktifli dokulu ve konjonktürel dokusuz intakt endolenfatik kesenin immünohistokimyasının temsili görüntüleri Şekil 5'te gösterilmiştir. P5 yabani tip bir farenin açılmış endolenfatik kesesinin immünohistokimya sonuçları da sunulmuştur (Şekil 5F-G). Endolenfatik kese, lümen endolenfini içeren, kese şeklinde bir yapıda katlanmış tek bir epitel tabakasından oluşur. Bu epitel, mitokondriden zengin hücreler ve ribozomdan zengin hücreler olmak üzere iki hücre tipinden oluşur (Şekil 5E). Tüm montajlı bir endolenfatik kese, endolenf artık mevcut olmadığı için düzleşecektir. Kese, iç içe geçmiş iki epitel tabakası olarak görünecek ve bu epitelde eksprese edilen proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu belirlemeyi zorlaştıracaktır. Endolenfatik kesenin açılmasıyla, tek katmanlı epitel kolayca görüntülenebilir ve ilgilenilen proteinlerin endolenfatik kese lümenine göre nispi dağılımı daha kesin olarak belirlenebilir. Bu proteinlerin potansiyel bir apikal (endolenfin olacağı luminal) ve bazal zenginleşmesi daha doğru bir şekilde belirlenebilir. Örnek olarak, SLC26A4 mitokondri açısından zengin hücrelerin apikal tarafında zenginleştirilmiştir (Şekil 5F).
Şekil 1. Doğum sonrası 5. günde vahşi tip bir farenin endolenfatik kesesinin tam montajlı diseksiyonu (P5).
(A) Gelişmiş bir fare iç kulağının zarlı labirentinin şeması (sağda). Endolenfatik kesenin yeri ve koklea ve vestibüler yapılar belirtilir. Bu rakam Honda ve ark.16'dan değiştirilmiştir.
(B) Sol hemi-kafatasını gösteren orta sagital bölüm. Endolenfatik kesenin yeri belirtilir (ok). (O, oksipital; F, önden)
(C) Temporal kemiğin skuamöz kısmı ile birlikte otik kapsül.
(D) Panel C'deki noktalı kutunun üzerine yerleştirilmiş önemli yer işaretleri (ES, endolenfatik kese; ED, endolenfatik kanal; VA, vestibüler su kemeri; ASC, ön yarım daire kanalı; PSC, posterior yarım daire kanalı; CC, ortak crus; SS, sigmoid sinüs)
(E) Endolenfatik kese boyunca panel D üzerindeki sürekli beyaz çizgi ile birlikte enine kesitin şematik gösterimi. Endolenfatik kesenin proksimal tarafı, endolenfatik kanal ile birlikte vestibüler su kemeri adı verilen kemikli bir kanal ile kaplıdır. Distal tarafta, konjonktif, doku (BT) ile çevrili endolenfatik kese, kemikli labirentin dışına doğru uzanır ve çıkıntı yapar ve temporal kemiğin (TB) skuamöz kısmı ile dura mater (DM) ve sigmoid sinüs arasına sıkışır.
(F) Endolenfatik kesenin etrafını kesmek için ince bir iğne kullanılır (panel D'deki noktalı sarı çizgileri takip ederek).
(G) Preparat, dokuyu yıldız işaretiyle gösterilen konumda tutarak (*, panel E'de de gösterilmiştir) ve soyularak temporal kemikten dikkatlice çıkarılır.
(H) Çevreleyen dokularla birlikte izole edilmiş bir bütün endolenfatik kese.
(I) Bu izole endolenfatik kesenin çevre dokularla birlikte şematik versiyonu.
(J) Çevreleyen dokular olmadan izole edilmiş endolenfatik kese.
Ölçek çubukları: 2 mm (B), 1 mm (J). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. P5 vahşi tip bir farenin açılmış endolenfatik kesesinin diseksiyonu.
(A) Adım 2.4'te, vestibüler su kemeri üzerindeki insizyon hattı, endolenfatik kese lümenine bir insizyon yapmak için hafifçe öne (kırmızı noktalı çizgi) yerleştirilir.
(B) Preparatın gövde kısmını tutun, lümene 27 gauge bir iğne sokun ve endolenfatik kesesi iki tabaka halinde kesmek için hareket ettirin.
(C) Panel B'nin şematik gösterimi.
(D) Her yaprağın kenarını forseps ile tutun ve birbirinden ayırın.
(E) Panel D'nin şematik gösterimi.
(F) Endolenfatik kese, epitel ve çevresindeki dokular dahil olmak üzere iki tabakaya ayrılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. R26LSL-RCL-tdT/+'nın diseksiyonu; Tg (ATP6V1B1-Cre) 1Rnel / Mn fare endolenfatik kesesi E16.5, P5 ve P30'da. Sunulan tüm görüntüler, tdTomato floresansının tespiti için donatılmış 1 x objektifli bir stereomikroskop kullanılarak elde edilen tdTomato floresansını göstermektedir.
(A, B) E16.5 R26LSL-RCL-tdT/+'nın kafatasının orta sagital bölümü; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn fare, (A) öncesi ve (B) yarım beyin çıkarılmasından sonra. tdTomato floresansı, iç kulağın konumunu ana hatlarıyla belirtir. Endolenfatik kese, diseksiyon (ok ucu) olmadan bile kolayca görülebilir.
(C, E, G) Sırasıyla E16.5, P5 ve P30 farelerinden izole edilmiş iç kulaklar.
(D, F ve H) Karşılık gelen mikrodiseke endolenfatik kese ve kanalların daha yüksek büyütme görüntüleri. P30'da, endolenfatik kanal kemikte kapsüllenir ve bu da izole edilmesini özellikle zorlaştırır. Ölçek çubukları: 2 mm (A, B, C, E, G), 500 μm (D, F, H). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Genişlemiş bir endolenfatik kese ile otik kapsülün brüt anatomisi. P105'te Slc26a4+/- (solda) ve Slc26a4-/- (sağda) fare littermatlarından iç kulaklar. Vestibüler su kemeri ve endolenfatik kese ve kanal (siyah noktalı çizgiler) Slc26a4-/- farede Slc26a4+/- faredekilere kıyasla genişler. Ölçek çubuğu: 2 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5. SLC26A4 E16.5 ve P5'te endolenfatik kese epitelinde mitokondri açısından zengin hücrelerin ekspresyonu.
(A, B) Anti-SLC26A4 antikoru (yeşil) ve β-aktini (ACTB, kırmızı) etiketleyen falloidin ile etiketlenmiş E16.5 faresinden izole edilmiş endolenfatik kese.
(C) Bir anti-SLC26A4 antikoru (yeşil) ile etiketlenmiş P5 faresinden açılan endolenfatik kesenin düşük büyütmeli görüntüsü. Phalloidin (ACTB, kırmızı), endolenfatik kesenin yanı sıra etrafındaki konjonktiv dokunun varlığını vurgulamak için kullanılabilir.
(D) Bir anti-SLC26A4 antikoru (yeşil) ile etiketlenmiş izole endolenfatik kese.
(E) İki hücre tipinin varlığını vurgulayan endolenfatik kese epitelinin şematik gösterimi: apikal yüzeyi mikrovilluslarla kaplı mitokondri açısından zengin hücreler ve ribozom açısından zengin hücreler.
(F-G) Endolenfatik kese açıldıktan ve bir anti-SLC26A4 antikoru (yeşil) ve falloidin (ACTB, kırmızı) ile işaretlendikten sonra P5'te endolenfatik kese epitelinin yüksek büyütmeli görüntüleri. Apikal membran seviyesinde temsili bir görüntü G'de gösterilir ve noktasal beyaz çizgi seviyesinde z-yığınından yeniden yapılandırılmış bir kesit F'de gösterilir. Hücrelerin çekirdeği DAPI (mavi) ile etiketlenmiştir.
Ölçek çubukları: 100 μm (A, B); 200 μm (C, D) ; 20 μm (F, G). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1. Bir P5 R26LSL-RCL-tdT/+'nın gelen ışığı ve karşılık gelen tdTomato floresan görüntüleri; Tg (ATP6V1B1-Cre) 1Rnel / Mn fare iç kulağı diseksiyonun üç adımında. Endolenfatik kese ve kanal, tdTomato floresansı kullanılarak kolayca görüntülenebilir.
(A-B) Bir P5 R26LSL-RCL-tdT/+'nın sağlam bir yarım kafatasının arka kısmındaki iç kulak bölgesi; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn fare.
(C-D) Derinin ve kafatasının bir kısmının çıkarılması, endolenfatik kese bölgesinin daha iyi görselleştirilmesini sağlar.
(E, F) Endolenfatik kese hala konjonktif, doku ile ilişkili izole iç kulak.
(A, C, E) Olay ışığında yakalanan görüntüler. (B, D, F) tdKarşılık gelen dokunun domates floresansı. Ölçek çubukları: 2 mm (A-B), 1 mm (C-F). Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2. R26LSL-RCL-tdT/+ izole endolenfatik keselerinin floresansının karşılaştırılması; Tg (ATP6V1B1-Cre) 1Rnel / Mnve R26LSL-RCL-tdT / + E16.5 ve P5'te littermat fareler. tdTomato floresansı, endolenfatik kese ve kanalın tanınmasını büyük ölçüde kolaylaştırır.
(A-C) E16.5 R26LSL-RCL-tdT/+'nın mikrodiseke endolenfatik keseleri; Tg (ATP6V1B1-Cre) 1Rnel / Mn (A) ve R26LSL-RCL-tdT / + littermat fareler (B, C).
(D-F) P5 R26LSL-RCL-tdT/+'nın mikrodiseke endolenfatik keseleri; Tg (ATP6V1B1-Cre) 1Rnel / Mn (D) ve R26LSL-RCL-tdT / + littermat fareler (E, F).
(A, B, D, E) tdDomates floresansı. (C, F) B ve E'ye karşılık gelen gelen gelen ışık görüntüleri. Ölçek çubukları: 500 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tartışma
Birçok araştırmacı, endolenfatik kesenin morfolojik çalışmaları için parafine gömülü veya donmuş bölümler kullanmıştır. Kesitli preparatların dezavantajı, karmaşık hücreden hücreye temasları tam olarak gözlemlemenin zor olabilmesidir, çünkü endolenfatik kesedeki her epitel hücresinin boyutu ve şekli son derece değişkendir, buruşuk ve psödostratifiye bir hücre tabakası oluşturur. Bu protokolde açıklanan tam montajlı immün boyama ve z-yığını görüntüleme, endolenfatik kesenin üç boyutlu yapısının daha iyi görselleştirilmesine izin verir.
Başarılı bir mikrodiseksiyon için kritik nokta, vahşi tip farede görünmez olsa bile, endolenfatik kesenin tüm ana hatlarını zihinsel olarak görselleştirmektir. Şekil 3'te ve Ek Şekil 1-2'de gösterilen floresan raportörün gözlemlenmesi, farelerde endolenfatik kesenin lokalizasyonunu ve boyutunu tanımak için yardımcı olabilir.
Yukarıdaki protokolde immüno-boyama için bu tam montajlı diseksiyon yöntemi kullanılırken, bu teknik aynı zamanda RT-qPCR, mikrodizi ekspresyonu ve hatta tek hücreli RNA-seq gibi gen ekspresyon analizi için endolenfatik kese dokusunu hasat etmek için de kullanılabilir. Bu protokol ile hazırlanan doku kullanılarak yapılan tek hücreli RNA-seq analizinin sonuçları daha önce bildirilmiştir16. Endolenfatik kese epitel hücrelerinin gen ekspresyon analizi için, diğer bitişik dokularla kontaminasyon olmaması için izole epitel toplanması tercih edilir. Embriyonik endolenfatik kese, komşu bağ dokularından ayrılabilse de, ilerleyen yaşlarda yapılması çok daha zordur. Daha yaşlı farelerden alınan örnekler için, 37 ° C'de 5 dakika boyunca kollajenaz / dispas ile inkübasyon teşvik edilir ve endolenfatik kese epitelinin izolasyonunu kolaylaştırır.
Bu protokolde tarif edilen tam montajlı immün boyamanın dezavantajlarından biri, orijinal üç boyutlu yapının, preparatın cam slayt ve lamel arasındaki diseksiyonu veya montajı sırasında travmadan etkilenebilmesidir. Manipülasyon nedeniyle artefaktlardan kaçınmak için özen gösterilmesi gerekir.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu araştırma kısmen NIH'nin Intramural Araştırma Programı, NIDCD (NIH Intramural Araştırma Fonları Z01-DC000060 ve ZIC DC000081 to the Advanced Imaging Core) tarafından desteklenmiştir. Dr. Raoul D. Nelson ve R. Lance Miller'a (Utah Üniversitesi, Salt Lake City, UT) ve Dr. Susan Wall'a (Emory Üniversitesi Tıp Fakültesi, Atlanta, GA) Tg (ATP6V1B1-Cre) farelerini paylaştıkları için ve hayvanlarımıza baktıkları için NIDCD hayvan tesisi personeline minnettarız. İç kulağın güzel çizimi için Dr. Philine Wangeman'a şükranlarımızı sunarız. Dr. Thomas B. Friedman ve Robert J. Morell'e bu makaleyi eleştirel bir şekilde inceledikleri için teşekkür ederiz.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| EDTA 0.5 M | Crystalgen | 221-057 | |
| 27G x 13mm BD ile 1 mL TUBERCULIN şırınga | 309623 | ||
| 9 kuyulu spot cam plaka | Pyrex | 13-748B | |
| Alexa Fluor 555-konjuge phalloidin | ThermoFisher Scientific | A34055 | |
| Arter ve nbsp; Makas - Top Ucu | Güzel Bilim Araçları | 14080-11 | |
| Sığır serum albümini | Sigma Aldrich | A3059 | |
| Gelen ışıkta görüntü yakalamak için kamera | Leica | DFC 495 | |
| Floresan görüntüler yakalamak için kamera | Leica | DFC 7000 GT | |
| Santrifüj tüpleri 15 mL | Corning | 430053 | |
| Santrifüj tüpleri 50 mL | Corning | 430829 | |
| Kollajenaz / Dispase | Roche | 10269638001 | |
| Konfokal mikroskop | Zeiss | LSM 880 | |
| Kapak Camı | Corning | 2940-223 | |
| Dumont #4 Forseps | Güzel Bilim Araçları | 11241-30 | |
| Dumont #5 Forseps | Güzel Bilim Araçları | 11251-20 | |
| Dumont #55 Forseps | Güzel Bilim Araçları | 11255-20 | |
| Ekstra İnce Bonn Makas | Güzel Bilim Araçları | 14084-08 | |
| Alternatif: Ekstra İnce Mikro Diseksiyon Makasları; Düz; Keskin noktalar; 20 mm bıçak uzunluğu; 3 1/2" Toplam Uzunluk | Roboz | RS-5880 | |
| Keçi anti-tavşan Alexa Fluor 488-konjuge ikincil antikor | ThermoFisher Scientific | A11034 | |
| MicroSlides Superfrost | VWR | 48311-702 | |
| Orbital çalkalayıcı, örneğin Mini Çalkalayıcı | Daigger | 980275 | |
| Paraformaldehit (PFA) %16 Sulu Çözelti | Elektron Mikroskobu Sciences | 15710 | |
| Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (10X) pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | AM9624 | |
| ThermoFisher Scientific | P36931 | ProLong Altın Antifade Mountant | |
| Kurum | RRID:AB_2713943, PB826 (Choi et al., 2011) | ||
| Halka Forseps | Güzel Bilim Araçları | 11106-09 | |
| Sallanan çalkalayıcı, örneğin GyroMini | Labnet | S0500 | |
| PlanApo 1.0x objektif ile donatılmış stereomikroskop | Leica | ||
| Paslanmaz Çelik Tek Kenar Bıçakları, .009" | GEM Personna | 62-0176 | |
| Doku kültürü kabı 60 mm | Falcon | 353002 | |
| Şeffaf oje | |||
| Triton X-100 | ACROS Organik | 32737-1000 |
Kaynaklar
- Dror, A. A., Brownstein, Z., Avraham, K. B. Integration of human and mouse genetics reveals pendrin function in hearing and deafness. Cellular Physiology and Biochemistry. 28 (3), 535-544 (2011).
- Reardon, W., CF, O. M., Trembath, R., Jan, H., Phelps, P. D. Enlarged vestibular aqueduct: a radiological marker of pendred syndrome, and mutation of the PDS gene. QJM. 93 (2), 99-104 (2000).
- Griffith, A. J., Wangemann, P. Hearing loss associated with enlargement of the vestibular aqueduct: mechanistic insights from clinical phenotypes, genotypes, and mouse models. Hearing Research. 281 (1-2), 11-17 (2011).
- Gurkov, R., Pyyko, I., Zou, J., Kentala, E. What is Meniere's disease? A contemporary re-evaluation of endolymphatic hydrops. Journal of Neurology. 263, Suppl 1 71-81 (2016).
- Eckhard, A., et al. Water channel proteins in the inner ear and their link to hearing impairment and deafness. Molecular Aspects of Medicine. 33 (5-6), 612-637 (2012).
- Choi, B. Y., et al. Mouse model of enlarged vestibular aqueducts defines temporal requirement of Slc26a4 expression for hearing acquisition. Journal of Clinical Investigation. 121 (11), 4516-4525 (2011).
- Miyashita, T., et al. Presence of FXYD6 in the endolymphatic sac epithelia. Neuroscience Letters. 513 (1), 47-50 (2012).
- Royaux, I. E., et al. Localization and functional studies of pendrin in the mouse inner ear provide insight about the etiology of deafness in pendred syndrome. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 4 (3), 394-404 (2003).
- Kim, H. M., Wangemann, P. Epithelial cell stretching and luminal acidification lead to a retarded development of stria vascularis and deafness in mice lacking pendrin. PLoS One. 6 (3), 17949(2011).
- Dahlmann, A., von During, M. The endolymphatic duct and sac of the rat: a histological, ultrastructural, and immunocytochemical investigation. Cell and Tissue Research. 282 (2), 277-289 (1995).
- Everett, L. A., et al. Targeted disruption of mouse Pds provides insight about the inner-ear defects encountered in Pendred syndrome. Human Molecular Genetics. 10 (2), 153-161 (2001).
- Miller, R. L., et al. The V-ATPase B1-subunit promoter drives expression of Cre recombinase in intercalated cells of the kidney. Kidney International. 75 (4), 435-439 (2009).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3643(2012).
- Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. (2), 152(2007).
- Honda, K., et al. Molecular architecture underlying fluid absorption by the developing inner ear. Elife. 6, (2017).
Yeniden basım ve izinler
