Gangliosidler, beyinde özellikle bol miktarda bulunan sialik asit taşıyan glikozfingolipidlerdir. Amfipatik doğaları, optimum geri kazanım ve doğru analizler sağlamak için organik / sulu ekstraksiyon ve saflaştırma teknikleri gerektirir. Bu makalede, analitik ve hazırlayıcı ölçekli ganglioside ekstraksiyonu, saflaştırma ve ince tabaka kromatografisi analizine genel bakış sunulmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Ganglioside Ekstraksiyonu, Saflaştırma ve Profilleme
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Gangliosidler, bir veya daha fazla sialik asit kalıntısı içeren glikozfingolipidlerdir. Tüm omurgalı hücrelerinde ve dokularında bulunurlar, ancak özellikle beyinde bol miktarda bulunurlar. Öncelikle hücrelerin plazma zarlarının dış broşüründe ifade edilen, hücre yüzey proteinlerinin faaliyetlerini lateral ilişki yoluyla modüle eder, hücre-hücre etkileşimlerinde reseptör görevi görür ve patojenler ve toksinler için hedeflerdir. İnsanlarda gangliosid biyosentezinin genetik disregülasyonu ciddi konjenital sinir sistemi bozukluklarına neden olur. Amfipatik doğaları nedeniyle, gangliosidlerin ekstraksiyonu, saflaştırılması ve analizi, keşiflerinden bu yana geçen 80 yıl içinde birçok araştırmacı tarafından optimize edilmiş teknikler gerektirir. Burada, birkaç saat içinde tamamlanabilen dokulardan ve hücrelerden majör gangliosidlerin ekstraksiyonu, saflaştırılması ve ön kalitatif ve kantitatif analizleri için tezgah düzeyinde yöntemler açıklanmaktadır. Ayrıca, büyük ganglioside türlerinin beyinden daha büyük ölçekli izolasyonu ve saflaştırılması için yöntemler de açıklıyoruz. Birlikte, bu yöntemler bu biyoaktif molekül sınıfına analitik ve hazırlayıcı ölçek erişimi sağlar.
Giriş
Gangliosidler, bir veya daha fazla sialik asit kalıntısı taşıyan glikozfingolipidler olarak tanımlanır1. Plazma zarının dış broşürüne gömülü hidrofobik seramid lipid köstebekleri ve hücre dışı boşluğa uzanan hidrofilik glikanları ile öncelikle hücre yüzeyinde eksprese edilirler2. Omurgalı hücrelerinde ve dokularında yaygın olarak dağılmış olmalarına rağmen, ilk keşfedildikleri ve adlandırıldıkları omurgalı beyninde3 özellikle bol miktarda bulunurlar4.
Gangliosid glikanlarının yapıları değişir ve isimlendirmelerinin temelidir (
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Doku toplama, Johns Hopkins Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından yetkilendirilen koşullar altında gerçekleştirildi.
1. Küçük ölçekli ganglioside ekstraksiyonu ve kısmi arıtma
DİKKAT: Uçucu ve toksik çözücülerle çalışırken uygun havalandırma kullanın. Boyunca plastikten kaçının; çözücüler, sonraki analizlere müdahale eden birçok plastikten kimyasal bileşenleri çıkaracaktır. Politetrafloroetilen (PTFE) bir istisnadır; Cam saklama şişelerini kapatmak için PTFE astarlı kapaklar kullanılmalıdır.
- Çıkarma
- Tek bir taze veya çözülmüş fare beynini (veya sagital yarı beyin, ~ 0.2-0.5 g) tartın ve b....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bölüm 1'de (küçük ölçekli) açıklanan yöntemler, majör beyin gangliosidlerinin kalitatif ve kantitatif tayini için yeterli miktarda ve saflıkta gangliosidler sağlar. Fare beyninden iyileşme, tarif edildiği gibi hazırlandığında g beyin ıslak ağırlığı (1 nmol / μL) başına ~ 1 μmol gangliosiddir. Bölüm 3 kullanılarak 1 μL'lik (1 nmol) TLC çözünürlüğü, resorsinol tespiti için yeterli materyal sağlar ve Şekil 4'te vahşi tip ve genetiği değiştirilmiş fareler için gösterildiği gibi tüm büyük beyin g.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada bildirilen küçük ve büyük ölçekli gangliosid ekstraksiyonu ve izolasyonu yöntemleri benzersiz değildir - mükemmel sonuçlar veren birçok farklı çözücü ekstraksiyonu ve saflaştırma yaklaşımı vardır12. Burada beyinden, Fredman ve Svennerholm'dan13 küçük ölçekli saflaştırma için bildirilen yöntemlerin iyileşmeyi optimize ettiği ve laboratuvarımızda uzun yıllar boyunca sağlam ve basit olduğu kanıtlanmıştır. TLC ve MS için uygun izolasyon ve saflaştırma, sağlam dokudan izo.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını iddia ediyorlar.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Glikobilim Ortak Fonu hibesi U01CA241953 tarafından desteklenmiştir. MJP, Johns Hopkins'teki Kimya-Biyoloji Arayüz Programı (T32GM080189) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Sığır beyni, soyulmuş | PelFreez | 57105-1 | |
| Gangliosid standartları | Matreya | GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063 | |
| PTFE kaplı kapaklı cam şişe | Fisher Scientific | 02-911-739 | |
| Cam santrifüj şişesi | Fisher Scientific | 05-586B | |
| Cam kültür tüpleri, 16 x 125 mm | VWR | 60825-430 | HPLC fraksiyonlarını toplamak için |
| Cam ayırıcı huni (2 L) | Pyrex | 6400-2L | |
| Enjeksiyon şırıngası - Hamilton 1750 gaz geçirmez 500 ve mikro; l | Hamilton | 81265 | |
| p-Anisaldehit, %98 | Sigma-Aldrich | A88107 | |
| Potter-Elvhjem Homojenizatör | Fisher Scientific | 08-414-14A Uygun | hacim seçeneğini seçin |
| Reprosil 100 NH2 10µ m 5x4mm koruma sütunları | Analitik-Mağaza | AAVRS1N-100540-5 | |
| Reprospher 100 NH2, 5 & mu; m, 250 mm x 20 mm HPLC kolonu | Analitik-Mağaza | özel paketlenmiş | diğer boyutlar mevcuttur |
| Resorcinol | Sigma-Aldrich | 30752-1 | |
| Döner buharlaştırıcı | Buchi | R-300 | |
| Model 7725 için numune döngüsü Enjektör (5 ml) | Sigma-Aldrich | 57632 | |
| Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g) | Sular | WAT043350 | |
| Sep-Pak tC18 Plus Kısa Kartuş, 400 mg | Su | WAT036810 | |
| Lekeleme şırıngası - Hamilton 701N 10 & l | Hamilton | 80300 | |
| PFTE kaplı kapaklı kalın duvarlı 13 mm çaplı test tüpleri | Fisher Scientific | 14-933A | |
| PFTE kaplı kapaklı dişli 2 ml'lik şişeler | Fisher Scientific | 14-955-323 | Gangliosit depolama |
| için TLC plakaları, HPTLC Silika jel 60 F254 Çok Formatlı | Fisher Scientific | M1056350001 | Floresan emprenye (F254) sorbenti stabilize eder yüzey |
| TLC reaktif püskürtücü | Fisher Scientific | 05-723-26A | |
| TLC 10 x 10 cm plakalar için çalışma odası | Camag | 22.5155 | |
| Waring 1 Litre Paslanmaz Çelik Patlamaya Dayanıklı Blender | Waring | E8520 |
Kaynaklar
- Schnaar, R. L. The Biology of Gangliosides. Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).
- DeMarco, M. L., Woods, R. J. Atomic-resolution conformational analysis of....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
