Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Peptit Matrisi Bazlı HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitoplarının HBV'ye Özgü CD4 T hücre yanıtlarının analizi ve tanımlanması

2.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/62387

⸱

20 Ekim 2021

 ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University (Army Medial University), 2Chongqing Key Laboratory for Research of Infectious Diseases

Bu makalede

Özet

Hepatit B virüsü (HBV) türevi peptit matrisi baz alınarak, HBV'ye özgü CD4 T hücre yanıtları HBV'ye özgü CD4 T hücreli epitopların tanımlanmasına paralel olarak değerlendirilebilir.

Özet

CD4 T hücreleri kronik hepatit B patogenezinde önemli roller oynar. Çok yönlü bir hücre popülasyonu olarak, CD4 T hücreleri salgıladıkları sitokinlere göre farklı fonksiyonel alt kümeler olarak sınıflandırılmıştır: örneğin, CD4 T yardımcı 1 hücreleri için IFN-γ, CD4 T yardımcı 2 hücreleri için IL-4 ve IL-13, CD4 T foliküler yardımcı hücreler için IL-21 ve CD4 T yardımcı 17 hücre için IL-17. Hepatit B virüsüne (HBV) özgü CD4 T hücrelerinin HBV türevi peptit stimülasyonundan sonra sitokin salgısına dayalı analizi, sadece HBV'ye özgü CD4 T hücre yanıtının büyüklüğü hakkında değil, aynı zamanda HBV'ye özgü CD4 T hücrelerinin fonksiyonel alt kümeleri hakkında da bilgi sağlayabilir. Transkriptomik ve metabolomik analiz gibi yeni yaklaşımlar, HBV'ye özgü CD4 T hücreleri hakkında daha ayrıntılı işlevsel bilgiler sağlayabilir. Bu yaklaşımlar genellikle peptit majör histocompatibility complex-II multimers baz alınarak uygulanabilir HBV'ye özgü CD4 T hücrelerinin izolasyonunu gerektirirken, şu anda HBV'ye özgü CD4 T hücreli epitoplar hakkındaki bilgiler sınırlıdır. HBV türevi peptit matrisine dayanarak, kronik HBV enfeksiyonu hastalarından periferik kan mononükleer hücre örnekleri kullanılarak HBV'ye özgü CD4 T hücre yanıtlarını değerlendirmek ve HBV'ye özgü CD4 T hücre epitoplarını aynı anda tanımlamak için bir yöntem geliştirilmiştir.

Giriş

Şu anda antijene özgü T hücrelerini analiz etmek için 3 ana yaklaşım bulunmaktadır. İlk yaklaşım, T hücre reseptörü ile peptit (epitop) arasındaki etkileşime dayanır. Antijene özgü T hücreleri doğrudan peptit-majör histocompatibility complex (MHC) multimerleri ile boyanabilir. Bu yöntemin avantajı, aşağı akış transkriptomik / metabolomik analizi için uygun canlı antijene özgü T hücreleri elde etmenindir. Bu yöntemin bir sınırlaması, belirli bir antijen için tanımlanmış epitopların sayısı şimdilik sınırlıyken, doğrulanmış epitop peptitleri gerektirdiğinden, belirli bir antijene tüm T hücresi yanıtı hakkında bilgi sağlayamamış olmasıdır. Hepatit B virüsüne (HBV) özgü CD8 T hücreli epitoplarla karşılaştırıldığında, HBV'ye özgü CD4 T hücre epitopları1,2olaraktanımlanmıştır,bu da bu yöntemi şu anda HBV'ye özgü CD4 T hücrelerinin analizi için daha az uygulanabilir hale getirmiştir.

İkinci yaklaşım, antijen peptit stimülasyonundan sonra bir dizi aktivasyon kaynaklı belirtecin yukarı doğrulasyonuna dayanır3. Yaygın olarak kullanılan belirteçler CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4'leriiçerir. Bu yöntem artık aşılanmış bireylerde antijene özgü T hücre yanıtlarını analiz etmek için kullanılmıştır5,6, İnsan İmmün Yetmezlik Virüs enfeksiyonu hastaları7ve Şiddetli Akut Solunum Sendromu Koronavirüs 2 enfeksiyon hastaları8,9. Peptit-MHC multimers bazlı testlerin aksine, bu yöntem doğrulanmış epitoplar tarafından kısıtlanmamıştır ve aşağı akış analizi için uygulanabilir hücreler elde edebilir. Bu yöntemin bir sınırlaması, antijene özgü T hücrelerinin sitokin profili hakkında bilgi sağlayamamasıdır. Ayrıca, bu aktivasyon kaynaklı belirteçlerin bazı aktif antijen içermeyen hücreler tarafından ifade edilmesi, analizdeki arka plan sinyallerine katkıda bulunabilir, bu da özellikle hedef antijene özgü T hücreleri nadir olduğunda bir sorun olabilir. Şu anda, bu yöntemin HBV'ye özgü CD4 T hücreleri4üzerinde sınırlı uygulanması vardır. Bu yöntemin HBV'ye özgü CD4 T hücrelerini güvenilir bir şekilde analiz etmek için kullanılıp kullanılamayacağı daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyar.

Üçüncü yaklaşım antijen peptit stimülasyonundan sonra sitokin salgısına dayanır. Aktivasyon kaynaklı işaret tabanlı analiz gibi, bu yöntem de doğrulanmış epitoplar tarafından kısıtlanmamıştır. Bu yöntem antijene özgü T hücrelerinin sitokin profilini doğrudan ortaya çıkardı. Bu yöntemin hassasiyeti, antijene özgü T hücrelerinin sitokin salgılanmasına dayandığı ve test edilen sitokin sayısı genellikle sınırlı olduğu için aktivasyon kaynaklı belirteç bazlı yöntemden daha düşüktür. Şu anda, bu yöntem HBV'ye özgü T hücrelerinin analizinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Sitokin salgılayan HBV'ye özgü T hücreleri doğrudan ex vivo peptid stimülasyonu ile neredeyse tespit edilemediğinden10,11, HBV'ye özgü T hücrelerinin sitokin profili genellikle 10 günlük in vitro peptidin uyarılmış genişlemesi12 , 13,14,15,16'dan sonra analiz edilir. Peptit havuzlarının matris formunda düzenlenmesi, antijene özgü epitopların tanımlanmasını kolaylaştırmak için kullanılmıştır17,18. Peptit matrisi ve sitokin salgı analizinin kombinasyonu ile HBV'ye özgü CD4 T hücre yanıtlarını değerlendirmek ve HBV'ye özgü CD4 T hücre epitoplarını aynı anda tanımlamak için bir yöntem geliştirilmiştir16. Bu protokolde, bu yöntemin ayrıntıları açıklanmıştır. HBV çekirdek antijeni bu protokolde bir gösteri örneği olarak seçilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Çalışmaya dahil edilen her hastadan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Çalışma protokolü, Southwest Hastanesi tıp etik komitesinin önceden onayına yansıtıldığı şekilde 1975 Helsinki Bildirgesi'nin etik kurallarına uygundur.

1. HBV türevi peptit matrisinin tasarımı

  1. HBV çekirdek antijeninin amino asit dizilerini NCBI veritabanlarından indirin (GenBank: AFY98989.1).
  2. Bir peptit sentezi servis sağlayıcısından HBV çekirdek antijen türevi peptitler (10 kalıntı, saflık >% 90, 4 mg / peptit ile örtüşen 35 15-mer peptit paneli) satın alın.
  3. Matristeki her pozisyona sadece 1 peptit içeren kare 6×6 peptit matrisi kurun. 12 peptit havuzu vardır: 6 sıra peptit havuzu ve 6 sütunlu peptit havuzu, her havuzda 5-6 peptit16. Sıra peptit havuzları ve matristeki kolon peptit havuzları HBV çekirdek antijeninin 2 ayrı oluşumunu temsil eder.
  4. Satın alınan peptitlerin 3/4'ü için, matrisin aynı sırasındaki/sütunundaki peptitleri dimetil sülfit (DMSO) (her peptit için 2 μg/μL) içinde eriterek 12 ayrı peptit havuzuna karıştırın. HBV'ye özgü CD4 T hücre yanıtlarının analizi için -80 °C'de saklayın.
  5. Peptitlerin geri kalanını ayrı ayrı çözün (10 μg/μL) ve epitop tanımlaması için -80 °C'de saklayın.

2. Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC' ler) izolasyonu

  1. Kronik HBV enfeksiyonu hastalarından 5 mL venöz kan örneği.
    NOT: Kan hacmi peptit havuzlarının sayısı artı 1 arka plan kontrolü ve 1 pozitif kontrole göre kabaca tahmin edilmelidir. 1 peptit havuzunun analizi 3 x 105 PBMC'ye ihtiyaç duyar. Ortalama olarak, 1 mL kandan 1 x10 6 PBMC elde edilebilir.
  2. Ficoll yoğunluk gradyan santrifüjleme (800 × g, 20 dk) ve daha sonra kullanılmak üzere sıvı nitrojende izole EDILMIŞ PBMC'leri kullanarak PBMC'leri kandan izole edin.
  3. Açık Ficoll tabakası ile kırmızı kan hücresi tabakası arasında granülosit toplamak için bir Pasteur pipet kullanın. Üreticinin protokolüne göre genomik DNA saflaştırma kiti kullanarak granülositlerden genomik DNA çıkarın.
  4. HLA-DRB1 genotipini belirlemek için DNA örneğini genotip servis sağlayıcılarına gönderin.

3. HBV Peptit Matrisi Kullanan PBMC'lerin In Vitro Genişlemesi

  1. PBMC'leri çözün.
    1. Sıcak RPMI 1640, bir su banyosunda 1:10.000 benzonaz (25 U/mL) ila 37 °C ile desteklenmiştir.
      NOT: Benzonase, çözülme sırasında hücre topaklamayı sınırlamaya yardımcı olur. Her örnek benzonaz ile 20 mL RPMI 1640 gerektirecektir. Tüm örneklerin çözülmesi için gereken miktarı hesaplayın ve 1:10.000 Benzonaz (25 U/mL) ile ayrı bir ortam aliquot (37 °C) hazırlayın. Aynı anda en fazla 5 numuneyi çözün.
    2. Sıvı azottan numuneleri çıkarın ve donmuş şişeleri bir su banyosunda (37 °C) hızla çözün.
    3. Çözülmüş hücre süspansiyonu 15 mL santrifüj tüpüne aktarın. Tüpe 1 mL Benzonase RPMI 1640 (37 °C) damla yönünde ekleyin. Santrifüj tüpüne yavaşça 6 mL Benzonase RPMI 1640 (37 °C) ekleyin, tüm hücreleri almak için diğer 2 mL Benzonase RPMI 1640 (37 °C) ile cryovial durulayın. Numunelerin geri kalanıyla mümkün olduğunca çabuk devam edin.
      NOT: Kriyoprezserved örneklerin yavaş seyreltilmesi, çözülmüş hücrelerin canlılığını korumanın anahtarıdır.
    4. Santrifüj (400 × g, 10 dk), süpernatantı çıkarın ve tüpe dokunarak peletı gevşetin.
    5. Peleti 1 mL sıcak Benzonase RPMI 1640'ta hafifçe yeniden bastırın. Yavaşça karıştırın ve gerekirse hücreleri 70 μm hücre süzgecinden (yani görünür bir küme varsa) filtreleyin.
    6. Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) 10 μL süspansiyon ve seyreltin, Trypan mavisi ekleyin (%0,04), hemositometreye yükleyin, 1 dakika bekleyin ve canlı hücrelerin sayısını (net hücreler) sayın.
    7. Tüpe 9 mL Benzonase RPMI 1640 (37 °C) ekleyin, santrifüj (400 × g, 10 dk), süpernatantı çıkarın ve boruya dokunarak peletin gevşeyin.
  2. RPMI 1640'taki PBMC'leri 25 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin ve insan AB serumu (tam kültür ortamı) ile desteklenmiştir. Hücre yoğunluğunu 1,5 x 106 hücre/mL'ye ayarlayın. 3 x 105 hücre/kuyu yoğunluğunda 96 kuyulu plakalarda (düz alt) PLAKA PBMC'leri.
  3. Her kuyuya HBV türevi peptit havuzları (her bir peptit için 2 μg/mL) ekleyin. Arka plan kontrolü ve pozitif kontrol kuyuları için aynı miktarda çözücü ekleyin (DMSO, 1 μL/mL). 10 U/mL IL-2 ve 10 ng/mL IL-7 ekleyin. 37 °C ve %5 CO2'dekuluçkaya yatır.
  4. 3. günde, IL-2'nin 50 U/mL'si ve IL-7'nin 10 ng/mL'si ile kültür ortamını tamamlar.
    NOT: 1- 3. gün arasında belirgin bir T hücre çoğalması gözlenmeyecektir. B hücreleri, NK hücreleri, NKT hücreleri ve monositler gibi T olmayan hücrelerin ölümü nedeniyle toplam hücre sayısı genellikle 1/3 ila 1/2 oranında azalacaktır.
  5. 7. günde, kültür ortamının yarısını peptit (4 μg/mL), IL-2 (100 U/mL) ve IL-7 (20 ng/mL) içeren taze ortamla değiştirin.
    NOT: Alttaki hücreleri rahatsız etmemek için pipet yaklaşık 90 μL kültür ortamı ortamın üstünden dikkatlice ortalar. 3 günden 7. güne kadar sağlam T hücre çoğalması gözlenecek ve çoğalan T hücreleri genellikle kümeler oluşturmak için toplanır.
  6. 10. günde, hücre kümelerini parçalamak, canlı hücre sayısını saymak ve HBV'ye özgü CD4 T hücre yanıt analizi için her kuyuda 2×105 hücreyi 96 kuyu plakasına (yuvarlak alt) aktarmak için her kuyudaki hücre kültürünü 7-9 kez hafifçe pipetleyin.
  7. 12. günde epitop tanımlaması için hücrelerin geri kalanını kültlü hale almaya devam edin, kültür ortamının hacmini 100 μL'ye ayarlayın (aşırı ortamı atma) ve peptitler (4 μg / mL), IL-2 (100 U / mL) ve IL-7 (20 ng / mL) içeren 100 μL taze tam kültür ortamı ile kültürü tamamlayın.
    NOT: 7 günden 10. güne kadar T hücreleri kuvvetli bir şekilde çoğalmaya devam ediyor. Ortam sararırsa, 3.5. Genel olarak, hücre sayısı 10×da 6×105'i geçecektir. Her kuyu genellikle benzer hücre numarasını gösterir, 3 kuyuda hücre numarasını sayar ve ortalama değeri tüm kuyular için hücre sayısının tahmini olarak kullanır.

4. HBV'ye özgü CD4 T-Hücre yanıtlarının hücre içi akış sitometrisi ile analizi

  1. Peptit havuzları ile PBMC'leri uyarma
    1. 96 kuyu plakasına (yuvarlak alt) aktarılan hücreler için, bir tabakta 3 kez yıkayın (550 × g, 3 dk). Her yıkama için 200 μL orta kullanın (ilk 2 yıkama için RPMI 1640, son yıkama için tam kültür ortamı). Üstünlükleri atın.
      NOT: Kültürdeki artık sitokinlerin tekrar tekrar yıkanarak uzaklaştırılması hücre içi akış sitometrisi analizinde arka planı etkili bir şekilde azaltabilir.
    2. Belirli bir peptit havuzu ile uyarılan her hücre kuyusu için, aynı peptit havuzları ile desteklenmiş 200 μL tam kültür ortamı ekleyin (her bir peptit için 2 μg / mL). Arka plan kontrolü kuyusu için, 1 μL / mL DMSO ile desteklenmiş tam kültür ortamı ekleyin. Pozitif kontrol kuyusu için, 1 μL / mL DMSO, 150 ng / mL phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) ve 1 μmol / L iyonomisitin ile desteklenmiş tam kültür ortamı ekleyin.
      NOT: Yüksek dozda DMSO, T hücrelerinin sitokin salgısını engelleyecektir (en önemlisi TNF-α için). 5 μL/mL'den yüksek DMSO dozu önerilmez. Genel olarak, deneyimizdeki DMSO dozu 1 μL / mL'yi geçmez.
    3. 37 °C'de kuluçkaya yatır ve 6 saat boyunca%5 CO 2.
    4. 1 saat kuluçkadan sonra, kültüre Monensin (1.37 μg / mL) ekleyin.
  2. Akış sitometrisi
    1. 6 saat kuluçkadan sonra. Santrifüjlemeden sonra (550 × g, 3 dk) süpernatantı çıkarın, hücreleri 200 μL DPBS (550 × g, 3 dk), leke yüzeyi işaretleyicileri (CD3, CD4 ve CD8) ve canlılık işaretleyicisiyle (Düzeltilebilir Canlılık Boyası kullanarak) 4 °C buzdolabında 30 dakika boyunca bir kez yıkayın.
    2. 200 μL DPBS (550 × g, 3 dk) ile bir kez yıkayın. Hücreleri sabitle ve permeabilize et ve hücre içi sitokinleri (TNF-α ve IFN-γ) 4 °C buzdolabında 45 dakika lekele.
    3. Hücre içi boyamada son yıkamadan sonra, hücreleri 150 μL akış sitomemetri tamponunda (DPBS +% 0,5 BSA) yeniden biriktirin.
    4. Akış sitometresinde akış sitomemetrisi verilerini alın.
  3. Akış sitometrisi sonuçlarının analizi
    1. Olumlu kuyunun tanımı: Arka plan kontrolünün en az iki katı kadar sitokin salgılayan bir sitokin sıklığına sahipse olumlu olarak düşünün(Şekil 1).
    2. Aşağıdaki formüle göre, analiz edilen her sitokin için yanıt oranını hesaplayın (Şekil 2):
      figure-protocol-1
      NOT: Sıra peptit havuzu ve matristeki kolon peptit havuzları HBV çekirdek antijeninin 2 farklı oluşumunu temsil eder, bu nedenle nihai yanıt oranı 2'ye bölünmelidir.

5. HBV'ye özgü HLA-DR Kısıtlı CD4 T hücreli Epitopların Tanımlanması

  1. T-75 şişesinde (5-20 ×106 hücre, 20 mL tam kültür ortamında) allojenik B lenfoblastoid hücre hatlarını (BLCL' ler) çözün ve koruyun.
    NOT: BLCL'lerin iyi durumunu garanti etmek için, bu adım hastaların PBMC'lerinin çözülmesinden 2 hafta önce başlatılmalıdır. Genotipleme sonucuna göre, hastalar BLCL'ler ile aynı HLA-DRB1 alelesini paylaşmalıdır.
  2. Kimlik tespiti için aday peptitlerin taranır (Şekil 3)
    1. 10. gün T hücre yanıt oranı sonuçlarına göre, en yüksek yanıt oranına sahip 2 peptit havuzunu (1 sıra peptit havuzu ve 1 sütun peptit havuzu) tarayın.
    2. Bu peptidi içeren diğer peptit havuzu da T hücre yanıt analizinde olumlu bir sonuç gösteriyorsa, bu 2 havuzdaki peptidi aday peptit olarak ayarlayın. Daha sonra epitop tanımlaması için diğer peptit havuzuyla genişletilen PBMC'leri kullanın.
  3. Peptit ile zonklayan BLCL'ler
    1. 12. günde, uygulanabilir BLCL sayısını sayın, hücreleri 15 mL santrifüj tüplerine, santrifüje (350 × g, 10 dk) aktarın ve süpernatantı çıkarın. Hücre peletini tam kültür ortamında ve aliquot BLCL'leri 80 μL tam kültür ortamında 4×104 hücre / kuyuda 96 kuyu plakasına (yuvarlak alt) yeniden biriktirin.
    2. Tek bir peptit (10 μg/ mL) ekleyin, 37 °C'de kuluçkaya yaslanın ve 2 saat boyunca%5 CO 2. Set 2 arka plan kontrolü: HLA-DR blokajı ile peptit titreşimi (1 saat boyunca anti-HLA-DR (10 μg / mL) ile ön işlem); DMSO (1 μL/mL) titreşim. Her kuyudaki tam kültür ortamının son hacmi 100 μL'dir.
    3. Mitomycin C (100 μg/mL) ekleyin, 37 °C'de kuluçkaya yatırın ve 1 saat boyunca% 5 CO2 ekleyin.
    4. Darbesiz peptit ve mitomycin C'yi çıkarmak için bir plakada 200 μL RPMI 1640 (550 × g, 3 dk) ile 3 kez yıkayın. İlk yıkama için kuluçka kültürünü 100 μL RPMI 1640 ile tamamlar.
    5. Hücreleri 120 μL tam kültür ortamında yeniden biriktirin.
  4. PEPTİt darbeli BLCL'lerle PBMC'leri uyarmak.
    1. 12. günde PBMC'leri 96 kuyu plakasına (yuvarlak alt) aktarın.
    2. Bir tabakta santrifüjlemeden (550 × g, 3 dk) sonra süpernatantı çıkarın, bir tabakta 200 μL RPMI 1640 (550 × g, 3 dk) ile iki kez yıkayın.
      NOT: Kültürdeki artık sitokin ve peptitlerin tekrar tekrar yıkanarak uzaklaştırılması hücre içi akış sitotmetrisi analizinde arka planı azaltmak için anahtar adımdır. Özellikle artık peptitler için BLCL'lere bağlanır ve arka planı önemli ölçüde arttırır.
    3. PBMC'leri her kuyuda 210 μL tam kültür ortamıyla yeniden kullanılabilir.
    4. Epitop tanımlama için seçilen PBMC'lerin kuyusu için, aliquot'u (her biri 70 μL) peptit darbeli BLCL'lerle (2 arka plan kontrolü dahil 3 kuyu) karıştırın.
      NOT: 12. günde, genişletilmiş PBMC'lerin sayısı genellikle kuyu başına 5-7×105'in üzerine ulaşır, bu nedenle PBMC/BLCL'lerin oranı yaklaşık 6/1 ila 4/1'dir.
    5. 37 °C'de kuluçkaya yatır ve 6 saat boyunca%5 CO 2.
    6. 1 saat kuluçkadan sonra, kültüre Monensin (1.37 μg / mL) ekleyin. Her kuyudaki tam kültür ortamının son hacmi 200 μL'dir.
  5. Akış sitometrisi
    1. 4.2. adımdakiyle aynı işlemleri yineleyin.
  6. Akış sitometrisi sonuçlarının analizi
    1. Bu peptit darbeli BLCC'lerle inkübe edilen PBMC'ler, arka plan kontrolleri ile inkübe edilen PBMC'lerin en az iki kez SITokin salgılayan CD4 T hücrelerinin bir frekansını gösteriyorsa, bir peptidi HLA-DR kısıtlı CD4 T hücreleri epitopu olarak doğrulayın (HLA-DR ön blokajı ile peptit titreşimi; DMSO titreşimi) (Şekil 4).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Sitokin salgılayan CD4 T hücrelerinin sıklığı hem tek üreticilerin hem de çift üreticilerin toplamı olarak hesaplanır. Şekil 1'degösterildiği gibi, TNF-α CD4 T hücrelerini salgılama sıklığı ve arka plan kontrolünde (DMSO) CD4 T hücrelerini salgılayan IFN-γ sıklığı sırasıyla% 0.154 ve% 0.013'tür. TNF-α cd4 T hücrelerinin salgılanması sıklığı ve PEPTİT HAVUZU Core11'e özgü IFN-γ salgılayan CD4 T hücrelerinin sıklığı sırasıyla 0.206 ve 0.017'dir, bu nedenle hem TNF-α cd4 T hücre yanıtını salgıl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokoldeki en kritik adımlar şu şekilde listelenmiştir: 1) PBMC genişlemesini başlatmak için yeterli yüksek uygulanabilirlik PBMC'leri; 2) PBMC genişlemesi için uygun ortam; ve 3) EPITOP TANıMLAMASINDAN ÖNCE PBMC kültüründe artık peptit havuzlarının tamamen çıkarılması.

Bu protokoldeki tüm analizler CD4 T hücrelerinin sağlam çoğalmasına bağlıdır. Genel olarak, 10 günlük genişlemeden sonra PBMC sayısı ilk sayının 2-3 katı olacaktır. PBMC'lerin hücre numarası ve uygulanabilirliği PBMC'lerin...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81930061), Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) ve Chinese Key tarafından desteklenmiştir.
Enfeksiyon Hastalıkları için Uzmanlaşmış Proje (2018ZX10723203).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Albümin Sığır V (BSA)BeyotimeST023
APC-konjuge Anti-insan TNF-&alfa;eBioscience17-7349-82Işıktan koruyun
Benzonaz NükleazSigma-AldrichE1014Hücre kümelenmesini sınırlayın
B lenfoblastoid hücre hatları (BLCL'ler)FRED HUTCHINSON KANSER ARAŞTIRMA MERKEZİHLA-DRB1*0803 homozigot
B lenfoblastoid hücre hatları (BLCL'ler)FRED HUTCHINSON KANSER ARAŞTIRMA MERKEZİHLA-DRB1*1202 homozigot
Hücre Kültürü Şişesi (T75)Corning430641
Hücre Kültürü Plakası (96 oyuklu, düz dipli)Corning3599Düz tabanlı
Hücre Kültürü Plakası (96 oyuklu, yuvarlak tabanlı)Corning3799Yuvarlak tabanlı
Hücre SüzgeciCorningCLS431751 Gözenek boyutu 70   μ m, beyaz, steril
Santrifüj Tüpü (15 mL)KIRGENKG2611Steril
Santrifüj Tüpü (50 mL)Corning430829Steril
Santrifüj, SoğutmalıEppendorf5804R
Santrifüj, SoğutmalıThermoST16R
Santrifüj, SoğutmalıThermoLegend Micro 21R
Cytofix/Cytoperm Kiti (Transkripsiyon Faktörü Tampon Seti)BD Biosciences562574Kullanmadan önce çözeltiyi hazırlayın
Dimetil Sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD2650Kristalleşmeyi önlemek için oda sıcaklığında saklayın
Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu Tuzlu SalNaCl <8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg) ve Na2HPO4.7H2O (2160 nbsp; mg) içeren ddH sub <> / sub >O (1000 ml) hazırlayın. PH'ı 7.4'e ayarlayın. Otoklav ile sterilize edin.
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-03
Filtre Uçları (0.5-10)KirgenKG5131Steril Filtre Uçları
(100-1000)KirgenKG5333Steril
Filtre Uçları (1-200)KirgenKG5233Steril
FITC konjuge Anti-insan CD4BioLegend300506Işıktan koruyun
Sabitlenebilir Canlılık Boyası eFluor780eBioscience65-0865-14Işıktan koruyun
GolgiStop Protein Taşıma İnhibitörü (Monensin İçeren)BD Biosciences554724Protein Taşıma İnhibitörü
HemositometreMarka718620
HBV Çekirdek Antijen Türetilmiş PeptitlerChinaPeptides
HEPESGibco15630080100 ml
İnsan Serumu ABİkizler Biyo-Ürünler100-51100 ml
İyonomisinSigma-AldrichI0634
KClSangon BiotechA100395-0500
KH2PO4Sangon BiotechA100781-0500
LSRFortessa Akış SitometresiBD
L-glutaminGibco25030081100 ml
Mikrosantrifüj Tüpü (1.5 mL)CorningMCT-150-Ckullanmadan önce otoklavlanmış sterilizasyon
Bilimsel Endüstriler MicroPlateGenie
Mitomisin CRoche10107409001
Na2HPO4.7H2OSangon BiotechA100348-0500
NaClSangon BiotechA100241-0500
PCR Tüpleri (0.2 mL)KirgenKG2331
PE / Cy7-konjuge Anti-insan CD8BioLegend300914Işıktan koruyun
PE konjuge Anti-insan IFN-&gama;eBioscience12-7319-42Işıktan koruyun
Penisilin StreptomisinGibco15140122 100 ml
PerCP-Cy5.5-konjuge Anti-insan CD3eBioscience45-0037-42Işıktan koruyun
Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA)Sigma-AldrichP1585
Rekombinant İnsan IL-2PeproTech200-02
Rekombinant İnsan IL-7PeproTech200-07
RPMI Orta 1640GibcoC11875500BT500 ml
Sodyum piruvat, 100mMGibco15360070
Tripan Mavi Leke (% 0.4)Gibco15250-061
Ultra-LEAF Saflaştırılmış Anti-insan HLA-DRBioLegend307648
Sihirbazı Genomik DNA Arıtma KitiPromegaA1125
IHW09126 IHW09121 Mikroplaka Çalkalayıcıları

Kaynaklar

  1. Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
  2. Mizukoshi, E., et al. Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. Journal of Immunology. 173, Baltimore, Md. 5863-5871 (2004).
  3. Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities. Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).
  4. Reiss, S., et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One. 12, 0186998(2017).
  5. Herati, R. S., et al. Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells. Science Immunology. 2, (2017).
  6. Bowyer, G., et al. Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials. Vaccines. 6, (2018).
  7. Morou, A., et al. Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease. Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).
  8. Grifoni, A., et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 181, 1489-1501 (2020).
  9. Meckiff, B. J., et al. Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19. Cell. , (2020).
  10. Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).
  11. Chang, J. J., et al. Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy. Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).
  12. Boni, C., et al. Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues. Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).
  13. Kennedy, P. T., et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B. Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).
  14. de Niet, A., et al. Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy. Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).
  15. Rinker, F., et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B. Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).
  16. Wang, H., et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection. Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).
  17. Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
  18. Anthony, D. D., Lehmann, P. V. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 29, 260-269 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

HBV Spesifik CD4 T H creleriHLA DR K s tl EpitoplarPeriferik Kan Monon kleer H creleriFicoll Yo unluk GradyanSitokin Sal n mAk SitometrisiH cre i Sitokin BoyamaEpitop Tan mlamaKronik Hepatit B
Peptit Matrisi Bazlı HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitoplarının HBV'ye Özgü CD4 T hücre yanıtlarının analizi ve tanımlanması
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.