Yöntem makalesi

Yapay mikroRNA'ların Tol2 Transpozon Aracılı Transgenik Ekspresyonu Kullanılarak Embriyonik Civciv Retinasında Fonksiyon Kaybı Yaklaşımı

DOI:

10.3791/62399

⸱

18 Mayıs 2022

 , 
1Department of Biology, Valparaiso University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İn ovo elektroporasyon ve Tol2 transpozon sistemini kullanarak yapay mikro-RNA dizilerinin civciv embriyolarına sokulmasını ve genomik entegrasyonunu içeren yeni bir fonksiyon kaybı yaklaşımı geliştirdik. Bu teknik, geliştirme sırasında gen fonksiyonu çalışmaları için sağlam ve kararlı bir gen yıkım metodolojisi sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Civciv retinası, büyük boyutu, hızlı gelişimi ve görselleştirme ve deneysel manipülasyonlar için erişilebilirliği gibi avantajları ile gelişimsel nörobiyolojide uzun zamandır önemli bir model sistem olmuştur. Bununla birlikte, en büyük teknik sınırlaması, gen fonksiyon analizleri için sağlam fonksiyon kaybı yaklaşımlarının olmamasıydı. Bu protokol, Tol2 transpozon sistemini kullanarak yapay mikroRNA'ların (miRNA'lar) transgenik ekspresyonunu içeren, gelişmekte olan civciv retinasında bir gen susturma metodolojisini açıklar. Bu yaklaşımda, EmGFP (zümrüt yeşili floresan protein) markörü için bir ekspresyon kaseti ve bir hedef gene karşı yapay pre-miRNA dizileri içeren bir Tol2 transpozon plazmidi, in ovo elektroporasyon ile bir Tol2 transpozaz ekspresyon yapısı ile embriyonik civciv retinasına sokulur. Transfekte retinal hücrelerde, transpozaz, transpozon vektöründen ekspresyon kasetinin eksizyonunu ve konakçı kromozomlara entegrasyonunu katalize ederek miRNA'ların ve EmGFP proteininin kararlı ekspresyonuna yol açar. Daha önceki çalışmamızda, nöral gelişimde birden fazla işlevi yerine getiren bir glikoprotein olan Nel'in ekspresyonunun bu tekniği kullanarak gelişmekte olan civciv retinasında önemli ölçüde baskılanabileceğini göstermiştik. Sonuçlarımız, bu metodolojinin gen ekspresyonunun kararlı ve sağlam bir şekilde baskılanmasına neden olduğunu ve böylece retina gelişimi çalışmaları için etkili bir fonksiyon kaybı yaklaşımı sağladığını göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Omurgalı retinası, nöral gelişimi incelemek için önemli bir model sistemdir. Periferik konumuna rağmen, retina anatomik ve gelişimsel olarak merkezi sinir sisteminin bir uzantısıdır ve retina ganglion hücrelerinin aksonlarından oluşan optik sinir, merkezi sinir sistemi içindeki bir yolu temsil eder. Civciv retinası, nöral gelişimin moleküler mekanizmasını incelemek için bir model sistem olarak önemli avantajlara sahiptir: Büyüktür ve hızla gelişir; İnsan retinası ile yapısal ve işlevsel benzerlikleri vardır; Görselleştirme ve deneysel manipülasyonlar için son derece erişilebilirdir. Nöral gelişim sırasında hücre proliferasyonu ve farklılaşması, morfogenez ve akson rehberliğinin moleküler mekanizmaları, tavuk retinası kullanılarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir.

In ovo elektroporasyon, gelişmekte olan civciv embriyosundaki hücrelere ektopik genleri sokmak için son yirmi yılda başarıyla kullanılmıştır. Bu teknik, gelişmekte olan hücrelerin etiketlenmesine, hücre kaderinin izlenmesine ve hücre göçü ve akson yollarının izlenmesine ve ayrıca gen fonksiyonunun in vivo analizi için ektopik gen ekspresyonuna izin verir. Civciv embriyolarında etkili ektopik gen ekspresyonu için in ovo elektroporasyonun koşulları iyi belirlenmiştir 1,2,3.

Bu avantajlara rağmen, gen fonksiyonu çalışmaları için kararlı bir fonksiyon kaybı tekniğinin olmaması, civciv embriyosunun önemli bir teknik sınırlaması olmuştur. Küçük enterferans yapan RNA'lar (siRNA'lar)4 veya kısa firkete RNA'ları (shRNA'lar) için ekspresyon vektörleri5 ile elektroporasyonlu civciv embriyoları, hedeflenen genin yıkıldığını gösterirken, bu yaklaşımlarda gen baskılanması geçicidir, çünkü hücreler eklenen RNA'ları veya DNA'ları kaybettiğinde etkiler ortadan kalkar. SiRNA'ların bir RCAS (Replication Copetent Avian sarkom-lökoz virüsü (ASLV) uzun terminal tekrarı (LTR) ile bir Splice alıcısı ile civciv embriyolarına verilmesiyle daha kararlı bir gen baskılanması sağlanabilir6. Viral vektör, konakçı genomuna entegre olur ve ektopik genler kararlı bir şekilde eksprese edilir. Bununla birlikte, retrovirüs yalnızca hücre döngüsünün mitotik (M) fazı sırasında bölünen hücrelerin genomuna entegre olabilir, bu da bu işlev kaybı yaklaşımının uygulanabileceği gelişim aşamaları ve/veya hücre tipleri üzerinde bir sınırlama getirebilir. Ek olarak, transgenlerin RCAS tarafından ekspresyonu, in ovo elektroporasyon7 tarafından indüklenenden daha yavaş ve daha az sağlam görünmektedir.

Transpozonlar, genom üzerinde bir konumdan diğerine hareket eden genetik elementlerdir. Tol2 elementi, hAT transpoze edilebilir element ailesinin bir üyesidir ve Tol2 elementi8'in transpozon reaksiyonunu katalize eden bir transpozazı kodlayan dahili bir gen içerir. Tol2 elementlerinin sol ve sağ uçlarının dizileri (sırasıyla 200 bp ve 150 bp) ile çevrili bir gen ekspresyon kaseti taşıyan bir plazmit vektörü, bir Tol2 transpozaz ekspresyon yapısına sahip omurgalı hücrelerine sokulduğunda, ekspresyon kaseti plazmitten çıkarılır ve ektopik genin kararlı bir ekspresyonunu destekleyen konakçı genomuna entegre edilir (Şekil 1). Tol2 transpoze elementinin, zebra balığı 9,10, kurbağalar11, civcivler 12 ve fareler 13 dahil olmak üzere farklı omurgalı türlerinde gen transpozisyonunu çok verimli bir şekilde indükleyebildiği ve bu nedenle yararlı bir transgenez ve insersiyonel mutajenez yöntemi olduğu gösterilmiştir. Tol2 transpozon sistemi, uzun çift sarmallı RNA14'ten işlenen siRNA'nın genomik entegrasyonu ile bir hedef genin koşullu yıkımı için başarıyla kullanılmıştır.

Bu protokol, civciv embriyosunda Tol2 transpozon sistemi15,16 tarafından yapay mikroRNA'ların (miRNA'lar) eklenmesini içeren bir fonksiyon kaybı yaklaşımını açıklar. Bu yaklaşımda, EmGFP (zümrüt yeşili floresan protein) belirteci ve bir hedef gene karşı yapay miRNA'lar için bir ekspresyon kaseti, bir Tol2 transpozon vektörüne klonlanır. Tol2 transpozon yapısı daha sonra in ovo elektroporasyon ile bir Tol2 transpozaz ekspresyon yapısı ile embriyonik civciv retinasına sokulur. Transfekte retinal hücrelerde, transpozaz, transpozon vektöründen ekspresyon kasetinin eksizyonunu ve konakçı kromozomlara entegrasyonunu katalize ederek miRNA'ların ve EmGFP proteininin kararlı ekspresyonuna yol açar. Önceki çalışmalarımızda, gelişmekte olan civciv retinasında, ağırlıklı olarak sinir sisteminde eksprese edilen hücre dışı bir glikoprotein olan Nel'in ekspresyonunu başarıyla düşürdük (bkz. Sonuçlarımız, bu teknikle ovoda stabil ve etkili gen baskılanmasının sağlanabileceğini göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. miRNA ekspresyon vektörlerinin oluşturulması

NOT: miRNA ekspresyon vektörleri oluşturma prosedürleri (adım 1.1-1.3, 1.5-1.6.), daha önce açıklandığı gibi emGFP'li miRNA ekspresyon kiti, Block-iT Pol II miR RNA ekspresyon kiti için optimize edilmiştir15,16. Kit, miRNA ekspresyonuna (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), bir kontrol vektörüne (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negatif kontrol plazmidi), aksesuar reaktiflerine ve miRNA ekspresyon vektörleri üretme talimatlarına izin vermek için tasarlanmış ekspresyon vektörünü sağlar (bkz.

  1. Hedef gene karşı pre-miRNA'ları kodlayan tek sarmallı DNA oligolarının tasarlanması: Tek sarmallı DNA oligoları ("üst iplikçik" oligoları (hedef pre-miRNA'lar) ve "alt iplikçik" oligoları (üst iplikçik oligolarının tamamlayıcıları)) çevrimiçi aracı kullanarak tasarlayın, RNAi Designer (bkz. Tek sarmallı oligoların gerekli özellikleri (Şekil 2A) ve hedef dizilerin örnekleri (Şekil 2B) için Şekil 2'ye bakın.
    NOT: Belirli bir hedef gen için 5-10 pre-miRNA dizisinin oluşturulması ve in vitro olarak knockdown aktiviteleri için taranması önerilir (adım 1.4).
  2. Çift sarmallı bir oligo oluşturmak için üst ve alt iplikçik oligolarının tavlanması
    1. Aşağıdaki tavlama reaksiyonunu (Tablo 1) steril bir 0.5 mL mikrosantrifüj tüpünde ayarlayın.
    2. Reaksiyon karışımını 95 °C'de 4 dakika inkübe edin. Reaksiyon karışımının 5-10 dakika oda sıcaklığına (RT) soğumasına izin vererek çift sarmallı bir oligo oluşturmak için üst ve alt iplikçik oligolarını tavlayın. Numuneyi kısaca santrifüjleyin (~5 s).
      NOT: Tavlanmış oligolar -20 °C'de bozulmadan en az bir yıl saklanabilir.
  3. Çift sarmallı oligoların miRNA ekspresyon vektörüne klonlanması (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (miRNA ekspresyon kitinde sağlanır)): Üreticinin kılavuzuna göre tek tek çift sarmallı oligoları doğrusallaştırılmış miRNA ekspresyon vektörüne klonlayın17.
  4. Knockdown etkilerinin değerlendirilmesi
    NOT: Bireysel miRNA dizilerinin, ovo'da uygulanmadan önce in vitro gen baskılama etkinliği açısından test edilmesi önerilir. Knockdown verimliliği, miRNA ekspresyon plazmitlerinin hedef geni eksprese eden bir hücre hattına transfekte edilmesiyle test edilebilir. Alternatif olarak, bireysel miRNA ekspresyon plazmitleri, hedef gen için bir ekspresyon yapısı ile hücre hatlarına birlikte transfekte edilebilir. Doğal hallerinde zara bağlı olmayan proteinleri kodlayan hedef genler için (örneğin, çözünür proteinler), hedef proteinin ekspresyonunu izlemek için bir alkalin fosfataz (AP) füzyon proteini kullanılabilir. Hedef proteini kodlayan bir cDNA dizisi, AP-tag vektörlerinde (APtag-1- APtag-5; Malzeme Tablosuna bakınız) insan plasental alkalen fosfataza çerçeve içinde kaynaştırılabilir vehücrelere 18 verilebilir. Kültür hücrelerinde (örneğin, HEK293T hücreleri) eksprese edildiğinde, AP etiketli hedef protein, kültür ortamına yüksek seviyelerde salgılanır ve böylece miRNA dizilerinin yıkım etkileri, miRNA ile transfekte edilmiş hücrelerin kültür ortamındaki AP aktivitesindeki azalma ölçülerek değerlendirilebilir (alt adımlar 1.4.1-1.4.4).
    1. Gece boyunca 24 oyuklu bir plakada (8 x 104 hücre / kuyucuk) kültür HEK293T. AP etiketli bir hedef proteinin bir ekspresyon plazmidi ile bireysel miRNA ekspresyon yapılarına sahip hücreleri geçici olarak transfekte edin. Kontrol olarak pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negatif kontrol plazmidini (miRNA ekspresyon kitinde sağlanır) kullanın. (AP etiketli bir hedef proteini kararlı bir şekilde ifade eden hücre hatları kullanılıyorsa, hücreleri yalnızca bireysel miRNA ekspresyon yapılarıyla transfekte edin.)
      NOT: Transfeksiyon için geleneksel bir lipofeksiyon reaktifi (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılır.
    2. Transfeksiyondan 48-72 saat sonra şartlandırılmış ortamı toplayın ve 65 ° C'lik bir su banyosunda 5 dakika boyunca endojen AP aktivitesini ısıtın. Bir masaüstü mikrosantrifüjünde 5 dakika boyunca maksimum hızda spinout kalıntısı.
    3. Süpernatanı 10 mM HEPES, pH 7.0 ile tamponlayın ve 0.45 μm'lik bir filtreden geçirin.
    4. Süpernatantın 100 μL'sini (bir plaka okuyucuda ölçüm için) veya 500 μL'sini (bir spektrofotometre için) alın ve eşit miktarda 2x AP substrat tamponu ekleyin (Tablo 2). Bir plaka okuyucuda veya spektrofotometrede OD405'i ölçerek AP aktivitesini kontrol edin.
      NOT: Şartlandırılmış ortamın AP aktivitesi doğru ölçüm için çok yüksekse, HBAH tamponu (Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS), 0.5 mg / mL sığır serum albümini, 20 mM HEPES (pH 7.0)) veya bir taşıyıcı protein içeren başka bir tampon. Fosfat içeren tamponlar (örneğin, PBS) kullanmayın çünkü inorganik fosfat rekabetçi bir AP inhibitörü görevi görür.
  5. MiRNA dizisinin zincirlenmesi
    NOT: Knockdown etkileri, farklı miRNA'ları aynı hedef gene karşı zincirleyerek veya aynı miRNA'yı tekrarlayarak artırılabilir. miRNA ekspresyon vektörü, çoklu pre-miRNA dizilerinin zincirlenmesini ve bunların ko-sistronik ekspresyonunudestekler 17.
    1. Üreticinin talimatlarına göre in vitro deneylerde (adım 1.4) en yüksek yıkım aktivitelerini gösteren iki farklı pre-miRNA dizisini (aynı hedef gene karşı) zincirleyin17.
    2. Adım 1.4'te açıklandığı gibi in vitro tahliller kullanarak zincirli yapıların gen baskılama verimliliğini değerlendirin. Üç veya daha fazla pre-miRNA dizisi benzer şekilde yüksek yıkım aktiviteleri gösteriyorsa, iki dizinin farklı kombinasyonlarını test edin ve en yüksek yıkım aktivitesini gösteren kombinasyonları kullanın (bkz.
  6. EmGFP-pre-miRNA ekspresyon kasetinin Tol2 transpozon vektörüne aktarılması
    NOT: EmGFP cDNA ve iki pre-miRNA dizisi içeren ekspresyon kaseti, Tol2 transpozon vektörüne aktarılır (pT2K-CAGGS vektörü , bkz. Bu amaçla, ekspresyon kaseti (CMV promotörünün 3' ucundan miRNA ekspresyon vektörünün miRNA ters dizileme primer bölgesine kadar uzanan) yapay bir kısıtlama enzim bölgesine sahip primerler kullanılarak PCR ile amplifiye edilir ve PCR ürünü Tol2 transpozon vektörüne klonlanır. Tol2 transpozon vektörü, eklenen ifade kasetinin ifadesini yönlendiren her yerde bulunan CAGGS promotörünü içerir. CAGGS promotörü ve ekspresyon kaseti, Tol2 dizileri ile çevrilidir (Şekil 1).
    1. EmGFP-pre-miRNA ekspresyon kasetinin PCR amplifikasyonu: Tablo 3'te açıklanan reaksiyon kurulumunu ve termodöngü koşullarını takip edin.
    2. Jel ile saflaştırılmış PCR ürününü (c. 1.3 kb) restriksiyon enzimi ile sindirilmiş Tol2 transpozon vektörüne bağlayın. Plazmiti yetkin E. coli hücrelerine elektropoze edin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve rekombinantları seçin (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA yapıları).
    3. Plazmidi geleneksel bir maxiprep kiti kullanarak hazırlayın (bkz. Sırasıyla restriksiyon haritalaması ve PCR için kullanılan primerleri kullanarak plazmidin yapısını ve dizisini kontrol edin.

2. Yumurta saklama ve kuluçka

  1. Yerel çiftliklerden veya ticari satıcılardan döllenmiş Beyaz Leghorn (Gallus gallus) yumurtaları satın alın.
    NOT: Yumurtalar, kuluçka sırasında önemli bir canlılık kaybı veya gelişimde gecikme olmaksızın kuluçkadan önce 1 haftaya kadar 12-16 °C'de veya 4 °C'de tutulabilir.
  2. Yumurtaları kuluçka başlangıç tarihi ile etiketleyin ve yumurtanın üst tarafını (embriyonun yerleştirileceği yer) işaretleyin. Embriyolar Hamburger ve Hamilton (HH) evreleri 10 (33-38 saat) -11 (40-45 saat)19'a ulaşana kadar döllenmiş yumurtaları 38 °C'de yatay konumda kuluçkaya yatırın.

3. Ovo elektroporasyonda

  1. Yumurta içi elektroporasyon için hazırlık
    1. % 0.25 hızlı yeşil çözeltinin hazırlanması: 25 mg Hızlı Yeşil FCF (Hızlı Yeşil FCF) 10 mL PBS içinde çözün. Çözeltiyi 0.2 μm'lik bir şırınga filtresi kullanarak filtreleyin. Çözüm RT'de saklanabilir.
    2. DNA kokteyli: Tek tek pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA plazmitlerini (alt adım 1.6.3) Tol2 transpozaz ekspresyon plazmidi (pCAGGS-T2TP vektörü; Malzeme Tablosuna bakınız) (her biri 5 μg/μL) 2:1 oranında karıştırarak enjeksiyon çözeltisini hazırlayın. Enjekte edilen alanı görselleştirmek için 1/10 hacimce %0.25 hızlı yeşil solüsyon ekleyin.
      NOT: Optimum DNA konsantrasyonu yapılara bağlı olarak değişebilir.
    3. Mikroenjeksiyon aparatının kurulması (Şekil 3A,B): Mikroenjeksiyon aparatı aşağıdakilerden oluşur (bkz. Malzeme Tablosu): Hamilton şırınga, 18 G iğne (İğne uzunluğu = 2"), PVC (Polivinil klorür) boru (2 cm uzunluk), Mikropipet iğnesi (Omega nokta lifli kılcal tüpler (1 mm OD X 0,75 mm İç Çap) mikropipet çektirme ile çekilerek yapılabilir).
      1. Bir Hamilton şırıngasını ağır mineral yağ ile doldurun. Şırıngaya 18 G'lik bir iğne takın ve şırınga pistonuna bastırarak iğnenin iç boşluğunu yağla doldurun.
      2. İğnenin ucuna 2 cm uzunluğunda bir PVC boru parçası takın ve boruyu yağla doldurun.
      3. Hortuma çekilmiş bir mikropipet iğnesi takın. Küçük bir açıklık oluşturmak için mikropipet iğnesinin ucunu ince forseps ile 10-20 μm çapında kırın. İğnenin tamamını yağ ile doldurun.
        NOT: DNA çözeltisinin akışını engelleyeceği için sistemde herhangi bir hava kabarcığı sıkışmamasına dikkat edilmelidir.
    4. 5 μL renkli DNA kokteylini (alt adım 3.1.2) steril bir Petri kabına koyun. Diseksiyon mikroskobu altında, mikropipet iğnesinin ucunu steril Petri kabı üzerindeki DNA çözeltisine yerleştirin ve çözeltiyi yavaşça iğneye çekin.
    5. İğnenin içindeki ve dışındaki basınç dengelenene kadar bekleyin (iğnenin içine hava girmesini önlemek için) ve iğnenin ucunu DNA çözeltisinden çıkarın. İğnenin ucunu enjeksiyona kadar küçük bir beherde steril PBS'ye batırılmış halde tutun.
    6. Elektroporasyon aparatının kurulması (Şekil 3A,C):
      1. Bir mikromanipülatörde bir elektrot tutucu ile bir çift platin elektrot ayarlayın. Elektrotların ucu arasındaki boşluğu 2 mm'ye ayarlayın (Şekil 3C,E).
      2. Elektrotları kablolarla bir kare dalga puls üretecine bağlayın (Malzeme Tablosuna bakın).
  2. DNA çözeltisinin mikroenjeksiyonu (Şekil 3D)
    1. Bir tavuk yumurtasını inkübatörden çıkarın ve yumurtanın yüzeyini% 70 etanole batırılmış bir kağıt mendille silin.
    2. 10 mL'lik bir şırıngaya 18 G'lik bir iğne takın. Sarısına zarar vermemek için iğneyi yumurtanın kör ucundan aşağı doğru açılı (45°) geçirin.
    3. Yumurtadan 2-3 mL albümin çekin. Deliği bir parça Scotch bantla kapatın. Yumurtayı ışıkla "kandallayarak" embriyo ve vitellin zarının kabuktan ayrıldığını onaylayın.
    4. Embriyoyu ortaya çıkarmak için makas ve forseps kullanarak yumurtanın üstünden bir parça yumurta kabuğu (2-3 cm çapında daire) çıkarın. Elektroporasyon sırasında embriyoların kurumasını önlemek için herhangi bir zamanda beşten fazla yumurtayı pencereye koymayın.
      NOT: Yumurtayı kırmadan bir pencere açmak zorsa, bir parça yumurta kabuğu çıkarılmadan önce yumurtanın tüm üst kısmı Sellotape veya Scotch bant ile kaplanabilir.
    5. İğnenin ucunu proksimal tarafından optik veziküle 45°'lik bir açıyla sokun ve mavi renkli çözelti lümeni doldurana kadar pistona yavaşça bastırarak (veya üzerine vurarak) DNA kokteylini enjekte edin (Şekil 3D).
      NOT: Alternatif olarak, DNA çözeltilerinin enjeksiyonu için bir basınçlı mikroenjeksiyon sistemi (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılabilir.
    6. İğneyi geri çekin ve ucunu tekrar PBS'ye yerleştirin.
  3. Elektroporasyon (Şekil 3E)
    1. Elektroporatörün darbe parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: Voltaj: 15 V, Darbe uzunluğu: 50 ms, Darbe aralığı: 950 ms, Darbe sayısı: 5
    2. Embriyo üzerindeki vitellin membranına birkaç damla HBSS ekleyin. Embriyonun ön-arka eksenine dik olan mikromanipülatörü kullanarak elektrotları HBSS'ye indirin.
      NOT: Alternatif olarak, albümin verimli elektroporasyona izin veren iyi bir elektrik iletkeni olduğundan, bu prosedür HBSS eklenmeden yapılabilir.
    3. Elektrotları optik vezikülün her iki tarafına (ön (nazal) tarafı ve arka (temporal) tarafı) yerleştirin (Şekil 3E). Elektrotların embriyoya veya kan damarlarına temas etmediğinden emin olun. Darbeli elektrik alanları uygulayın.
    4. Elektrotları çıkarın ve albümin birikimini önlemek için elektrotları suya batırılmış steril bir pamuklu çubukla nazikçe temizleyin.
    5. Pencereyi Scotch bantla kapatın ve embriyoyu istenen gelişim aşamasına kadar yeniden inkübe edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nel'e karşı yapay miRNA'ların ekspresyonu için Tol2 transpozon yapılarının yapımı
Nel (Neural Epidermal büyüme faktörü (EGF)-Like; Nell2 olarak da bilinir) hücre dışı bir glikoproteindir. Trombospondin-1 ile yapısal benzerlikleri vardır ve ağırlıklı olarak sinir sistemindeeksprese edilir 20,21. Nel'in retinal ganglion hücrelerinin15 farklılaşmasını ve sağkalımını düzenlediğini ve retinal aksonlar

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, in ovo elektroporasyon ve Tol2 transpozon sistemi kullanılarak yapay miRNA'ların transgenik ekspresyonu ile gelişmekte olan civciv retinasında gen susturma için ayrıntılı bir kılavuz sağlar.

Bu tekniğin başarılı bir şekilde uygulanmasında aşağıdaki faktörler kritik öneme sahiptir. İlk olarak, sağlam yıkım etkileri uyguladığı onaylanan miRNA dizilerini kullanmak çok önemlidir. Bunları in ovo elektroporasyon için uygulamadan önce, in vitro deneylerde gen b...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

pT2K-CAGGS ve pCAGGS-T2TP vektörleri sırasıyla Yoshiko Takahashi (Kyoto Üniversitesi, Kyoto, Japonya) ve Koichi Kawakami (Ulusal Genetik Enstitüsü, Mishima, Japonya) tarafından sağlanmıştır. Michael Berberoğlu'na makaleyi çok önemli bir şekilde okuduğu için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Royal Society ve Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi'nden (BBSRC) (İngiltere) MN'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
18 G iğne, 2 "VWR89219-320
AP-TAG kit A ve AP-TAG kit BGenHunter CorpQ201 ve Q202AP füzyon proteinleri yapmak için Plazmid vektörleri (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html)
Block-iT RNAi TasarımcısıInvitrogenHedef dizileri seçmek ve miRNA öncesi dizileri tasarlamak için çevrimiçi bir araç (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)
BSA 10 mgSigma-AldrichA2153
C115CB kablolarıSonidelC115CBhttps://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254
C117 kablolarıSonidelC117https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252
Omega nokta lifli kılcal tüpler (Mikropipet iğneleri)FHC30-30-11 mm OD 0,75 mm ID
CUY21 kare dalga elektroporatörNepa GeniCUY21
Dietanolamin (pH 9.8)Sigma-AldrichD8885
Diseksiyon mikroskobu
Yumurta kuluçka makinesiKurlB-Lab-600-110https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html
Elektrot tutucuSonidelCUY580https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85
ElektrotlarNepa GeneCUY611P3-1https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94
Electromax DH10BInvitrogen18290-015Elektroyetkin E. coli hücreleri
Hızlı yeşil FCFSigma-AldrichF7258
Döllenmiş tavuk yumurtası (Gallus gallus)Ticarisatıcılardan (örneğin Charles River) veya yerel çiftçilerden
Deveboynu fiber ışık kaynağı
FuGene 6 transfeksiyon reaktifiPromegaE2691
Hamilton şırınga (50 μ L)Sigma-Aldrich20715Hamilton Cat No  80901
Hanks'in dengeli tuz çözeltisiSigma-AldrichH6648
Ağır mineral yağSigma-Aldrich330760
HEPESGIBCO15630080
L-HomoargininSigma-AldrichH10007
MgCl2Sigma-Aldrich13112
MikromanipülatörNarishige (Japonya)MM3http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html
Mikropipet çektirme DeklanşörAletiP97
p-NitrofenilfosfatSigma-Aldrich20-106
PBSSigma-AldrichD8662
pCAGGS-T2TP vektörüTol2 transpozaz ekspresyon plazmidi. Koichi Kawakami'nin (Ulusal Genetik Enstitüsü, Japonya) cömert bir hediyesi. Ayrıca Addgene'den de temin edilebilir.
PfuThermoFisherF566S
Picospritzer (Opsiyonel)ParkerBasınçlı mikroenjeksiyon sistemi
Plazmid maxi kitiQiagen12163Plazmid maxiprep kiti
pT2K-CAGGS vektörüTol2 transpozon vektörü. Lütfen Yoshiko Takahashi (Kyoto Üniversitesi, Japonya) tarafından sağlanmıştırPVC
boruVWR (İngiltere)228-3830
SpektinomisinSigma-AldrichS9007-5
T4 DNA ligazPromegaM1801
Invitrogenile BLOCK-iT Pol II miR RNA ekspresyon kitiK493600miRNA ekspresyon vektörünü (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), bir kontrol vektörünü (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negatif kontrol plazmidi), aksesuar reaktiflerini ve talimatları içerir (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00)
Termal döngüleyici
elde edilirEmGFP

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).
  2. Funahashi, J., et al. Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer's activity. Development, Growth & Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).
  3. Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. In ovo electroporation methods in chick embryos. Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).
  4. Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference. Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).
  5. Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development, Growth & Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
  6. Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2(2006).
  7. Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
  8. Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces. Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).
  9. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).
  10. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  11. Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Gene. 338 (1), 93-98 (2004).
  12. Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 2 (2), 616-624 (2007).
  13. Kawakami, K., Noda, T. Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells. Genetics. 166 (2), 895-899 (2004).
  14. Hou, X., et al. Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA. Development, Growth & Differentiation. 53, 69-75 (2011).
  15. Nakamoto, C., et al. Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development. Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).
  16. Nakamoto, M., Nakamoto, C. iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. Mao, C. -A. 8, Springer. 91-108 (2020).
  17. BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&title=BLOCK-iT&trade (2021).
  18. Flanagan, J. G., et al. Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos. Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).
  19. Hamburger, V., Hamilton, H. I. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
  20. Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).
  21. Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).
  22. Jiang, Y., et al. In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel. Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).
  23. Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions. Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).
  24. Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue. Development. 146 (4), (2019).
  25. Yee, J. K., et al. Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

In Ovo ElectroporationGene SilencingRetinal DevelopmentMicroRNA KnockdownRetinal Ganglion CellsCell Differentiation

İlgili makaleler