Kimyasal Olarak Modifiye Edilmiş mRNA'nın Memeli Hücrelerine Verilmesi için Lipid Nanopartiküllerinin Kullanılması

Özet

Protokol, kimyasal olarak modifiye edilmiş mRNA'nın in vitro transkripsiyonunu (IVT), katyonik lipozom preparatını ve memeli hücrelerinde lipozom etkin mRNA transfeksiyonlarının fonksiyonel analizini sunar.

Özet

Son yıllarda, kimyasal olarak modifiye edilmiş haberci RNA (mRNA), yeni bir aşı sınıfı, protein replasman tedavileri ve bağışıklık tedavileri dahil olmak üzere çok çeşitli terapötik uygulamalar geliştirmek için güçlü bir nükleik asit molekülü olarak ortaya çıkmıştır. Dağıtım vektörleri arasında, lipid nanopartiküllerinin RNA moleküllerini (örneğin, siRNA, miRNA, mRNA) iletmede daha güvenli ve daha etkili olduğu bulunmuştur ve birkaç ürün halihazırda klinik kullanımdadır. Lipid nanopartikül aracılı mRNA iletimini göstermek için, fonksiyonel me1Ψ-UTP modifiye eGFP mRNA'nın sentezi, katyonik lipozomların hazırlanması, katyonik lipozomlarla mRNA'nın elektrostatik kompleks oluşumu ve memeli hücrelerinde transfeksiyon verimliliklerinin değerlendirilmesi için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Sonuçlar, bu modifikasyonların katyonik lipozomlarla verildiğinde mRNA'nın stabilitesini verimli bir şekilde geliştirdiğini ve memeli hücrelerinde eGFP mRNA translasyon verimliliğini ve stabilitesini artırdığını göstermektedir. Bu protokol, memeli hücrelerinde hedef gen ekspresyonu için istenen mRNA'yı sentezlemek ve katyonik lipozomlarla transfekte etmek için kullanılabilir.

Giriş

Terapötik bir molekül olarak mRNA, plazmit DNA (pDNA^{) ile} karşılaştırıldığında, bütünleştirici olmayan doğası ve mitotik olmayan hücreleri transfekte etme yeteneği nedeniyle çeşitli avantajlar sunar1. mRNA iletimi 1990'ların başında gösterilmiş olmasına rağmen, stabilite eksikliği, immün aktivasyon eksikliği ve zayıf translasyon etkinliği nedeniyle terapötik uygulamalar sınırlıydı². mRNA'da psödouridin 5'-trifosfat (Ψ-UTP) ve metil psödouridin 5'-trifosfat (me1Ψ-UTP) gibi yakın zamanda tanımlanan kimyasal modifikasyonlar, bu sınırlamaların üstesinden gelmeye yardımcı oldu, mRNA araştırmalarında devrim yarattı ve sırayla, mRNA'yı hem temel hem de uygulamalı araştırmalarda umut verici bir araç haline getirdi. Uygulama yelpazesi, aşılama ve gen terapisi için iPSC'lerin oluşturulmasını kapsar ^3,4.

mRNA teknolojisindeki ilerlemeye paralel olarak, viral olmayan taşıyıcı sistemlerdeki önemli ilerlemeler, mRNA'nın dağıtımını etkili hale getirdi ve bu teknolojiyi çoklu terapötik uygulamalar için uygun hale getirdi⁵. Viral olmayan vektörler arasında, lipid nanopartiküllerinin nükleik asitlerin^verilmesinde etkili olduğu bulunmuştur ^6,7. Son zamanlarda Alnylam, kalıtsal transtiretin aracılı amiloidoz (hATTR amiloidoz) için Patisiran ve akut hepatik porfiriler (AHP) için Givosiran dahil olmak üzere karaciğer hastalıklarının tedavisi için lipid bazlı siRNA ilaçlarının FDA onayını ^almıştır8. COVID19 pandemisi sırasında, Pfizer-BioNtech ve Moderna'nın lipid kapsüllü mRNA bazlı aşıları etkinliklerini gösterdi ve FDA onaylarını aldı ^9,10. Bu nedenle, lipid etkin mRNA iletimi büyük bir terapötik potansiyele sahiptir.

Burada, kimyasal olarak modifiye edilmiş, in vitro transkribe edilmiş eGFP mRNA, katyonik lipozom preparasyonu, mRNA-lipid kompleksi optimizasyonu ve memeli hücrelerine transfeksiyonların üretimi için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz (Şekil 1).

Protokol

1. me1 Ψ-UTP modifiye mRNA üretimi

1. İn vitro transkripsiyon (IVT) DNA şablonu hazırlama
   NOT: IVT DNA şablonu (genin T7 promotörü-açık okuma çerçevesi (ORF)) hazırlığı için, ilgilenilen gen için gene özgü bir primer seti tasarlayın. Gen-spesifik ileri primerden önce T7 promotörü (5'-NNNNNNTAATACGACTCACTATAGGGNNNNN-3') dizisini ekleyin.
   1. PCR reaksiyon karışımını Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın.
      NOT: IVT IÇIN IVT DNA ŞABLONU KONSANTRASYONUNU VE KALITESINI ARTıRMAK IÇIN EN AZ DÖRT PCR REAKSIYONU ÇALıŞTıRıN.
   2. Reaksiyon karışımını bir mikropipet ile tamamen karıştırın ve bir mikrofüj kullanarak döndürün.
   3. Tablo 2'de verilen PCR döngü protokolünü bir termocycler üzerinde çalıştırın.
2. IVT DNA şablonunun organik ekstraksiyon/etanol çökeltme ile saflaştırılması
   1. Amplifiye edilmiş PCR reaksiyon karışımını, 200 mL'lik bir mikrofüj tüpünde (nükleaz içermeyen) DEPC ile muamele edilmiş su kullanarak toplam 1.5 μL'ye ayarlayın.
   2. 200 μL TE doymuş fenol / kloroform, pH 8.0 ekleyin. 10 saniye boyunca kuvvetlice girdap.
   3. Fazları ayırmak için 5 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin ve sulu üst fazı (yaklaşık 200 μL) yeni bir 1.5 mL mikrofüj tüpüne aktarın.
   4. 1/10^inci (20 μL) hacimde 3 M sodyum asetat, pH 5.5 ve iki hacim (400 μL)% 99-100 etanol ekleyin. İyice karıştırın ve ardından -20 °C'de en az 30 dakika inkübe edin.
   5. DNA şablonunu 4 ° C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleme ile peletleyin.
   6. Bir mikropipet kullanarak peleti rahatsız etmeden süpernatanı tamamen çıkarın.
   7. Pelete 0,5 mL %75 etanol ekleyin ve 5-10 kez ters çevirin.
   8. 4 ° C'de 12.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin. Daha sonra DNApellet'i bozmadan etanolü bir pipetle tamamen çıkarın.
   9. Pelet biraz yarı saydam hale gelene kadar peletin oda sıcaklığında kurumasını bekleyin.
   10. 20 μL nükleaz içermeyen su ekleyin ve birkaç saniye boyunca iyice yeniden süspanse edin.
3. Saflaştırılmış IVT DNA şablonu için kalite kontrol
   1. Miktar
      1. Bir mikro spektrofotometre kullanarak saflaştırılmış IVT DNA şablonu konsantrasyonunu ve kalitesini ölçün.
         NOT: Beklenen DNA konsantrasyonu 300-600 ng/μL civarında olacaktır. IVT DNA şablonunu uzun süre -20 °C'de saklayın.
   2. DNA agaroz jel elektroforezi
      NOT: Bu deney, saflaştırılmış IVT DNA şablonunun doğru boyutta olup olmadığını ve spesifik olmayan ürün kontaminasyonundan yoksun olup olmadığını doğrulamak içindir.
      1. % 1'lik bir agaroz jeli hazırlamak için, konik bir şişeye 0.5 g agaroz ve 50 mL 1x TAE ekleyin. Agaroz tamamen eriyene kadar mikrodalgada pişirin. Agarozu oda sıcaklığında 5 dakika soğutun.
      2. 50 mL agaroz çözeltisi için 1 μL nükleik asit boyası (SafeView boyası) ekleyin.
      3. Agaroz solüsyonunu taraklı bir jel döküm tepsisine dökün ve jel katılaşana kadar bırakın.
      4. Tarağı jelden çıkarın ve jeli 1x TAE tamponlu tankta tutun.
      5. 10 μL 100-10000 bp DNA merdiveni ve 100-200 ng PCR saflaştırılmış şablon ürününü 2 μL 6x DNA yükleme tamponu ile toplam 12 μL hacme karıştırın.
      6. Her bir numuneyi ilgili kuyucuklara yükleyin ve en az 45-60 dakika boyunca 100 V'ta çalıştırın.
      7. DNA bantlarını bir jel dokümantasyon cihazında görselleştirin (Şekil 2).
4. Me1Ψ-UTP modifiye RNA'nın sentezi
   NOT: Bu deneye başlamadan önce, çalışma alanı (laminer hava akışı) DEPC ile arıtılmış suda %70 etanol ile temizlenmelidir. Steril nükleaz ve endotoksin içermeyen, düşük retansiyonlu tüpler ve filtre bariyer uçları kullanın. Eldivenli ellere sık sık% 70 etanol uygulayın.
   1. IVT reaksiyon karışımını Tablo 3'te verildiği gibi oda sıcaklığında 0.2 mL'lik bir tüpte hazırlayın ve bir mikropipet kullanarak iyice karıştırın.
   2. Tüpü bir mikrofüjde 10 saniye döndürün.
   3. Bir termocycler'da 37 ° C'de 3 saat inkübe edin.
5. IVT DNA şablonunun DNase 1 tedavisi ile bozulması
   1. IVT reaksiyon karışımına 1 μL 1 U / μL DNaz 1 (RNaz içermez) ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
6. Organik ekstraksiyon/amonyum asetat çökeltme ile RNA'nın saflaştırılması
   1. IVT reaksiyon karışımının hacmini 179 μL DEPC ile arıtılmış su ile 200 μL'ye ayarlayın.
   2. 200 μL TE doymuş fenol / kloroform pH 8.0 ekleyin. 10 saniye boyunca girdap yapın.
   3. İki fazı ayırmak için 12.000 x g'da 25 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
   4. Sulu üst fazı (200 μL) 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 200 μL 5 M amonyum asetat ekleyin. İyice karıştırın ve ardından RNA'yı çökeltmek için buz üzerinde 15 dakika inkübe edin.
   5. Çökeltilmiş RNA'yı 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleme ile peletleyin ve süpernatanı bir mikropipet ile tamamen çıkarın.
   6. RNA peletini %70 etanol kullanarak yıkayın ve 5-10 kez ters çevirin. 12.000 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
   7. RNA peletini bozmadan süpernatanı bir mikropipet ile tamamen çıkarın.
   8. Pelet yarı saydam hale gelene kadar peletin oda sıcaklığında kurumasını bekleyin. Daha sonra peleti 60-75 μL RNaz içermeyen suda tekrar süspanse edin.
7. Saflaştırılmış RNA için kalite kontrol
   1. Miktar
      1. Saflaştırılmış RNA konsantrasyonunu ve kalitesini bir mikro spektrofotometre kullanarak ölçün.
         NOT: Beklenen RNA verimi, ilgilenilen genin boyutuna ve IVT DNA şablonunun kalitesine bağlı olarak, reaksiyon başına modifiye edilmemiş RNA için 140-180 μg ve me1ΨUTP modifiye RNA için 100-150 μg olacaktır. En uygun kalite, 1.9-2.0 civarında bir OD₂₆₀ / OD₂₈₀ oranı ve >2.0 OD₂₆₀ / OD₂₃₀ oranı olmalıdır. RNA'yı kısa bir süre için -20 °C'de saklayın.
   2. RNA agaroz jel elektroforezinin denatüre edilmesi
      NOT: Bu deney, sentezlenen RNA'nın doğru uzunlukta olup olmadığını ve IVT yan ürün kontaminasyonundan yoksun olup olmadığını doğrulamak için gerçekleştirilir.
      1. % 1'lik bir agaroz jeli hazırlamak için, konik bir şişeye 0.5 g agaroz ve 50 mL 1x TAE ekleyin. agaroz tamamen eriyene kadar çözeltiyi mikrodalgada ısıtın. Agaroz çözeltisini soğuması için 5 dakika oda sıcaklığında tutun.
      2. 50 mL% 1 agaroz çözeltisi için 1 μL nükleik asit boyası ekleyin.
      3. Agaroz solüsyonunu bir tarakla jel döküm tepsisine dökün ve jel katılaşana kadar bırakın.
      4. Tarağı jelden çıkarın ve jeli 1x TAE tamponlu tankta tutun.
      5. RNA yükleme boya örneğini Tablo 4'te açıklandığı gibi hazırlayın.
      6. Numuneleri 65 °C'de 10 dakika ısıtın ve ardından numuneleri buz üzerinde tutun.
      7. Her numuneyi ilgili kuyucuklara yükleyin ve en az 45-60 dakika boyunca 100 V'ta çalıştırın.
      8. RNA bantlarını bir jel dokümantasyon cihazında görselleştirin (Şekil 3).
8. Me1Ψ-UTP modifiye mRNA'nın enzimatik bazlı kapatma ve poli-A kuyruğu ile sentezi
   NOT: IVT RNA'nın enzimatik yöntem kullanılarak kapatma verimliliği %100'dür. Bu nedenle, bu protokolde mRNA sentezinde Cap-1'in enzimatik kapağını kullandık. mRNA'nın translasyon verimliliğini artırmak için molekül başına >150 A baz uzunluğunda poli-A kuyrukları ekledik.
   1. 55-60 μg saflaştırılmış IVT RNA ekleyin ve 1.5 mL'lik bir tüpte RNaz içermeyen su ile 72 μL'ye kadar çıkarın.
   2. RNA'yı 65 °C'de bir termomikserde 10 dakika boyunca denatüre edin ve ardından tüpü hemen 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
   3. Bu arada, kapatma reaksiyonu karışımını Tablo 5'te gösterildiği gibi hazırlayın.
   4. Denatüre RNA'ya kapatma reaksiyonu karışımını ve 4 μL kapatma enzimini ekleyin ve mikropipet ile iyice karıştırın. Tüpü bir mikrofüjde 10 saniye döndürün.
   5. Reaksiyon karışımını 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
   6. 2 saat sonra tüpü buz üzerinde tutun ve Poly A atık ana karışımını Tablo 6'da verildiği gibi hazırlayın.
   7. Poly A kuyruk ana karışımını kapaklı RNA çözeltisine ekleyin ve mikropipet ile iyice karıştırın. Tüpü bir mikrofüjde 10 saniye döndürün.
   8. Reaksiyon karışımını 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
      NOT: mRNA hemen saflaştırmaya tabi tutulabilir veya ham mRNA gece boyunca -20 °C'de saklanabilir.
9. IVT mRNA saflaştırması
   1. mRNA'yı, protokol bölüm 1.6'da verildiği gibi organik ekstraksiyon/amonyum asetat çökeltme ile saflaştırın.
   2. mRNA peletini 60 μL RNaz içermeyen su ile yeniden süspanse edin.
10. Saflaştırılmış mRNA için kalite kontrol
    1. Protokol bölüm 1.7'de açıklandığı gibi kalite kontrol protokolünü takip edin.
       NOT: mRNA bandı, denatüre edici RNA agaroz jel elektroforezinde Poli-A kuyruğunun eklenmesi nedeniyle RNA bandının üzerinde görünmelidir (Şekil 3). Ayrıca, Poly-A kuyruğu mRNA verimini arttırır (RNA konsantrasyonu > olmalıdır). Kantifikasyondan sonra, 1 μg/μL konsantrasyonda birden fazla mRNA alikotu koyun ve hemen -80 °C'de saklayın. Sentezlenen mRNA'nın bozulmasını önlemek için RNA'nın çoklu donma ve çözülme döngülerinden kaçının.

2. Katyonik lipozomların hazırlanması ve in vitro mRNA transfeksiyon özelliklerinin değerlendirilmesi

1. Lipozom hazırlama
   1. 1 mM katyonik lipozomun hazırlanması için katyonik lipid kullanın: DOPE: 1: 1: 0.5 molar oranında kolesterol.
   2. Katyonik lipid, kolesterol ve DOPE'nin (1,2-dioleoil-sn-gliserol-3-fosfoetanolamin) uygun molar oranlarını bir cam şişede kloroformda (200 μL) çözün.
   3. Solventi çıkarmak için ince bir nem içermeyen nitrojen gazı akışı kullanın.
   4. Kurumuş lipitleri 2 saat boyunca daha fazla kurutma için yüksek vakum altında tutun.
   5. Vakumla kuruduktan sonra kurutulmuş lipitlere 1 mL steril deiyonize su ekleyin ve karışımın gece boyunca şişmesine izin verin.
   6. Çoklu unilamellar veziküller (MUV'ler) yapmak için şişeyi oda sıcaklığında vorteksleyin.
   7. Çoklu unilamellar veziküllerden (MUV'ler) küçük unilamellar veziküller (SUV'lar) yapmak için banyo sonikasyonunu ve ardından 25 W gücünde prob sonikasyonunu kullanın.
      NOT: SUV'lar yarı saydam bir lipozom çözeltisi gibi görünmelidir. Değilse, 30 dakikalık aralıklarla 1 saniyelik darbelerin sayısını açıp kapatın. Hidrodinamik çaplar ve yüzey potansiyelleri bir partikül boyutu analiz cihazında ölçülür (Şekil 4).
2. mRNA/lipozom kompleksi oluşumu ve jel geciktirme testi
   1. 1:1 ila 8:1 arasında farklı lipid-RNA yük oranlarının hazırlanması için, mRNA'yı ve katyonik lipozomu Tablo 7'de verildiği gibi deiyonize suda ayrı ayrı seyreltin.
   2. Seyreltilmiş mRNA'yı Tablo 7'de belirtildiği gibi lipozom çözeltisine karıştırın ve lipoplex oluşumu için oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
   3. Komplekse 20 μL 2x RNA yükleme boyası ekleyin ve kuyuya yükleyin. mRNA tek başına bir kontrol görevi görür.
   4. Numuneleri 1x TAE tamponunda %1'lik bir agaroz jel üzerine yükleyin ve 100 V'ta 45 dakika çalıştırın.
   5. RNA bantlarını bir jel dokümantasyon cihazında görselleştirin (Şekil 5).
3. İn vitro mRNA transfeksiyonu
   1. 48 oyuklu plakanın oyuğu başına 45.000 memeli hücresini tam ortamda tohumlayın ve daha sonra 16 ila 20 saatlik transfeksiyon için 37 ° C'de inkübe edin.
   2. 16 ila 20 saat sonra hücre yoğunluğunu kontrol edin. Transfeksiyon sırasında, hücre birleşmesi yaklaşık% 80 olmalıdır.
   3. 0.5 mL'lik tüplere, serum olmadan DMEM ortamında 1: 1 katyonik lipozom ve mRNA yük oranına sahip 150 ng GFP proteini kodlayan mRNA kompleksi ekleyin. Toplam hacim 20 μL'ye kadar çıkar.
   4. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
   5. Hücrelere lipoplex ekleyin ve 37 °C ve% 5 CO₂ inkübatörde 4 saat inkübe edin.
   6. Hücreleri rahatsız etmeden ortamı çıkarın. Her oyuklu %10 FBS (Tablo 8) içeren 250 μL tam ortam ekleyin.
   7. 72 saatlik transfeksiyondan sonra, floresan mikroskobu altında GFP ekspresyonunu görüntüleyin (Şekil 6, 7).
   8. GFP ekspresyonunu ölçmek için, hücreleri akış sitometresi analizi için işleyin.
   9. Ortamı çıkarın ve 1x PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri tripsinize edin ve bir akış sitometresindeki GFP pozitif hücrelerin yüzdesini ölçmek için hücreleri işleyin.
   10. Lazer 488 kullanarak bir akış sitometresindeki hücreleri elde edin. Canlı popülasyonu bundan çıkarın ve GFP pozitif hücrelerin yüzdesini analiz edin. Ortalama floresan yoğunluğunu (MFI) ölçün (Şekil 6, 7).

Sonuçlar

Me1Ψ-UTP modifiye mRNA üretimi, lipozom hazırlama ve katyonik lipozomlarla çoklu memeli hücrelerine mRNA transfeksiyon deneyleri için protokolü optimize ettik (Şekil 1). mRNA'yı sentezlemek için, memeli kodonu ile optimize edilmiş eGFP IVT şablonu, mEGFP-N1 memeli ekspresyon vektöründen amplifiye edildi ve organik ekstraksiyon/etanol çökeltme yöntemi ile saflaştırıldı (Şekil 2). Daha sonra, IVT işlemi ile me1Ψ-UTP modifiye RNA ve mRNA üretildi. Denatüre edici RN...

Tartışma

Modifiye edilmemiş mRNA'ların terapötik uygulamaları, daha kısa yarılanma ömürleri ve hücre içi doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini aktive etme yetenekleri nedeniyle sınırlı kalmıştır, bu da transfekte edilmiş hücrelerde zayıf protein ekspresyonuna yol açar¹¹. Katalin ve ark. m5C, m6A, ΨU ve me1Ψ-UTP gibi modifiye nükleositler içeren RNA'nın TLR aktivasyonunu önleyebileceğini gösterdi¹². Daha da önemlisi, ΨU veya me1Ψ-UTP'nin IVT mRNA'ya ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agarose	Lonza	50004
Banyo sonikatörü	DNMANM Industries	USC-100
Laboratuvarda			katyonik lipid
Klorofrom	MP biyomedikaller	67-66-3	"Dikkat"
Kolesterol	Himedia	GRM335
DEPC su	SRL BioLit	66886
DMEM	Lonza	12-604F
DNA Merdiven	GeneDireX	DM010-R50C
DOPE	TCI	D4251
EDTA sodyum tuzu	MP biyomedikaller	194822
Etanol	Hayman	F204325	"Dikkat"
fetal sığır serumu	Gibco	10270
Akış sitometrisi	BD	FACS Celesta
Fluroscence Mikroskobu	Leica	MI6000B
Jel dokümantasyon sistemi	Hücre Biyobilimleri	Flurochem E
Buzul asetik asit	Fisher Scientific	85801	"Dikkat"
mEGFP-N1, Memeli ekspresyon vektörü	Addgene	54767
N1-Metilpseudo-UTP	Jena Bioscience	NU-890
Fenol: kloroform: izoamil alkol (25: 24: 1), pH 8.0	SRL BioLit	136112-00-0	"Dikkat"
Fosfat Tampon Salin (PBS), pH 7.4	CellClone	CC3041
Prob sonikatörü	Sonics Vibra Hücreleri	VCX130
RNA merdiveni	NEB	N0362S
RNase inhibitörü	Thermo Scientific	N8080119
SafeView boya	abm	G108
Sodyum asetat	Sigma	S7545
Thermocycler	Uygulamalı biyosistemler	4375786
Thermomixer	Eppendrof	22331
Tris tamponu	SRL BioLit	71033
Tripsin	Gibco	25200056