Drosophila Tükürük Bezlerinde Heterokromatin İlişkili Proteinlerin Görselleştirilmesi için İmmünofluoresan Boyama

Summary

Bu protokol, Drosophila politen hücrelerindeki heterokromatin agregalarını görselleştirmeyi amaçlamaktadır.

Abstract

Heterokromatin agregalarının immünostainleme ile görselleştirilmesi zor olabilir. Kromatin birçok memeli bileşeni Drosophila melanogaster'da korunur. Bu nedenle, heterokromatin oluşumunu ve bakımını incelemek için mükemmel birmodeldir. Üçüncü instar D. melanogaster larvalarının tükürük bezlerinde bulunanlar gibi politenize hücreler, yaklaşık bin kez yükseltilen kromatinleri gözlemlemek için mükemmel bir araç sağlar ve araştırmacıların çekirdekteki heterokromatin dağılımındaki değişiklikleri incelemelerine izin verir. Heterokromatin bileşenlerinin gözlemi doğrudan politen kromozom preparatlarında yapılsa da, bazı proteinlerin lokalizasyonu tedavinin şiddeti ile değiştirilebilir. Bu nedenle, hücrelerde heterokromatin'in doğrudan görselleştirilmesi bu tür bir çalışmayı tamamlar. Bu protokolde, bu doku için kullanılan immünostaining tekniklerini, sekonder floresan antikorların kullanımını ve bu heterokromatin agregalarını daha fazla hassasiyet ve ayrıntıyla gözlemlemek için konfokal mikroskopiyi açıklıyoruz.

Introduction

Emil Heitz^1'inilk çalışmalarından bu yana heterokromatin gen ekspresyonu, kromozomların meiotik ve mitotik ayrılması ve genom stabilitesinin korunması gibi hücresel süreçlerin önemli bir düzenleyicisi olarak kabul edilmiştir^2,3,4.

Heterokromatin esas olarak iki türe ayrılır: karakteristik olarak tekrarlayan dizileri tanımlayan konsitutive heterokromatin ve telomerler ve centromeres gibi belirli kromozom bölgelerinde bulunan transpoze edilebilir elementler. Bu tür heterokromatin esas olarak H3 (H3K9me3) histone 9 lizin di vey....

Protocol

1. Üçüncü instar larva kültürü

1. 100 g maya, 100 g arıtılmamış tam kamış şekeri, 16 g agar, 10 mL propiyonik asit ve 14 g jelatin ekleyerek 1 litre standart ortam hazırlayın. Maya hariç tüm malzemeleri 800 mL musluk suyunda çözün ve ardından mayayı çözün. 30 dakika boyunca hemen otoklavlayın.
   1. Daha sonra, ortamın 60 ° C'ye soğumasını bekleyin ve son konsantrasyona% 0.01 propiyonik asit ekleyin. Jelatin oluşana kadar şişeyi bekletin.
2. 3o instar larva kültürünü optimize etmek için, önce 5 ila 10 günlük yetişkinleri toplayın ve 50 'yi (25 erkek ve 25 kadın) geniş bir boyun standart medya şişesine yerleştirin.
3. Sinekleri içere....

Results

Drosophila tükürük bezlerinde HP1a immünostaininginingin temsili sonuçları Şekil 1'degösterilmiştir. Olumlu bir sonuç, bir odak noktasını gözlemlemektir (Şekil 1a) (heterokromatik agrega veya yoğuşma). Negatif sonuç sinyal veya dağınık sinyal değildir. Bazen çift noktalı, yani çift noktalı (Şekil 1c) çift sinyal gözlenebilir, ancak genellikle daha küçük miktarlarda meydana gelir.

Veri analizi, HP.......

Discussion

Ökaryotik organizmaların hücresel işlevi, kromatin ile farklı proteinler ve RNA dahil olmak üzere çeşitli moleküller arasındaki etkileşimlerle desteklenen çekirdek içindeki 3D yapıyı tanımlayabilir. Son üç yılda, heterokromatin de dahil olmak üzere alaka düzeyi olan biyolojik kondensatlar, aktif ve baskıcı kromatin ^{16 , 17,18'in}ayrı nükleer mekansal organizasyonuna teşvik eden faz ayrımının belirlenmesinde temel bir rol üstlenmi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri	Axygen MCT-150-C	11351904	marka kritik değil
%16 formaldehit	Thermo Scientific	28908
AF1 Citifluor	Ted pella	19470	25 mL
BSA, Moleküler Biyoloji Sınıfı	Roche	10735078001	markası kritik değil
Tam, proteaz inhibitörleri Ultra EDTA içermeyen proteaz inhibitörler	Merck	5892953001
Lamel	Corning	CLS285022-200EA	22x22, marka kritik değil
DTT	Sigma	d9779	marka kritik değil
EDTA	Sigma	E5134	marka kritik değil
EGTA			markası kritik değil
Cam kaydırak	Altın mühür	3011	marka kritik değil
H3BO3	Baker	0084-01	marka kritik değil
H3K9me3	Abcam	8889
HP1a	Hybridoma Bank	C1A9	Ürün Formu  Konsantre 0.1 mL
KCl	Baker	3040-01	marka kritik değil
Methanol	Baker	9070-03	marka kritik değil
NaCl	Sigma	71376	marka kritik değil
NaOH			markası kritik değil
PIPES			markası kritik değil
Rotator	Thermo Scientific	13-687-12Q	Labquake Tüp Çalkalayıcı
Termo Karıştırıcı C	Eppendorf	13527550	SmartBlock 1.5 mL
Tris	Milipore	648311	marka kritik değil
Triton X-100	Sigma	T8787	100 mL, marka kritik değil
ve beta;-merkaptoetanol	Bio-Rad	1610710	25 mL, marka kritik değil