Drosophila Tükürük Bezlerinde Heterokromatin İlişkili Proteinlerin Görselleştirilmesi için İmmünofluoresan Boyama

Özet

Bu protokol, Drosophila politen hücrelerindeki heterokromatin agregalarını görselleştirmeyi amaçlamaktadır.

Özet

Heterokromatin agregalarının immünostainleme ile görselleştirilmesi zor olabilir. Kromatin birçok memeli bileşeni Drosophila melanogaster'da korunur. Bu nedenle, heterokromatin oluşumunu ve bakımını incelemek için mükemmel birmodeldir. Üçüncü instar D. melanogaster larvalarının tükürük bezlerinde bulunanlar gibi politenize hücreler, yaklaşık bin kez yükseltilen kromatinleri gözlemlemek için mükemmel bir araç sağlar ve araştırmacıların çekirdekteki heterokromatin dağılımındaki değişiklikleri incelemelerine izin verir. Heterokromatin bileşenlerinin gözlemi doğrudan politen kromozom preparatlarında yapılsa da, bazı proteinlerin lokalizasyonu tedavinin şiddeti ile değiştirilebilir. Bu nedenle, hücrelerde heterokromatin'in doğrudan görselleştirilmesi bu tür bir çalışmayı tamamlar. Bu protokolde, bu doku için kullanılan immünostaining tekniklerini, sekonder floresan antikorların kullanımını ve bu heterokromatin agregalarını daha fazla hassasiyet ve ayrıntıyla gözlemlemek için konfokal mikroskopiyi açıklıyoruz.

Giriş

Emil Heitz^1'inilk çalışmalarından bu yana heterokromatin gen ekspresyonu, kromozomların meiotik ve mitotik ayrılması ve genom stabilitesinin korunması gibi hücresel süreçlerin önemli bir düzenleyicisi olarak kabul edilmiştir^2,3,4.

Heterokromatin esas olarak iki türe ayrılır: karakteristik olarak tekrarlayan dizileri tanımlayan konsitutive heterokromatin ve telomerler ve centromeres gibi belirli kromozom bölgelerinde bulunan transpoze edilebilir elementler. Bu tür heterokromatin esas olarak H3 (H3K9me3) histone 9 lizin di veya tri-metilasyonu ve Heterokromatin proteini 1a (HP1a)^5,6bağlanması gibi spesifik histone izleri ile epigenetik olarak tanımlanır. Öte yandan, öğretim üyesi heterokromatin kromozomun kollarında lokalize eder ve esas olarak gelişimsel olarak susturulmuş genlerden oluşur^7,8. Metafaz hücrelerindeki heterokromatin bloklarının immünostainasyonu veya ara hücrelerdeki heterokromatin agregalarının gözlemlenmesi, heterokromatik bölgelerin oluşumu ve işlevinin anlaşılmasında çok fazla ışık ortaya çıkarmıştır⁹.

Drosophila'nın bir model sistemi olarak kullanılması, elektron mikroskopisi kullanmadan heterokromatin çalışması için gerekli aletlerin geliştirilmesine izin¹⁰. Pozisyon etkisi değişkenliğinin tanımlanması ve HP1a gibi heterokromatin ilişkili proteinlerin keşfi ve çeviri sonrası değişikliklerden bu yana, birçok grup bu heterokromatik bölgelerin görselleştirilmesine izin veren çeşitli immünohistokimyasal teknikler geliştirmiştir^10,11.

Bu teknikler, heterokromatin ilişkili proteinleri veya histone izlerini tanıyan spesifik antikorların kullanımına dayanmaktadır. Her hücre tipi ve antikor için fiksasyon ve permeabilizasyon koşulları ampirik olarak belirlenmelidir. Ayrıca, ezme teknikleri gibi ek mekanik işlemler kullanılırsa koşullar değişebilir. Bu protokolde, heterokromatik odakları incelemek için Drosophila tükürük bezlerinin kullanımını açıklıyoruz. Tükürük bezleri, genomun 1.000'den fazla kopyasını içeren politenize hücrelere sahiptir, böylece uydu DNA'sı ve çoğaltılmış olan bazı heterokromatik bölgeler hariç, kromatin özelliklerinin çoğunun genişletilmiş bir görünümünü sağlar. Bununla birlikte, heterokromatin bölgeleri politen kromozom preparatlarında kolayca görselleştirilir, ancak kabarma teknikleri bazen karakteristik kromatin bağlı kompleksleri veya kromatin mimarisini bozabilir. Bu nedenle, tüm tükürük bezi dokusundaki proteinlerin immünolokalizasyonu bu istenmeyen etkileri aşabilir. Bu protokolü birkaç kromatin bağlı proteini tespit etmek için kullandık ve mutant Drosophila stokları ile birlikte bu protokolün heterokromatin bozulmasını incelemek için kullanılabileceğini gösterdik¹².

Protokol

1. Üçüncü instar larva kültürü

1. 100 g maya, 100 g arıtılmamış tam kamış şekeri, 16 g agar, 10 mL propiyonik asit ve 14 g jelatin ekleyerek 1 litre standart ortam hazırlayın. Maya hariç tüm malzemeleri 800 mL musluk suyunda çözün ve ardından mayayı çözün. 30 dakika boyunca hemen otoklavlayın.
   1. Daha sonra, ortamın 60 ° C'ye soğumasını bekleyin ve son konsantrasyona% 0.01 propiyonik asit ekleyin. Jelatin oluşana kadar şişeyi bekletin.
2. 3o instar larva kültürünü optimize etmek için, önce 5 ila 10 günlük yetişkinleri toplayın ve 50 'yi (25 erkek ve 25 kadın) geniş bir boyun standart medya şişesine yerleştirin.
3. Sinekleri içeren şişeyi, yumurtlanan yumurta sayısı 50 olana kadar (vahşi tip suş için yaklaşık 12 saat) 25 ° C'de kontrollü bir sıcaklık inkübatörüne yerleştirin.
4. Kuluçka süresi bittikten sonra, yetişkinleri çıkarın ve prosedürü tekrarlamak için yeni bir şişeye aktarın. Embriyoların 72 saat boyunca 18 °C'de büyümesine izin verin
   NOT: Drosophila stok bakım koşulları hakkında daha fazla şey için tennessen > Thymmel^{13'e bakın.}

2. Larva koleksiyonu

1. Larva koleksiyonu için hiç spiracles olmayan gezgin larvaları seçin. Spiracles'ın eversiyondan sonra larva prepupal aşamaya girer ve analiz için uygun mükemmel politen kromozomlarını korur. Sadece 12 saat sonra tükürük bezinin hücreleri programlanmış hücre ölümü için hazırlanmaya başlar^14,15.
2. On beş 3 ° başlangıç larvası alın ve yıkamak için bir saat camına koyun. Ardından bunları buz gibi bir tuzlu su çözeltisine veya PBS'ye aktarın (1x PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, pH'ı 7,4'e ayarlayın).
3. Stereoskopik mikroskop altında proteaz inhibitörleri ile soğuk PBS'de 15 ila 30 çift tükürük bezini (veya 30 dakikada mümkün olduğunca çok) parçalara ayrıştırın. Tükürük bezlerini buz gibi PBS ile 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
4. 1 mL PBS artı proteaz inhibitörleri ile bir kez yıkayın. Dokunun tüpün dibine ulaşmasını bekleyin.
5. Yıkamadan sonra PBS'yi 1000 μL pipetle çıkarın. Dokuya dokunmamaya dikkat edin.
   1. Alternatif olarak, bu yıkama adımına olan ihtiyacı ortadan kaldırmak için tükürük bezlerini 5 mL PBS'de parçalara ayrıştırın ve tükürük bezlerini aşağıda açıklanan Ruvkun sabitleme tamponunun 0,5 mL'sine aktararak 3.

3. Tükürük bezi doku fiksasyonu

1. PBS'yi son adımdan çıkardıktan sonra, doğrudan% 50 metanol (0.5 mL metanol ekleyin) ve% 2 formaldehit ile 0.5 mL 1x Ruvkun sabitleme tamponu ekleyin.
   NOT: 2x Ruvkun çözeltisi 160 mM KCl, 40 mM NaCl, 20 mM EGTA, pH 7.4'te 30 mM BORULAR'dır.
2. Hafif dönüş ile 4 °C'de 2 saat kuluçkaya yaslanın.

4. Tükürük bezi doku yıkama

1. 1 mL Tris/Triton tamponu (100 mM Tris pH 7,4, %1 Triton X-100 ve 1 mM EDTA) ile 5 dakikalık bir dönüş yıkaması gerçekleştirin.
   NOT: Dokunun tüpün altına ulaşmasını bekleyin.

5. Permeabilizasyon

1. Tükürük bezlerini 1 mL Tris/Triton X-100'de kuluçkaya yatırın (yukarıdakiyle aynı). Bazı proteinler için% 1 β-mercaptoethanol eklemek gerekebilir.
2. Hafif sallama (300 rpm) ile 37 ° C'de 2 saat kuluçkaya yaslanın.

6. Koruma adımı (isteğe bağlı)

NOT: Antikor ile hemen inkübasyona devam etmiyorsanız, dokuyu aşağıdaki gibi koruyun.

1. 1 mL BO₃ tamponu (0,01 M H₃BO₃ pH 9,2 + 0,01 M NaOH) ile yıkayın ve ardından₃₇° C'de BO 3 /10 mM DTT'de hafif sallanarak (300 rpm) 15 dakika kuluçkaya yatırın.
2. Kuluçka süresinin sonunda, sadece 1 mL BO₃ tamponu ile bir yıkama gerçekleştirin.
   NOT: Dokunun tüpün altına ulaşmasını bekleyin.
3. 1 mL PBS ekleyin. Bu çözeltideki dokuyu 4 °C'de 72 saate kadar koruyun ve ardından bir sonraki adıma geçin. Bu adım, gecikmiş bir yaşam döngüsü sunabilecek farklı mutant suşlarıyla çalışırken özellikle yararlıdır, bu nedenle immünodeteksiyon kontrollerle birlikte aynı anda gerçekleştirilebilir.

7. Doku engelleme

1. Tükürük bezlerini 1 mL Tampon B'de (PBS + % 0.1 BSA + % 0.5 Triton X-100 + 1 mM EDTA) oda sıcaklığında 2 saat boyunca rotasyonla kuluçkaya yatırın.

8. İmmünasyon

1. Tüm B tamponlarını çıkarın ve A tamponu (PBS + % 0.1 BSA) artı faiz antikoru ekleyin.
   NOT: Hybridoma Bank'tan 1:3000'e kadar HP1a C1A9c (konsantre antikor) kullanıyoruz. C1A9'ları (supernatant) kullanırken 1:100 ila 1:500 seyreltmeyi denedik ve bu rütbe arasındaki herhangi bir seyreltme iyi çalışıyor) bir gecede 4 oC'de rotasyonla. Bu noktada, titremenin antikora zarar verebilecek kabarcıkları yükseltmemesi önemlidir.

9. İmmünasyon yıkama

1. Her seferinde 1 mL kullanarak oda sıcaklığında karıştırma altında B tamponu ile 3 x 15 dakikalık yıkamalar gerçekleştirin.
2. Bezleri B tamponu ile birlikte ikincil antikor ile birlikte 4 oC'de dönme altında 2 saat boyunca bir florofora aktarın (ikincil antikor Alexa flor 568 Invitrogen 1:3000 kullanıldı).
   1. İkincil antikorun ışıktan korunması için tüpü alüminyum kağıt folyo ile örtün.
3. 1 mL Tampon B ile rotasyon sırasında oda sıcaklığında 2 x 15 dakikalık yıkamalar gerçekleştirin.
4. Sytox (2 μL 5 mM stok alın ve 1 mL Tampon B'de çözün) veya Hoechst (10 mg/mL stokun 1 μL'sinde alın ve 1 mL Tampon B'de çözün) gibi bir DNA işaretleyicisi ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca rotasyonla inkübte edin.
5. B Tamponu ile bir yıkama yapın ve PBS ile bir kez, her biri oda sıcaklığında dönerken 10 dakika süren yıkama.
   NOT: Işıktan korumayı unutmayın.

10. Görüntüleme

1. Tükürük bezlerini bir kaydırağa monte edin, kapaklı bir havuz haline getirin.
2. Tükürük bezlerini havuzun ortasına koyun ve viskoz sıvıyı her yere uzatan kabarcıkların oluşumunu önlemek için AF1 citifluor ile örtün. Sonra tüm tarafları açık oje ile kapatın.
3. Floresan veya konfokal mikroskop altında gözlemleyin. Numune aynı gün gözlemlenmeyecekse, 4 °C'de ışıktan uzak durun.
4. Tüm grafikleri ve istatistiksel analizleri oluşturmak için GraphPad Prism 6'yı kullanın.
5. Kruskal-Wallis testini kullanarak tükürük bezlerindeki HP1a dağılımından elde edilen verileri analiz edin. İstatistiksel önem (p < 0.05*, < 0.01 **, < 0.001***, < 0.0001**** olarak belirlendi.

Sonuçlar

Drosophila tükürük bezlerinde HP1a immünostaininginingin temsili sonuçları Şekil 1'degösterilmiştir. Olumlu bir sonuç, bir odak noktasını gözlemlemektir (Şekil 1a) (heterokromatik agrega veya yoğuşma). Negatif sonuç sinyal veya dağınık sinyal değildir. Bazen çift noktalı, yani çift noktalı (Şekil 1c) çift sinyal gözlenebilir, ancak genellikle daha küçük miktarlarda meydana gelir.

Veri analizi, HP...

Tartışma

Ökaryotik organizmaların hücresel işlevi, kromatin ile farklı proteinler ve RNA dahil olmak üzere çeşitli moleküller arasındaki etkileşimlerle desteklenen çekirdek içindeki 3D yapıyı tanımlayabilir. Son üç yılda, heterokromatin de dahil olmak üzere alaka düzeyi olan biyolojik kondensatlar, aktif ve baskıcı kromatin ^{16 , 17,18'in}ayrı nükleer mekansal organizasyonuna teşvik eden faz ayrımının belirlenmesinde temel bir rol üstlenmi...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri	Axygen MCT-150-C	11351904	marka kritik değil
%16 formaldehit	Thermo Scientific	28908
AF1 Citifluor	Ted pella	19470	25 mL
BSA, Moleküler Biyoloji Sınıfı	Roche	10735078001	markası kritik değil
Tam, proteaz inhibitörleri Ultra EDTA içermeyen proteaz inhibitörler	Merck	5892953001
Lamel	Corning	CLS285022-200EA	22x22, marka kritik değil
DTT	Sigma	d9779	marka kritik değil
EDTA	Sigma	E5134	marka kritik değil
EGTA			markası kritik değil
Cam kaydırak	Altın mühür	3011	marka kritik değil
H3BO3	Baker	0084-01	marka kritik değil
H3K9me3	Abcam	8889
HP1a	Hybridoma Bank	C1A9	Ürün Formu  Konsantre 0.1 mL
KCl	Baker	3040-01	marka kritik değil
Methanol	Baker	9070-03	marka kritik değil
NaCl	Sigma	71376	marka kritik değil
NaOH			markası kritik değil
PIPES			markası kritik değil
Rotator	Thermo Scientific	13-687-12Q	Labquake Tüp Çalkalayıcı
Termo Karıştırıcı C	Eppendorf	13527550	SmartBlock 1.5 mL
Tris	Milipore	648311	marka kritik değil
Triton X-100	Sigma	T8787	100 mL, marka kritik değil
ve beta;-merkaptoetanol	Bio-Rad	1610710	25 mL, marka kritik değil