Yöntem makalesi

Global ve Yüksek Güvenilirlikli Protein R-Metilasyon Analizi için Kütle Spektrometrisine Dayalı Proteomik Yaklaşım

DOI:

10.3791/62409

⸱

28 Nisan 2022

 ,  ,  , 
1Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology IRCCS (IEO), 2European School of Molecular Medicine (SEMM), c/o Campus IFOM-IEO

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein Arginin ( R ) -metilasyonu, çoklu biyolojik yolları düzenleyen geniş çaplı bir translasyonel sonrası modifikasyondur. Kütle spektrometresi, modifiye peptid zenginleştirme için biyokimyasal yaklaşımlarla birleştirildiğinde, R-metil-proteomun küresel profilini çıkarmak için en iyi teknolojidir. İnsan hücrelerinde küresel R-metilasyonun yüksek güvenilirlikle tanımlanması için tasarlanan iş akışı burada açıklanmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein Arginin ( R ) -metilasyonu, RNA işleme, sinyal iletimi, DNA hasar yanıtı, miRNA biyogenezi ve translasyon dahil olmak üzere çeşitli hücresel yolakların düzenlenmesinde rol oynayan yaygın bir protein post-translasyonel modifikasyonudur (PTM).

Son yıllarda, biyokimyasal ve analitik gelişmeler sayesinde, kütle spektrometresi (MS) bazlı proteomikler, hücresel metil-proteomu tek bölge çözünürlüğü ile karakterize etmek için en etkili strateji olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, MS tarafından in vivo protein R-metilasyonunun tanımlanması ve profillenmesi, esas olarak bu modifikasyonun substokiyometrik doğası ve çeşitli amino asit ikamelerinin varlığı ve metilasyona izobarik olan asidik kalıntıların kimyasal metil-esterifikasyonu nedeniyle zor ve hataya açık olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, R-metil-peptitlerin tanımlanmasını arttırmak için zenginleştirme yöntemleri ve metil-proteomik çalışmalarda Yanlış Keşif Oranlarını (FDR) azaltmak için ortogonal doğrulama stratejileri gereklidir.

Burada, hücresel örneklerden yüksek güvenilirliğe sahip R-metil-peptitlerin tanımlanması ve kantitasyonu için özel olarak tasarlanmış bir protokol tanımlanmıştır; bu, hücrelerin metabolik etiketlemesini, ağır izotop kodlu Metiyonin (hmSILAC) ve tüm hücre ekstraktının çift proteaz çözelti içi sindirimi ile birleştiren, ardından anti-pan-R-metil antikorları kullanılarak R-metil-peptitlerin çevrimdışı Yüksek pH Ters Faz (HpH-RP) kromatografi fraksiyonasyonu ve afinite zenginleştirmesi ile eşleştirilmiştir. Yüksek çözünürlüklü MS analizi üzerine, ham veriler önce MaxQuant yazılım paketi ile işlenir ve sonuçlar daha sonra MaxQuant çıktı dosyalarındaki hafif ve ağır metil-peptide karşılık gelen MS tepe çiftlerinin derinlemesine araştırılması için tasarlanmış bir yazılım olan hmSEEKER tarafından analiz edilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arginin ( R ) -metilasyon, memeli proteomunun yaklaşık% 1'ini süsleyen bir translasyonel modifikasyondur (PTM)1. Protein Arginin Metiltransferazlar (PRMT'ler), R'nin yan zincirinin guanidinos grubunun azot (N) atomlarına simetrik veya asimetrik bir şekilde bir veya iki metil grubunun birikmesiyle R-metilasyon reaksiyonunu katalize eden enzimlerdir. Memelilerde, PRMT'ler hem mono-metilasyon (MMA) hem de asimetrik di-metilasyon (ADMA), MMA ve simetrik di-metilasyon (SDMA) veya sadece MMA'yı biriktirme yeteneklerine bağlı olarak üç sınıfa ayrılabilir - sırasıyla 2,3. PRMT'ler esas olarak G....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre kültürü ve protein ekstraksiyonu (zaman: 3 - 4 hafta gerekli)

  1. HeLa hücrelerini, sırasıyla Hafif (L) veya Ağır (H) Metiyonin ile sağlanan ortamlarda paralel olarak büyütün (ortam bileşimi için Tablo 1'e bakınız). En az sekiz hücre bölünmesi üzerine, her SILAC kanalından bir hücre aliquot toplayın ve birleştirme testini gerçekleştirin.
    NOT: Birleştirme verimliliğini kontrol etmek için, LC-MS/MS analizi ile Ağır kanaldaki ağır Metiyonin (Met-4) yüzdesinin mümkün olduğunca %100'e yakın olduğunu test edin. Ağır etiketli hücrelerin bir aliquot'unu LC-MS/MS ile analiz edin (ayarlar için Tablo 2'ye bakın), ardından

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makalede, protein ekstraktının enzimatik sindiriminin paralel olarak iki ayrı proteaz ile kombinasyonuna dayanan küresel protein R-metilasyonunun yüksek güvenilirlikte tanımlanması için bir iş akışı anlatılmaktadır, bunu proteolitik peptitlerin HpH-RP sıvı kromatografisi fraksiyonasyonu ve R-metil-peptidlerin anti-pan-R-metil antikorları ile immüno-afinite zenginleştirmesi izlemektedir (Şekil 1).

Hücreler, doğal (Hafif, L, Met-0) veya izotopik olarak etiketlenmiş .......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Global MS bazlı proteomikler tarafından in vivo protein/peptit metilasyonunun yüksek güvenilirlikle tanımlanması, yüksek FDR riski nedeniyle, metilasyona izobarik olan ve ortogonal MS doğrulama stratejilerinin yokluğunda yanlış atamalara neden olabilen numune hazırlama sırasında meydana gelen çeşitli amino asit ikameleri ve metil-esterifikasyonu ile zordur. Bu PTM'nin substokiyometrik doğası, küresel metil-proteomiklerin görevini daha da karmaşıklaştırır, ancak modifiye peptidlerin seçici zenginleştirilmesiyle ü.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MM ve EM, Avrupa Moleküler Tıp Okulu (SEMM) bünyesindeki doktora öğrencileridir. EM, 3 yıllık FIRC-AIRC bursunun sahibidir (Proje Kodu: 22506). TB grubundaki R-metil-proteomların küresel analizleri AIRC IG Hibe (Proje Kodu: 21834) ile desteklenmektedir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Amonyum Bikarbonat (AMBIC)Sigma-Aldrich09830
Amonyum Persülfat (APS)Sigma-Aldrich497363
C18 Sep-Pak kolonları vacc 6cc (1g)SularWAT036905
Kolloidal Coomassie boyama AnındaSigma-AldrichISB1L-1L
cOmplete Mini, EDTA içermeyenRoche-Sigma Aldrich11836170001Proteaz İnhibitörü
Diyalize Fetal Sığır Serumu (FBS)GIBCO ThermoFisher26400-044
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich3483-12-3
DMEM OrtaGIBCO ThermoFishertalep edildi  stabil glutamin ile ve metiyonin içermez
EASY-nano LC 1200 kromatografi sistemiThermoFisher
EASY-Spray HPLC SütunlarıThermoFisherES907
GlyceroloSigma-AldrichG5516
HeLa hücreleriATCCATCC CCL-2
HEPESSigma-AldrichH3375
İyodoasetamid (IAA)Sigma-Aldrich144-48-9
Jüpiter C12-RP sütunuPhenomenex00G-4396-E0
L-MetioninSigma-AldrichM5308Hafif (L) Metionin
L-Metionin- (metil-13C, d3)Sigma-Aldrich299154Ağır (H) Metionin
LysargiNaseMerck Millipore EMS0008
Mikrotip Hücre Bozucu Sonifier 250Branson
N, N, N & prime;, N & prime; -Tetrametiletilendiamin (TEMED)Sigma-AldrichT9281
Penisilin-StreptomisinGIBCO ThermoFisher15140122
PhosSTOPRoche-Sigma Aldrich4906837001Fosfataz İnhibitörü
Pierce C18 UçlarıThermoFisher87782
Pierce % 0.1 Formik Asit (v / v) Asetonitril, LC-MS SınıfıThermoFisher85175LC-MS Solvent B
Pierce  Suda% 0.1 Formik Asit (h / v), LC-MS SınıfıThermoFisher85170LC-MS Solvent A
Pierce  Asetonitril (ACN), LC-MS SınıfıThermoFisher51101
Pierce  Su, LC-MS SınıfıThermoFisher51140
PoliakrilamidSigma-Aldrich92560
Precision Plus Protein  Tüm Mavi Boyalı Protein StandartlarıBio-Rad1610373
PTMScan antikorları α-ADMAHücre Sinyalizasyon Teknolojisi13474
PTMScan antikorları α-MMAHücre Sinyalizasyon Teknolojisi12235
PTMScan antikorları α-SDMAHücre Sinyalizasyon Teknolojisi13563
Q Exactive HF Hibrit Dört Kutuplu-Orbitrap Kütlesi SpektrometreThermoFisher
Sıralama Sınıfı Modifiye TripsinPromegaV5113
Trifloroasetik asitSigma-AldrichT6508
Ultimate 3000 HPLCDionex
ÜreSigma-AldrichU5378
Vakum Konsantratörü 5301EppendorfHız vac

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
  2. Blanc, R. S., Richard, S.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Protein Arginin MetilasyonuK tle Spektrometrisi ProteomikR Metil PeptitlerTranslasyon Sonras ModifikasyonMetabolik aretlemeY ksek pH Ters FazAfinite Zenginle tirmemmunoafinite Safla t rmaTripsin SindirimiLysargiNase Sindirimi

İlgili makaleler