Aort Kapak In Vitro Kalsifikasyonu Çalışmak için Fare Interstisyel Kapak Hücrelerinin İzolasyonu

Özet

Bu makalede, fare aort kapak hücrelerinin iki adımlı bir kollajenaz prosedürü ile izolasyonu açıklanmaktadır. İzole fare valf hücreleri, bu in vitro kireçlenme tahlilleri gibi farklı tahlillerin yapılması ve aort kapak mineralizasyonuna yol açan moleküler yolların araştırılması için önemlidir.

Özet

Aort kapak hücrelerinin kireçlenmesi aort darlığı ayırt edici özelliğidir ve kapak cusp fibrozisi ile ilişkilidir. Kapak geçiş hücreleri (VC'ler), aort darlığında kireçlenme sürecinde osteoblast benzeri hücrelere ayırıcı programlarının aktivasyonu ile önemli bir rol oynar. Fare VIC'leri, aort kapak hücresinin mineralizasyonunu yönlendiren sinyal yollarının aydınlatılması için iyi bir in vitro araçtır. Burada açıklanan yöntem, bu yazarlar tarafından başarıyla kullanılan, taze izole hücrelerin nasıl elde edildiğini açıklar. 1 mg/mL ve 4.5 mg/mL ile iki aşamalı kollajenaz işlemi yapıldı. İlk adım, endotel hücre tabakasını çıkarmak ve herhangi bir kirlenmeyi önlemek için çok önemlidir. İkinci kollajenaz inkübasyonu, VC'lerin dokudan plakaya geçişini kolaylaştırmaktır. Ayrıca izole edilmiş fare valf hücrelerinin fenotip karakterizasyonu için bir immünofluoresans boyama prosedürü tartışılmıştır. Ayrıca kalsiyum reaktif ölçüm işlemi ve alizarin kırmızısı lekelenme kullanılarak kireçlenme tahlil in vitro olarak gerçekleştİrilmiştir. Fare kapak hücresi birincil kültürünün kullanımı, hücre mineralizasyon in vitrosunu inhibe etmek için yeni farmakolojik hedeflerin test edilmesi için gereklidir.

Giriş

Kireçlenmiş aort kapak hastalığı (CAVD), 65 yaş üstü yaşlı bireylerin yaklaşık% 2,5'ini etkileyen batı popülasyonlarında en yaygın valvüler kalp^{hastalığıdır.} CAVD altı milyondan fazla Amerikalıyı etkiler ve normal kan akışını bozan broşürlerin mekanik özelliklerindeki değişikliklerle ilişkilidir^1,2. Şu anda hastalığın ilerlemesini durdurmak veya mineral gerilemesini aktive etmek için farmakolojik bir tedavi yoktur. CAVD tedavisinde tek etkili tedavi cerrahi veya transktheter aort kapak replasmanı ile aort kapak değişimi^{3' dür.} Bu nedenle, yeni farmakolojik hedefleri belirlemek için kapak mineralizasyonuna yol açan moleküler mekanizmaların araştırılması zorunludur. Gerçekten de, tedavi edilmeyen aort darlığı sol ventrikül disfonksiyonu ve kalp yetmezliği gibi birkaç olumsuz sonucu vardır⁴.

Aort kapakçığı fibrosa, spongiosa ve ventrikülaris olarak bilinen ve vic'leri baskın hücre tipi⁵olarak içeren üç katmandan oluşur. Fibrosa ve ventriküller bir damar endotel hücreleri (VC) tabakası ile kaplıdır⁵. GC'ler, enflamatuar hücrelerin ve parakrin sinyallerin geçirgenliğini düzenler. Artan mekanik stres, VC'lerin bütünlüğünü etkileyebilir ve aort kapakçığının homeostazını bozabilir ve enflamatuar hücre istilasına yol açabilir⁶. Taramalı elektron mikroskopi analizleri, insan kireçlenmiş aort kapağında endotelin bozulduğunu göstermiştir^7.

Kireçlenmiş dokunun histolojik analizleri osteoblastların ve osteoklastların varlığını ortaya koymaktadır. Ayrıca, VC'lerin osteojenik farklılaşması hem in vitro hem de insan kapak dokusunda gözlenmiştir^8. Bu işlem esas olarak Runt ile ilgili transkripsiyon faktörü 2 (Runx2) ve kemik morfogenetik proteinleri (BMP'^{ler) 8,9}tarafından düzenlenir.

Protokol

NOT: Burada açıklanan tüm hayvan prosedürleri Mount Sinai kurumsal çekirdek ve kullanım komitesinde Icahn Tıp Fakültesi tarafından onaylanmıştır.

1. Yetişkin farelerden valf hücresi izolasyonundan önce hazırlık

1. Şekil 1A'da gösterilen tüm cerrahi aletleri % 70 v/v etanol kullanarak ve daha sonra 30 dakika boyunca otomatik olarak kapatarak temizleyin ve sterilize edin.
2. 10 mm HEPES'in 50 mL'sine 500 μL penisilin-streptomisiin ekleyin. 50 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) aliquot hazırlayın. Çözümleri buzda tut.
3. 1 mg/mL ve 4,5 mg/mL kollajenaz çözeltileri hazırlayın ve tüm prosedürü gerçekleştirmek için 15 mL tüplerde her çözeltinin 5 mL'lik kısmını kullanın. 5 mL 1 mg/mL kollajenaz hazırlamak için, 5 mg kollajenazı 2,5 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM, fetal sığır serumu (FBS) ve antibiyotiklerle desteklenmiş 10 mM HEPES'in 2,5 mL'si (1,2 adımdan %1 penisilin-streptomisin) ile karıştırın. Kontaminasyonu gidermek için çözeltileri 0,22 μm filtreden filtreleyin.
   NOT: Enzimleri korumak için çözeltileri buzda tutun.
4. Aşağıda açıklanan tüm adımlarda kullanmadan önce DMEM sokmasını 37 °C'ye ısıtın. DMEM'i %1 penisilin-streptomisin, %1 sodyum piruvat, 5 mL 200 mM L-glutamin, 1 mL mikoplazma eliminasyon reaktifi (Bkz. Malzeme Tablosu)ve %10 FBS ile destekleyerek tam orta hazırlayın.

2. Valf hücrelerinin izolasyonu

1. Deney için^{10 6} hücre elde etmek için, beş 8 haftalık fare kullanın (en az üç). Fareyi 1 mL izofluran ile ıslatılmış küçük bir kağıt parçasıyla birlikte bir indüksiyon odasına yerleştirin, ancak dokuyla temasa izin vermeyin. Hayvanın tamamen uyuşturuldığını onaylamak için; parmak sıkışma refleksini kontrol edin ve sonra fareyi servikal çıkık ile ötenazileyin. Aşağıda açıklanan prosedür terminal olduğu için servikal çıkık öncesinde herhangi bir ağrıyı hafifletmek için izofluran kullanın.
2. Fareyi bir diseksiyon platformuna yerleştirin ve yerinde tutmak için pençeleri canüllerle sabitle. Göğsü ve karnı etanol ile temizleyin; karnı ve göğsü makasla açın. Küçük cerrahi makasla, fareyi çıkarmak için sol kulakçık ve sol ventrikül arasında kesin. Kalpteki kanı çıkarmak için kalbi 10 mL soğuk 1x PBS ile perfuse edin.
3. Kalbi kesin ve Şekil 1B'degösterildiği gibi yükselen aorttan 3 mm uzak tutun. Aort kapağını stereomikroskop altında parçalara ayırın. Kalbi ventriküllerin ortasında yatay olarak kesin (Şekil 1C). Sol ventrikülü aorta doğru kesin ve aort kapağını dikkatlice kesin (Şekil 1D-F). Vanaları 35 mm'lik küçük bir doku kültürü çanağını bir araya getirin.
4. İzole vanaları 75 mm hücre kültürü çanağını antibiyotiklerle (%1 penisilin-streptomisinin) desteklenmiş 5 mL soğuk HEPES (10 mM) ile yıkayın (Şekil 2). Adım 1.3'te yukarıda açıklandığı gibi iki adet 15 mL kollajenaz 1 mg/mL ve 4.5 mg/mL tüpü hazırlayın.
   NOT: Diseksiyondan sonra, kontaminasyonu en aza indirmek için steril bir biyogüvenlik başlığındaki izole vanaları manipüle edin.
5. Kollajenaz tip I'deki (1 mg/mL) kapakçıkları 37 °C'de 30 dakika boyunca sürekli sallanarak kuluçkaya yatırın(Şekil 2). Tüpü 150 × g'da5 dakika santrifüj, peletin bir kez 2 mL HEPES (10 mM) ve girdabı yüksek hızda 30 sn ile yıkayın. Bu tüpün içeriğini 35 mm'lik bir kültür kabına dökün ve ince cımbız kullanarak doku parçalarını dikkatlice yeni bir tüpe aktarın.
   NOT: Bu aşamada, VC'ler hala dokudan ayrışmamış ve pelet doku parçaları içerir. Endotel hücreleriyle kirlenmeyi önlemek için, 2.5.
6. Peleti 35 dakika boyunca sürekli ajitasyon altında 37 °C'de 5 mL kollajenaz tip I (4.5 mg/mL) ile 15 mL'lik bir tüpte kuluçkaya yatırın. Hücreleri ayırmak için 1 mL pipetle hücreleri yeniden askıya alın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 150 × g'da santrifüj.
7. Üstnatantı atın ve peletin 2 mL'lik komple DMEM'de yeniden askıya alın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 150 × g'da santrifüj. Hücreleri temizlemek için bu adımı iki kez yineleyin.
   NOT: Pelet hala bazı doku parçalarına sahip olacaktır.
8. Peletin 1 mL'lik tam orta alanda yeniden askıya alın ve hücreleri kültür çanasına bağlanmalarını kolaylaştırmak için minimum miktarda 6 kuyulu bir hücre kültürü kabının bir kuyusunda plakalayın. Hücreleri bozulmadan% 5 karbondioksitli 37 °C inkübatörde bırakın.
9. 3 gün sonra, doku kalıntılarına yakın iyi büyümeyi doğrulamak için mikroskop altındaki hücreleri kontrol edin. Mikroskop altında 1.000 hücre göründüğünde, doku kalıntılarını otomatik kapatılmış cımbızla dikkatlice çıkarın ve ortamı değiştirin.
   NOT: Plaka bozulmamalıdır; gerekli sayıda hücre gözlenmezse, hücre kültürü çanağı 2 gün daha inkübatöre geri yerleştirin.
10. Hücreler% 70 birleştiğinde (2.5 × 10⁵), trypsinize ve daha sonra 75 mm doku kültürü çanağında aktarın.

3. Hücre kimliğinin ve morfolojisinin analizi

NOT: Hücre morfolojisi ve endotel hücre kontaminasyonunda immünofluoresans lekeleme kullanıldı.

1. Kaputu %70 v/v/ etanol ile temizleyin. Steril kapakları (22 mm x 22 mm) 6 kuyulu plakalara yerleştirin.
   NOT: Kapakları sterilize etmek için% 70 etanol ile yıkayın ve ultraviyole ışık altında gece boyunca kaputta saklayın.
2. Tohum 6 kuyulu bir tabakta kuyu başına 100.000 hücre. 24 saat sonra, hücreleri 1x PBS'de iki kez yıkayın ve 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehitte (PFA) sabitlayın. Hücreleri 1x PBS ile iki kez tekrar yıkayın.
   NOT: Bu noktada, hücreler boyama işlemi başlayana kadar PBS'de 4 °C'de tutulabilir.
3. VC'lerin saflığını doğrulamak için, GC'lerle kontaminasyonu tespit etmek için alfa-düz kas aktinin (αSMA), vimentin ve farklılaşma kümesi 31 (CD31) kullanın.
4. 500 μL normal serum (ikincil antikorla aynı tür), 9,5 mL 1x PBS ve 30 μL Triton X-100 karıştırarak bir bloklama tamponu aliquot hazırlayın. Hücreleri 1 saat boyunca engelleme arabelleği 2 mL'de kuluçkaya yatırın.
5. 30 μL Triton X-100, 10 mL 1x PBS ve 0,1 g sığır serum albümini (BSA) içeren antikor seyreltme tamponunu hazırlayın.
6. Boş bir uç kutusu alın, nemli bir oda oluşturmak için kutunun yarısını suyla doldurun. Uç tutucuyu ıslak bir doku ve ardından bir parafilm tabakası ile örtün.
7. Birincil antikorun 1 μL'sini alın ve 3,5 adımda hazırlanan seyreltme tamponunun 100 μL'si ile karıştırın. Seyreltilmiş antikorun 50 μL'sini parafilme yerleştirin. Kapakları kuyulardan alın, ters çevirin ve antikor damlalarının üzerine yerleştirin; hücreleri antikorla bir gecede kuluçkaya yatır.
8. 6 kuyulu plakaya 1 mL PBS ekleyin. Kapak kapağını parafilmden dikkatlice çıkar, ters çevirin ve kuyuya yerleştirin. Hücreleri 5 dakika boyunca sürekli nazik bir ajitasyonla yıkayın. PBS'i taze PBS ile değiştirin; hücreleri 3 kez yıkayın.
9. Hücreleri seyreltilmiş ikincil antikorla (1/500) (Alexa-488, Alexa-555) 1 saat kuluçkaya yatırın. Antikor seyreltme tamponunun 500 μL'sine ikincil antikorun 1 μL'sini ekleyin (adım 3.5'te hazırlanır). Plakayı alüminyum folyo ile örtün. Hücreleri 1 mL 1x PBS ile 3 kez sürekli ajitasyonla yıkayın.
10. Kapakları 50 μL 4′, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) montaj ortamı ile monte edin ve hücrelerin morfolojisini ve VEC kontaminasyonunu analiz etmek için mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin.

4. In vitro kireçlenme tahlilleri

1. Kaputu% 70 etanol ile temizleyin, DMEM ortamını 37 ° C'ye ısıtın.
2. Tam DMEM'de 6 kuyulu plakalara 100.000 hücre/koşul ve 37 °C'de 24 saat kültür.
3. DMEM'de %5 FBS ile₂mM NaH₂PO 4 ,^{10 -7} M insülin ve 50 μg/mL askorbik asit karıştırarak kireçleme ortamını hazırlayın. 93 mL DMEM için 5 mL FBS, 1 mL antibiyotik (son konsantrasyon % 1), 1 mL sodyum piruvat (100 mM), 27,5 mg NaH₂PO_4, 5,8 μL insülin ve 5 mg askorbik asit ekleyin.
   NOT: Kullanmadan önce çözeltiyi 0,22 μm filtre kullanarak filtreleyin.
4. 24 saat sonra, süpernatant ortamını kireçleme ortamıyla değiştirin. Hücreleri 37 °C'de 7 gün kuluçkaya yatırın. 3^rd günde, taze kireçleme ortamı ile değiştirin ve 7 günlük tedaviyi tamamlamak için plakayı inkübatöre geri yerleştirin.
5. 7 gün sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri 2 mL 1x PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri 1 mL 0,6 N hidroklorik asit (HCl) içinde 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yaslanın. HCl'yi 1,5 mL'lik bir tüpte toplayın ve döner evaporatörde buharlaştırın. Tüm tüplerin içeriğini 60 μL HCl'de yeniden askıya alın.
   NOT: Kurutma prosedürü, çözeltiyi konsantre etmek ve her durum için aynı hacme sahip olmak için önemlidir.
6. Kullanıma hazır bir kit içinde bulunan Arsenazo III reaktifini kullanarak kalsiyum konsantrasyonu ölçmek için 96 kuyulu bir plaka kullanın (daha fazla ayrıntı için Malzeme Tablosu'na bakın).
7. 10 mg/dL konsantrasyonda bir kalsiyum standart çözeltisi hazırlayın. 10 mg kalsiyum hidroksit (Ca(OH)₂₎tartın ve 100 mL damıtılmış suda çözün.
8. Net bir 96 kuyu plakasında, pipet 2 μL boş çözelti (HCl, 0.6 N), standart çözelti, kuyu başına numune (10 mg / dL) ve numuneler. Pipetleme değişkenliğini doğrulamak için denemeyi üç taraflı olarak gerçekleştirin. Her durum için 200 μL reaktif ekleyin.
   NOT: 15 mg/dL'nin üzerindeki numuneler 1:1 salin ile seyreltilmeli, yeniden test edilmeli ve sonuç iki ile çarpılmalıdır.
9. Oda sıcaklığında reaksiyonun 15 dakika kuluçkaya yatır.
   NOT: Reaksiyon 60 dakika boyunca kararlıdır.
10. Plakanın emiciliğini 650 nm'de okuyun ve kaydedin. Numunelerdeki kalsiyum miktarını hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:
    Kalsiyum (mg/mL) = (Numunenin emültülesi/standardın emültülesi) × Standart konsantrasyonu

Sonuçlar

Murine aort kapakçıkları tipik olarak 1 mm çapında olduğundan, farklı deneysel prosedürler için bir milyon uygun hücre toplamak için en az üç valf birikmelidir. VIC yalıtım işleminin farklı adımları Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilmiştir. Kapak dokusunu elle kazımak zor olduğundan, VORTEXING tarafından oluşturulan kesme stresinin IC'leri çıkarmak için kullanılması tercih edilir. Gerçekten de, CD31 immünofluoresans boyama sonuçları endotel hücrelerinin kirlenmesini...

Tartışma

Bu makalede, birincil kültür için fare valfi hücre yalıtımının ayrıntılı bir protokolü sunulmaktadır. 8 haftalık farelerden alınan üç aort kapakçığı, yeterli sayıda hücre elde etmek için birikti. Ek olarak, bu protokol VIC fenotipinin karakterizasyonu ve in vitro mineralizasyon testini açıklar. Yöntem, Mathieu ve ark.⁷'den daha önce açıklanan protokolden uyarlanmıştır.

Aort kapaklarının izolasyonu sırasında, hücreleri bakteriyel veya mikoplazma kontami...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
3 mm kesici kenar makas	FST	15000-00
Anti-alfa düz kas Aktin antikoru	abcam
Anti-fare, Alexa Fluor 488 eşlenik	Hücre Sinyali	4412
Arsenazo-III reaktif seti	POINT SCIENTIFIC	C7529-500	Kalsiyum konsantrasyonunu ölçmek için bir kit
Bonn Makas	FST	14184-09
Kalsiyum hidroksit	SIGMA -Aldrich 31219	31219
CD31	Novusbio
Kollajenaz tip I  (125 birim / mg)	Thermofisher Scientific	17018029
DMEM	Tthermofisher	11965092
Ekstra ince graefe forseps	FST	11150-10
FBS	Gibco 16000044
İnce forseps	F.S.T Dumont
HCl	SIGMA-ALDRICH	H1758
HEPES 1 M çözelti	KÖK HÜCRELER TEKNOLOJİLER
L-Glutamin 100x	Thermofisher Scientific	A2916801
Mycozap	Lanza	VZA-2011	Mikoplazma eliminasyon reaktifi
PBS 10x	SIGMA-ALDRICH
penesilin streptomisin 100x	Thermofisher Scientific	10378016
Sodyum Pirüvat 100 mM	Thermofisher Scientific
Standart desen forseps	F.S.T	11000-12
Cerrahi Makas - Keskin-Künt	F.S.T	14008-14
Tripsin %0.05	Thermofisher Scientific	25300054
Vimentin	abcam