Method Article

Tüm Mount Optik Olarak Temizlenmiş Fare Akciğerinde Aspergillus fumigatus Conidia Dağılımının Konfokal Lazer Tarama Mikroskopi Tabanlı Nicel Analizi

DOI:

10.3791/62436

⸱

September 18th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center for Molecular Mechanisms of Aging and Age-Related Diseases, Moscow Institute of Physics and Technology, 2Department of Immunology, Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3Institute of Biological Information Processing (IBI-7: Structural Biochemistry), Forschungszentrum Jülich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aspergillus fumigatus conidia'nın (3 μm boyutunda) farelerin hava yollarında dağılımının nicel analizi için yöntemi açıklıyoruz. Yöntem ayrıca çeşitli patolojik durum modellerinde hava yollarındaki mikropartiküllerin ve nanopartikül aglomera dağılımının analizi için de kullanılabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aspergillus fumigatus conidia, insan hava yollarına nüfuz edelim diye hava yoluyla bulaşan patojenlerdir. Alerjisi olmayan bağışıklık sistemi yetersiz kişiler direnç ve immünolojik tolerans sergilerken, bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda konidia hava yollarını kolonize edebilir ve ciddi invaziv solunum bozukluklarına neden olabilir. Farklı hava yolu bölmelerindeki çeşitli hücreler, mantar istilasını önleyen bağışıklık tepkisine dahil edilir; bununla birlikte, patojen eliminasyonunun mekansal-zamansal yönleri hala tam olarak anlaşılamamıştır. Optik olarak temizlenmiş tüm montajlı organların, özellikle deneysel farelerin akciğerlerinin üç boyutlu (3D) görüntülenmesi, enfeksiyondan sonra farklı zaman noktalarında floresan etiketli patojenlerin hava yollarında tespit edilmesine izin veriyor. Bu çalışmada, hava yollarındaki A. fumigatus conidia dağılımının nicel bir analizini yapmak için deneysel bir kurulum tarif ediyoruz. Floresan konfokal lazer tarama mikroskopisi (CLSM) kullanarak, farelere orofarengeal uygulamadan 6 saat sonra bronş dallarında ve alveolar bölmede floresan etiketli konidianın yerini takip ettik. Burada açıklanan yaklaşım daha önce kesin patojen yerinin tespiti ve patojenle etkileşime giren hücrelerin bağışıklık yanıtının farklı aşamalarında tanımlanması için kullanılmıştır. Deneysel kurulum, patojen eliminasyonunun kinetiğini farklı patolojik koşullarda tahmin etmek için kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Günlük olarak, insanlar solunum yollarına nüfuz ürebilen fırsatçı mantarlar Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) sporları da dahil olmak üzere havadaki patojenleri solurlar1. Memelilerin solunum yolu, hava yolu duvarlarının farklı yapıları ile karakterize edilen farklı nesillerin hava yolları sistemidir2,3,4. Trakeobronşiyal duvarlar, mukozitary boşluğu sağlayan siliated hücreler olan çeşitli hücre tiplerinden oluşur5. Alveollerde, siliated hücre yoktur ve nüfuz eden alveolar uzay patojenleri mukozir bo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan laboratuvar hayvanlarıyla ilgili tüm yöntemler, Rusya Bilimler Akademisi Shemyakin ve Ovchinnikov Biyoorganik Kimya Enstitüsü'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (protokol numarası 226/2017).

1. A. fumigatus conidia uygulaması

  1. Floresan etiketli A. fumigatus conidia elde etmek için, conidia peletine 1 mL% 3 paraformaldehit ekleyerek 5 × 108 conidia'yı sabitle. Oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde 2 saat boyunca 50 mL test tüpünde kuluçkaya yatırın.
  2. Conidia'yı 20 mL fosfat tampon salin (PBS) ile yıkayın: 15 dakika boyunca 1.000....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıdaki protokole uyarak, bir farenin akciğer lobunda hava yollarını ve A. fumigatus conidia'yı gösteren 3D görüntü elde edildi (Şekil 1A). Streptavidin (hava yolu görselleştirme için kullanıldı) etiketli bronşlar ve bronşioller15. Ek olarak, morfolojileri ile hava yollarından kolayca ayırt edilebilen büyük damarlar ve plevra hava yolu kanalında görselleştirilir (Şekil 1A-C). Hava yolu yüzeyinin oluşturulması .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm organ 3D görüntüleme, patojenin organizmadaki anatomik dağılımının mekansal yönlerini araştırmak için büyük önem taşıyan numunenin diseksiyonu olmadan verilerin eldeine izin veriyor. Lazer ışık saçılımının üstesinden gelmeye yardımcı olan ve tüm organ görüntülemeye izin veren doku optik temizlemenin çeşitli teknikleri ve modifikasyonları vardır15,16,18,19. Özel doku temizleme yaklaşımlarınd.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar bu eserde çıkar çatışması olmadığını bildirmektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Aspergillus fumigatus conidia strain AfS150'yi sağladığı için Prof. Sven Krappmann'a (Erlangen Üniversite Hastanesi ve FUA Erlangen-Nürnberg, Almanya) teşekkür ediyor. Yazarlar MIPT Basın Bürosu'na teşekkür eder. V.B. Rusya Federasyonu Bilim ve Yüksek Öğrenim Bakanlığı'nı kabul eder (#075-00337-20-03, FSMG-2020-0003 projesi). A. fumigatus conidia görüntüleme ve niceleme ile ilgili çalışma RSF No 19-75-00082 tarafından desteklendi. Hava yolu görüntüleme ile ilgili çalışma RFBR No 20-04-60311 tarafından desteklendi.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 594 NHS EsterThermoFisherA20004
Aspergillus fumigatus conidiaATCC46645Suşu AfS150, bir ATCC 46645 türevi
Benzil alkolPanreac141081.1611%98.0-100
Benzil benzoatAcrosAC10586-001099+%
C57Bl/6 farePushchino Hayvan Üreme Merkezi (Rusya)Erkek. 12 - 30 haftalık.
KateterVenisystemsG715-A0118G
Hücre görüntüleme kapağıcam tabanlı odaEppendorf30742028kapaklı cam tabanlı 4 veya 8 kuyulu oda
SantrifüjEppendorf5804R1000 g sağlanan herhangi bir santrifüj kullanılabilir
Konfokal lazer tarama mikroskobuZEISSZEISS LSM780
Dimetil sülfoksitSigma-Aldrich276855ve ge; %99,9
FIJI görüntü işleme paketiFIJIÜcretsiz yazılım
ForcepB. Braun AesculapBD557RDişli
ForcepB. Braun AesculapBD321Rİnce uçlu
ForcepBochem1727Pürüzsüz
Cam şişeDURAN242101304Topraklı kapaklı
Grafik Düzenleyici PhotoshopAdobe IncAdobe Photoshop CS
GraphPad YazılımıGraphPadPrism 8
Imaris Mikroskopi Görüntüleme YazılımıOxford Instruments
NaHCO3Panreac141638 https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
ObjektifZEISS420640-9800-000  Plan-Apokromat, 10 ve kez; (NA = 0.3)
ParaformaldehitSigma-Aldrich158127
PBSPanecoP060 ve Pi;
PipetProLine7220205 ila 50 μ L
Süt tozuRothT145.2
Numune karıştırıcıDynalMXIC1
MakasB. BraunBC257RKünt
ÇalkalayıcıApexlabGS-2050-300 rpm
SkalpelBochem12646
İpek iplikB. Braun3 USP
Streptavidin, Alexa Fluor 488 eşlenikThermoFisherS11223
Test tüpüSPL Lifesciences5005050 mL
Tris (hidroksimetil aminometan)HeliconH-1702-0.5  Sayın 121.14; CAS Numarası: 77-86-1
Triton X-100Amresco-O694-0.1
ZEN mikroskop yazılımıZEISSZEN2012 SP5https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html
Isoflurane Karizoo ücretsiz deneme sürümü mevcuttur

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
  2. Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Re....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Confocal Laser MicroscopyAspergillus Fumigatus ConidiaOptical ClearingMouse Lung ImagingQuantitative AnalysisAirway DistributionThree Dimensional ImagingSpectral UnmixingAirway MaskingImmune Response

Related Articles