Bu protokol, cerrahi aort kapak replasman prosedürleri sırasında veya kadavra dokusundan ekstrakte edilen insan aort kapaklarının toplanmasını ve ardından hastaya özgü primer kapak endotel ve interstisyel hücrelerinin izolasyonunu, genişlemesini ve karakterizasyonunu tanımlar. Hücre canlılığını ve fenotip spesifikliğini sağlamak için gereken süreçlerle ilgili önemli detaylar dahildir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
In vitro Hastalık Modellemesi için İnsan Primer Kapak Hücrelerinin İzolasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Kalsifik aort kapak hastalığı (KAVD) yaşlı nüfusun yaklaşık üçte birinde mevcuttur. Aort kapağının kalınlaşması, sertleşmesi ve kalsifikasyonu aort darlığına neden olur ve kalp yetmezliği ve felce katkıda bulunur. Hastalık patogenezi multifaktöriyeldir ve inflamasyon, hücre dışı matriks remodelingi, türbülanslı akış, mekanik stres ve gerinim gibi gerilmeler kapak endotel ve kapak interstisyel hücrelerinin osteojenik farklılaşmasına katkıda bulunur. Bununla birlikte, sağlıklı bir hücrenin kalsifiye edici bir hücreye osteojenik geçişini yönlendiren kesin başlatıcı faktörler tam olarak tanımlanmamıştır. Ayrıca, CAVD'ye bağlı aort darlığı için tek güncel tedavi, doğal kapağın çıkarıldığı (cerrahi aort kapak replasmanı, SAVR) veya bir kateter (transkateter aort kapak replasmanı, TAVR) yoluyla tamamen katlanabilir bir yedek kapağın yerleştirildiği aort kapağı replasmanıdır. Bu cerrahi prosedürler yüksek maliyetle ve ciddi risklerle birlikte gelir; Bu nedenle, ilaç keşfi için yeni terapötik hedeflerin belirlenmesi zorunludur. Bu amaçla, bu çalışma, hastalardan cerrahi olarak çıkarılan dokuların ve donör kadavra dokularının, in vitro hastalık modellemesi için hastaya özgü birincil kapak hücresi hatları oluşturmak için kullanıldığı bir iş akışı geliştirmektedir. Bu protokol, organ naklinde yaygın olarak kullanılan bir soğuk hava deposu çözeltisinin, eksize edilen dokunun hücrelerini büyük ölçüde stabilize etme yararıyla, doku eksizyonu ve laboratuvar işlemleri arasındaki genellikle uzun tedarik süresinin neden olduğu hasarı azaltmak için kullanılmasını sağlar. Bu çalışmanın sonuçları, izole kapak hücrelerinin proliferatif kapasitelerini ve kültürdeki endotel ve interstisyel fenotiplerini, donörden kapak çıkarıldıktan birkaç gün sonra koruduklarını göstermektedir. Bu materyallerin kullanılması, hem kontrol hem de hastalık hücre hatlarının oluşturulduğu kontrol ve CAVD hücrelerinin toplanmasına izin verir.
Giriş
Kalsifik aort kapak hastalığı (KAVD), aort kapak broşürlerinin inflamasyonu, fibrozisi ve makrokalsifikasyonu ile karakterize kronik bir patolojidir. Broşürlerin ilerleyici yeniden şekillenmesi ve kalsifikasyonu (aort skleroz olarak adlandırılır), inmeye katkıda bulunan ve kalp yetmezliğine yol açan kan akışının tıkanmasına (aort darlığı) yol açabilir. Günümüzde KAVD'nin tek tedavisi cerrahi veya transkateter aort kapak replasmanıdır (sırasıyla SAVR ve TAVR). KAVD progresyonunu durdurmak veya tersine çevirmek için cerrahi olmayan bir seçenek yoktur ve kapak replasmanı olmadan mortalite oranları 2-3 yıl içinde %50'ye yaklaşır 1,2,3
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hasta örnekleri, Helsinki Deklarasyonu'na uygun olarak Pittsburgh Üniversitesi kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanan çalışmalara kayıtlı kişilerden toplanır. Organ Kurtarma ve Eğitim Merkezi (CORE) aracılığıyla elde edilen kadavra dokuları, Pittsburgh Üniversitesi Aldatıcıları İçeren Araştırma ve Klinik Eğitimin Gözetimi Komitesi (CORID) tarafından onaylanmıştır.
1. Onay ve güvenlik
- Helsinki Deklarasyonu'na uygun olarak hasta örneklerinin veya kadavra dokularının herhangi bir şekilde toplanması için Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onayı veya muaf bir not alın.
- Kan Yoluyla Bulaşan Patojenler Eğitimi, Biyomedika....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yukarıdaki protokol, insan kapak dokularının taşınması ve bu dokulardan canlı hücre hatlarının izolasyonu ve kurulması için gerekli adımları özetlemektedir. Aort kapağının broşürleri parafin gömülmesi için işlenir, biyokimyasal veya genetik analiz için uzun süreli depolama için dondurulur ve VEC'lerin ve VIC'lerin izolasyonu için sindirilir (Şekil 1). Cerrahi örnekler muhtemelen aort darlığının klinik tanısına sahip olacak ve çıplak gözle görülebilen ağır kalsifikasyon nodülleri sergileyebil.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
İnsanlardan kontrol ve hastalık dokularının elde edilmesi, in vitro ve ex vivo hastalık modellemesi için kritik öneme sahiptir; Bununla birlikte, sık sık tezgahtan başucuna kadar olan boşluğu kapatmanın zorluklarından bahsedilirken, ters sıra - cerrahi süitten tezgaha gitmek - genellikle bir boşluk kadar göz korkutucu olur. Temel bir bilim insanının birincil insan dokusu örneklerini elde etmesi için gerekli olan, hemşireler, cerrahi teknisyenler, doktor asistanları, tıp öğrencileri ve sakinleri ve hastaları kaydedebilen .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
IS, Atricure ve Medtronic'ten kurumsal araştırma desteği almakta ve Medtronic Vascular için danışman olarak hizmet vermektedir. Bu çatışmaların hiçbiri bu işle ilgili değildir. Diğer tüm yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Teşekkürler
Jason Dobbins'e bu makalenin anlayışlı tartışması ve eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Organ Kurtarma ve Eğitim Merkezi'ne yardım ve destekleri için teşekkür eder, doku bağışçılarına ve ailelerine bu çalışmayı mümkün kıldıkları için teşekkür ederiz. Tüm hasta örnekleri, Helsinki Deklarasyonu'na uygun olarak Pittsburgh Üniversitesi kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanan çalışmalara kayıtlı kişilerden toplanır. Organ Kurtarma ve Eğitim Merkezi (CORE) aracılığıyla elde edilen kadavra dokuları, Pittsburgh Üniversitesi Aldatıcıları İçeren Araştırma ve Klinik Eğitimin Gözetimi Komitesi (CORID) tarafından onaylanmıştır.
Biorender.com ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.45 μ m filtre | Thermo Scientific | 7211345 | Kollajen kaplamalı hazırlama plakası |
| 10 cm hücre kültürü plakası | Greiner Bio-One | 664160 | Hücre kültürü/hücre hattı genişletme |
| 10 mL serolojik pipet | Fisher | 14955234 | VEC/VIC izolasyonu, hücre kültürü, hücre hattı genişletme |
| 1000 μ L filtre uçları | VWR | 76322-154 | Hücre kültürü/hücre hattı genişletme |
| 10XL filtre uçları | VWR | 76322-132 | Hücre kültürü/hücre hattı genişletme |
| 15 mL konik tüpler | Thermo Scientific | 339650 | Doku depolama, VIC/VEC izolasyonu |
| %16 paraformaldehit sulu çözelti Elektron | Mikroskobu Bilimleri | 15710S | Doku ve hücre sabitleyici |
| 190 kanıt etanol | Decon | 2801 | Dezenfeksiyon |
| 1x DPBS: kalsiyum yok, magnezyum | yok Gibco | 14190250 | Tuzlu su çözeltisi. VIC/VEC izolasyonu |
| 1x PBS | Fisher | BP2944100 | Tuzlu su çözeltisi. Doku hazırlama, VIC/VEC izolasyonu |
| 20 μ L filtre uçları | VWR | 76322-134 | Hücre kültürü/hücre hattı genişletme |
| 200 geçirmez etanol | Decon | 2701 | Deparafinleştirici doku örnekleri |
| 2-propanol | Fisher | A416P 4 | Kollajen kaplı plakaların yapılması |
| 5 mL serolojik pipet | Fisher | 14955233 | VEC/VIC izolasyonu, hücre kültürü, hücre hattı genişletme |
| 50 mL konik tüpler | Termo Bilimsel | 339652 | Doku saklama, VIC/VEC izolasyonu |
| 60 mm çanak | GenClone | 25-260 | VEC izolasyonu |
| 6 oyuklu hücre kültürü plakası | Corning | 3516 | Hücre kültürü/hücre hattı genişlemesi |
| Asetik asit, buzul | Fisher | BP2401 500 | Kollajen kaplı plakaların yapımı |
| AlexaFluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | Floresan F-aktin karşı leke |
| Belzer UW Soğuk Hava Deposu Nakil | Solüsyonu Hayat Köprüsü | BUW0011L | Doku saklama solüsyonu |
| Sığır Serumu Albümini, Fraksiyon V - Yağ Asidi İçermez 25g | Bioworld | 220700233 | CD31+ Dynabeads |
| Calponin 1 antikoru ile VEC onayı | Abcam | ab46794 | Birincil antikor (VIC pozitif leke) |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) | Hücre Sinyali | 3528 | Birincil antikor (VEC pozitif boya) |
| CD31 + Dynabeads | Invitrogen | 11155D | CD31 + Dynabeads ile VEC onayı |
| CDH5 | Hücre Sinyali | 2500 | Birincil antikor (VEC pozitif boya) |
| 0.70 & mu ile hücre süzgeci; m gözenekler | Corning | 431751 | VIC izolasyonu |
| Kollajen 1, sıçan kuyruğu proteini | Gibco | A1048301 | Kollajen kaplı plakaların yapımı |
| Kollajenaz II | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | Doku sindirimi. Doku hazırlama, VIC/VEC izolasyonu |
| Conflikt Kullanıma Hazır Dezenfektan Sprey | Decon | 4101 | Dezenfeksiyon |
| Kontes II Otomatik Hücre Sayacı | Invitrogen | A27977 | Otomatik hücre sayacı |
| Kontes II yeniden kullanılabilir sürgülü lameller | Invitrogen | 2026h | Otomatik hücre sayacı gerekli sürgülü kapak |
| Lameller | Fisher | 125485E | Valf numunelerinin montajı |
| Kriyojenik şişeler | Olympus Plastics | 24-202 | Hücrelerin/doku numunelerinin dondurulması |
| CLOROMAX ile Dezenfekte Edici Çamaşır Suyu - Konsantre Formül | Clorox | N/A | Dezenfeksiyon |
| DMEM | Gibco | 10569044 | Büyüme ortamı. VIC genişletme |
| EBM - Endotel Hücre Ortamı, Bazal Ortam, Fenol Kırmızısı içermeyen 500 | Lonza Walkersville | CC3129 | Büyüme ortamı. VEC genişletme |
| EGM-2 Endotel Hücre Ortamı-2 - 1 kit SingleQuot Kiti | Lonza Walkersville | CC4176 | Büyüme ortamı takviyesi. VEC genişletme |
| EVOS FL Mikroskop | Yaşam Teknolojileri | Model Numarası: AME3300 | Floresan görüntüleme |
| EVOS XL Mikroskop | Yaşam Teknolojileri | AMEX1000 | Hücre hattı genişlemesi sırasında hücrelerin görselleştirilmesi |
| Fetal Sığır Serumu - Premium Select | R& D Systems | S11550 | VIC genişletme |
| İnce makas | Güzel Bilim Araçları | 14088-10 | Doku hazırlama, VIC/VEC izolasyonu |
| Fisherbrand Hücre Sıyırıcılar Fisher | 08-100-241 | VIC genişletme | |
| Fungizone | Gibco | 15290-026 | Antifungal: Doku hazırlama, VIC / VEC izolasyonu |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | Antibiyotik: Doku hazırlama, VIC/VEC izolasyonu |
| Cam slaytlar | Globe Scientific Inc | 1358L | montaj valfi örnekleri |
| Keçi anti-Fare 488 | Invitrogen | A11001 | Floresan ikincil Antikor |
| Keçi anti-Fare 594 | Invitrogen | A11005 | Floresan ikincil Antikor |
| Keçi anti-Tavşan 488 | Invitrogen | A11008 | Floresan ikincil Antikor |
| Keçi anti-Tavşan 594 | Invitrogen | A11012 | Floresan ikincil Antikor |
| Invitrogen Countess II FL Yeniden Kullanılabilir Slayt | Invitrogen | A25750 | Otomatik hücre sayacı gerekli slayt |
| Invitrogen NucBlue Sabit Hücreli ReadyProbes Reaktif (DAPI) | Invitrogen | R37606 | Floresan çekirdek karşı lekesi |
| LM-HyCryo-STEM - 2X Kriyoprezervasyon ortamı kök hücreler için | HyClone Laboratories, Inc. | SR30002 | Donmuş hücre saklama |
| Montaj Ortamı Fisher | Chemical Permount | SP15-100 | Montaj valfi örnekleri |
| Mr. Frosty dondurma kabı | Nalgene | 51000001 | Kontrollü numune dondurma kabı |
| Mycoplasma-ExS Sprey | PromoCell | PK-CC91-5051 | Dezenfeksiyon |
| Penisilin-Streptomisin | Gibco | 15140163 | Antibiyotik. VIC genişlemesi |
| Plasmocin | Invivogen | ANTMPT | Anti-mikoplazma. VIC/VEC izolasyonu ve genişlemesi |
| SM22a antikoru | Abcam | ab14106 | Birincil antikor (VIC pozitif leke) |
| Sstandard desen makası | Güzel Bilim Araçları | 14001-14 | Doku hazırlama, VIC/VEC izolasyonu |
| Steril pamuklu çubuk | Püriten | 25806 10WC | VEC izolasyonu |
| Swingsette insan dokusu kaseti | Simport Scientific | M515-2 | Doku gömme kabı |
| Taylor Forseps (17cm) | Güzel Bilim Araçları | 11016-17 | Doku hazırlama, VIC/VEC izolasyonu |
| Tripan Mavisi Çözeltisi, %0.4 | Gibco | 15250061 | hücre sayma çözeltisi |
| TrypLE Express Enzim | Gibco | 12604021 | Bölme VIC / VEC'ler |
| Von Kossa kiti | Polysciences | 246331 | Dokuların parafin bölümlerinin boyanması kalsifikasyon için |
| von Willebrand faktör antikoru | Abcam | ab68545 | Birincil antikor (VEC pozitif leke) |
| Ksilenler | Fisher Chemical | X3S-4 | Deparafinleştirici doku örnekleri |
| ve alfa; SMA antikoru | Abcam | ab7817 | Birincil antikor (VIC pozitif boya) |
Kaynaklar
- Lamprea-Montealegre, J. A., Otto, C. M. Health behaviors and calcific aortic valve disease. Journal of Amercan Heart Association. 7, (2018).
- Nishimura, R. A., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
