İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Böbrek Organoidleri Üretmek için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Son yıllarda, insan pluripotent kök hücrelerini böbrek organoidlerine ayırmak için bir dizi protokol geliştirilmiştir ^1,2,3,4,5. Böbrek organoidleri, yeni rejeneratif tıp yaklaşımlarına yönelik araştırmalara yardımcı olmak, böbrekle ilgili hastalıkları modellemek, toksisite çalışmaları yapmak ve terapötik ilaç geliştirmek için önemli bir araç sağlamıştır. Geniş uygulanabilirliklerine rağmen, böbrek organoidlerinin olgunlaşma eksikliği, in vitro sınırlı uzun süreli kültür kapasitesi ve insan böbreğinde bulunan çeşitli hücre tiplerinin azlığı gibi sınırlamaları vardır ^6,7,8. Son çalışmalar, organoid olgunlaşma seviyesini iyileştirmeye, kültür sürelerini uzatmaya ve mevcut protokolleri^{değiştirerek} böbrek hücresi popülasyonlarının karmaşıklığını genişletmeye odaklanmıştır ^9,10,11,12. ^Yerleşik protokolümüzün ^5,13'ünün bu mevcut yinelemesinde, protokolün ilk aşamasındaki ortam bileşenlerini, insülin-transferrin-selenyum-etanolamin (ITSE), lipitler^, polivinil alkol (E5-ILP) ve CHIR99021 ile desteklenmiş serumsuz bir baz ortama değiştirdik (Şekil 1). Bu değişiklikler, önceki orta bileşimimiz ^5,13'ten daha az bileşene sahip ve ek büyüme faktörleri olmadan, tam olarak tanımlanmış, serum içermeyen, düşük proteinli bir ortam sağlar. Sonuç olarak, ilk aşama ortamının hazırlanması daha önce yayınlanmış sürümümüze göre daha az emek yoğundur ve partiden partiye değişkenliği^{azaltabilir 5}. Önceki çalışmalar, serumsuz kültür^14,15'te hem insülin hem de transferrinin önemli olduğunu göstermiştir, ancak yüksek insülin seviyeleri mezoderm farklılaşmasına inhibide olabilir¹⁶. Orijinal protokolde belirtildiği gibi düşük insülin seviyelerini koruduk ve tahlilin ikinci aşamasında KOSR seviyelerini (insülin içeren) daha da azalttık. Böbrek organoid oluşumu için diğer protokollere uygun olarak, daha düşük KOSR seviyeleri, böbrek dokusunun çoğalması ve farklılaşması arasındaki dengeyi korumak için faydalıdır¹⁷. Ek olarak, Aşama II ortam^{13'ümüzdeki} glikoz konsantrasyonunu düşürdük.

Yöntemimiz, orijinal yayın 5,13'te açıklandığı gibi, başlangıçtaki ~% 60 birleşik hPSC 100 mm kültür plakasından ~ ^1.000 organoid veren böbrek organoidlerinin süspansiyon testi için bir kurulum tanımlamaktadır. Bu protokol, organoid sayılarını daha da artırmak için birden fazla 100 mm veya 150 mm plaka ile başlayarak kolayca ölçeklendirilebilir.

hPSC'leri kullanan tüm deneyler kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi ve uygun kişisel koruyucu ekipmana sahip bir Sınıf II biyogüvenlik başlığında gerçekleştirildi. Tüm reaktifler, aksi belirtilmedikçe hücre kültürü sınıfındadır. Tüm kültürler 37 °C, %5 CO₂ hava atmosferinde inkübe edilir. Tahlilin tüm aşamalarında, embriyoid cisimler veya böbrek organoidleri toplanabilir ve analiz için sabitlenebilir veya hazırlanabilir. Bu verileri oluşturmak için kullanılan hPSC hatları tamamen karakterize edilmiş ve yayınlanmıştır¹⁸.

1. Kültür plakalarının hazırlanması

NOT: hPSC'lerin bölünmesinden yaklaşık 1 saat önce, 2 x 100 mm doku kültürü plakalarını kök hücre nitelikli bazal membran matris ekstresi (BME) ile kaplayın. Plakalar önceden kaplanabilir, bir parafin filmle kapatılabilir ve üreticilerin talimatlarına göre 4 ° C'de saklanabilir.

1. 2 x 100 mm doku kültürü ile muamele edilmiş plakalar (böbrek organoid testi için 1, hücre hattını korumak için 1) ve Sınıf II biyogüvenlik başlığında 15 mL konik tüp hazırlayın.
2. Aliquot 8 mL soğuk, serumsuz Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) 15 mL konik tüpe ve ~ 4 mL 100 mm plakaların her birine, her plakanın tabanını orta ile örtmeye yetecek kadar.
3. Dondurucudan 100 μL BME aliquot alın (-20 ° C). 2 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, 15 mL'lik konik tüpten ~1 mL soğuk DMEM alın. BME aliquot'u soğuk DMEM ile hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek, kabarcık yapmaktan kaçınarak yavaşça çözün.
   NOT: BME aliquot'un oda sıcaklığında oturmasına izin vermeyin. Hemen kullanın.
4. Çözülmüş DMEM/BME'yi kalan DMEM ile birlikte 15 mL konik tüpe geri aktarın. 10 mL'lik serolojik pipetle, BME'yi eşit şekilde dağıtmak için seyreltilmiş BME'yi en az 8 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek, kabarcıklar yapmaktan kaçınarak nazikçe karıştırın.
5. Seyreltilmiş BME'nin 4 mL'sini DMEM ile her plakaya aktarın ve BME'nin eşit olarak dağıtılması için plakayı yavaşça döndürün. Kaplanmış plakayı oda sıcaklığında 1 saat veya 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
   NOT: 100 mm plaka başına 50 μL BME kullanın. Diğer hPSC kültür ortamlarının ve hücre hatlarının kullanımı farklı konsantrasyonlarda BME gerektirebilir.

2. Pasaj hPSC'leri

NOT: Rutin hPSC kültürü için, %70-80 oranında geçiş hücresi çizgileri.

1. Kültür ortamını geçilecek hPSC plakasından aspire edin. hPSC plakasına ~ 8 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ekleyin ve hücreleri yıkamak için hafifçe döndürün.
2. DBPS'yi aspire edin ve 100 mm plakaya 2 mL yumuşak hücre ayrışma reaktifi (GCDR) ekleyin, hücreleri örtmek için üstüne damla damla damla ekleyin.
   NOT: Diğer ayrışma reaktifleri de kullanılabilir. Buna göre ayarlayın.
3. Koloniler parçalanana ve hücreler faz kontrastı altında kırılana kadar oda sıcaklığında ~ 6-8 dakika boyunca inkübe edin (Şekil 2A).
   NOT: Zamanlama hücre hatları arasında değişebilir. Buna göre ayarlayın.
4. Kuluçka yaparken, 50 mL'lik bir konik tüp hazırlayın. 16 mL hPSC ortamı (100 mm plaka başına 8 mL) ekleyin ve Rho ile ilişkili kinaz inhibitörü (ROCKi) 5 μM'lik son konsantrasyona ekleyin.
5. DMEM'i BME kaplı plakalardan aspire edin ve her plakaya 8 mL hPSC ortamı artı ROCKi ekleyin.
6. Hücreler hazır olduğunda (madde 2.3, Şekil 2A'da açıklandığı gibi), GCDR'yi aspire edin ve plakayı deneyciye doğru ~ 45 ° eğin ve hücreleri bir hücre kaldırıcı ile kazıyın.
   NOT: Hücreler parçalanıyorsa, aspire edici GCDR'yi atlayın ve devam edin.
7. Plakayı ~ 90 ° çevirin ve kalan hücreleri kaldırmak için tekrar kazıyın. Plakayı ~ 45 ° tutun ve hücreleri 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak 3 mL hPSC ortamı ile yıkayın.
8. Büyük kümeleri (en fazla 2-3 kez) parçalamak için yavaşça yukarı ve aşağı pipet yapın ve hücreleri hazırlanan plakalara ilgilenilen hücre hattı için uygun oranda tohumlayın. Plakayı inkübatördeki hücrelerle birlikte yerleştirin ve hücreleri eşit olarak dağıtmak için plakayı şekil sekiz hareketle yavaşça hareket ettirin.
   NOT: Bu deneyde hPSC çizgileri 1:5 oranında bölünmüştür, bu diğer hücre hatları ve koşulları için değişebilir. Tabağı gece boyunca rahatsız edilmeden bırakın.
9. ~ 24 saat sonra, hücreleri bağlantı için inceleyin. Bağlı küçük bireysel kolonileri arayın. Harcanan ortamı aspire edin ve 8 mL taze hPSC ortamı ile doldurun (ROCKi eklenmedi).
10. Böbrek organoid tahlilini başlatmak için hücreler ~% 60 akıcılığa ulaşana kadar günlük olarak gözlemlemeye ve beslemeye devam edin (genellikle pasajdan sonra 48 ila 72 saate ulaştı). Koloniler ideal olarak ayrık olacak ve birleşmeyecek (Şekil 2B).
    NOT: Pluripotens durumlarını korumak için hücreleri% 80'den fazla akıcılıkla sınırlamamak çok önemlidir. Akıcı kültürler, kaba kullanım veya daha yüksek pasajlar, istenmeyen spontan farklılaşmaya veya böbrek organoid oluşumunun düşük verimliliğine neden olabilir.

3. Gün 0 - Böbrek organoid testinin kurulması

1. Başlamadan önce, hem E5-ILP hem de Aşama II ortamını formülasyonlara göre hazırlayın (Tablo 1 ve Tablo 2).
   NOT: Ortam, 4 °C'de 14 güne kadar saklanabilir.
2. Bir böbrek organoid testi için (bir 6 delikli plaka için bir 100 mm kültür plakası gereklidir), 50 mL'lik bir konik tüpte tam E5-ILP ortamı hazırlayın: 8 μM CHIR99021 (14.4 μL), 3.3 μM ROCKi (6 μL), 0.1 mM beta-merkaptoetanol (32.7 μL) ile desteklenmiş 18 mL E5-ILP.
3. 6 kuyucuklu ultra düşük bağlantı plakasının her bir kuyucuğuna 2 mL komple E5-ILP ortamı yerleştirin.
4. hPSC'leri ~ 8 mL DPBS ile ~% 60 yoğunlukta (Şekil 2B) iki kez yıkayın. Aspirat DPBS daha sonra 100 mm plaka başına 2 mL dispase ekleyin, hücreleri örtmek için damla damla damla ve 37 ° C'de 6 dakika boyunca inkübe edin.
   NOT: 6 dakika sonra, kolonilerin kenarları kıvrılmaya başlayacak (Şekil 2C, kırmızı oklar) ve koloninin geri kalanı bağlı kalacaktır. Bu 6 dakika sonra elde edilmezse, hücreleri 30 saniye daha inkübatöre geri yerleştirin. Diğer hPSC ortamları ve matrisleri bu zamanlamayla uyumlu olmayabilir. Laminin esaslı BME kaplama, dispase ile uyumlu değildir. Laminin bazlı BME standart hPSC matrisi ise, bölüm 1'deki plakalardan birini, böbrek organoid testi için kullanılacak bu yöntemde açıklanan BME ile kaplayın.
5. Hücreleri ~ 10 mL DPBS ile 3 kat yıkayın. DPBS'yi aspire edin, ardından plakayı ~ 45 ° eğin ve bir hücre kaldırıcı ile kazıyın.
   NOT: Dispase devre dışı bırakılmaz, bu nedenle iyice yıkanması gerekir. Yıkama sayısını azaltmayın.
6. 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak kolonileri üstten aşağıya doğru 6 mL tam E5-ILP ortamı ile yıkayın. Büyük kolonileri parçalamak için hafifçe yukarı ve aşağı pipet yapın (genellikle 2 veya 3 kez yeterlidir).
7. 6 delikli plakaya kuyu başına 1 mL ekleyerek koloni kümelerini eşit olarak dağıtın. Plakayı 37 °C inkübatöre yerleştirilen bir yörüngesel çalkalayıcıya (ayarlar: orbital = 30, karşılıklı = 330°, titreşim = 5° - 2 s) yerleştirin (Şekil 2D).
   NOT: Titreşim özelliği, organoidlerin yeterli dağılımı ve kümelenmenin önlenmesi için önemlidir.

4. Gün 2 - Yarı-orta değişimle besleme

NOT: 48 saat içinde, koloni kümeleri embriyoid cisimler oluşturacaktır.

1. Tüm ortamı hazırlayın: 6 delikli bir plaka için 15 mL'lik bir konik tüp içinde 12 mL E5-ILP ortamı + 8 μM CHIR99021 hazırlayın.
   NOT: Beta-merkaptoetanol ve ROCKi gerekli değildir.
2. Embriyoid cisimlerin plakanın dibine yerleşmesine izin verin, plakayı ~ 45 ° eğin, ardından ortamı yavaşça üstten aspire edin, kuyucuk başına ~ 1 mL bırakın.
   NOT: Bu aşamada embriyoid cisimler hızla kümelenir. Onları > 5 dakika yetinmeye bırakmayın.
3. Kuyu başına 2 mL hazırlanmış tam ortam (bölüm 4.1) ekleyin. Plakayı çalkalayıcıya geri koyun.

5. Gün 3 - Embriyoid cisimlerin Aşama II ortamına transferi

1. 50 mL'lik bir konik tüp ve DMEM (düşük glikoz) hazırlayın. Embriyoid cisimlerin plakanın dibine yerleşmesine izin verin. Plakayı ~ 45 ° eğin ve ortamı üstten yavaşça aspire edin, kuyucuk başına ~ 1 mL bırakın.
2. 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak tüm embriyoid cisimciklerini her bir kuyucuktan dikkatlice toplayın ve 50 mL konik tüpe aktarın.
3. Kalan embriyoid cisimleri ~ 1 mL DMEM (düşük glikoz) ile toplamak için her bir kuyucuğu yıkayın ve bunları aynı 50 mL konik tüpe ekleyin.
4. Embriyoid cisimleri tüpün dibine yerleşmek için bırakın, ~ 5 dakika. Beklerken, 6 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 2 mL Aşama II ortamı ekleyin. 200 μm hücre süzgeci kullanarak büyük embriyoid cisimleri (>300 μm) yok edin (Şekil 2E).
   1. Yeni bir 50 mL konik tüp kullanın ve 200 μm hücre süzgecini üstüne yerleştirin. Hücre süzgeci üzerinde 10 mL'lik serolojik pipet kullanarak embriyoid cisimlerin tümünü dikkatlice pipetleyin.
   2. Hücre süzgecine sıkışmış embriyoid cisimleri toplamak için hücre süzgecini ek ~ 5 mL DMEM (düşük glikoz) ile durulayın. Embriyoid cisimlerin konik tüpün dibine yerleşmesine izin verin.
5. Embriyoid cisimler yerleştiğinde, süpernatantı aspire edin ve ~ 10 mL DMEM (düşük glikoz) ile yıkayın.
6. DMEM'i aspire edin ve embriyoid cisimleri 6 mL'lik Evre II ortamında yeniden askıya alın.
7. Embriyoid cisimleri 6 kuyu ultra düşük bağlantı plakasına geri aktarın ve 6 kuyu arasında eşit olarak dağıtın.
8. Adım 4.2 ve 4.3'te açıklandığı gibi her gün yarım orta ölçekli değişiklikler gerçekleştirin.
   NOT: 3. günden itibaren, embriyoid cisimler 'altın' ve pürüzsüz, küresel bir görünüme sahip olacaktır (Şekil 2F). ~ 6. günden itibaren, bireysel embriyoid cisimlerde tübül oluşumu belirginleşecek, takip eden günlerde artan sayılar optimum sayılara ulaşacak ve 14. güne kadar büyüyecektir (Şekil 2G, H). Ara sıra kümelenmeyi ortadan kaldırmak için, böbrek organoidlerini veya tübülsüz çok küçük embriyoid cisimleri görsel olarak gözlemledikten sonra, <200 ve büyük>500 μm organoidleri, 5.4.1 ve 5.4.2 numaralı adımlarda açıklandığı gibi 500 ve 200 μm hücre süzgeçleri ile eleyin.

6. İplikçi şişeye ve beslemeye aktarma

NOT: Bir iplikçi şişesi, çok sayıda organoid gerektiren deneyler için 3. günden itibaren herhangi bir zamanda kullanılabilir. Organoidlerin rutin transferi laboratuvarımızda 6-8. günler arasında gerçekleşir. Ekipman mevcut değilse alternatifler için lütfen Tartışma bölümüne bakın.

1. Embriyoid cisimleri, 45 mL Aşama II ortam ile 125 mL'lik bir iplikçi şişeye aktarın. Manyetik karıştırıcı hızını 120 rpm'ye ayarlayın ve inkübatöre yerleştirin (Şekil 2I).
2. Embriyoid cisimleri veya böbrek organoidlerini beslemek için, böbrek organoidlerinin iplikçi şişenin dibine kısa bir süre yerleşmesine izin verin. Kapağı şişenin bir yan kolundan kaldırın ve aspire edici pipeti, ucu karşı iç duvara değecek şekilde içine yerleştirin.
3. Aspire edici pipeti yavaşça aşağı doğru açın ve ortamın yaklaşık yarısını aspire edin. Aynı açıklıktan pipetleyerek 20 mL taze Stage II ortamı ile doldurun.

7. 6 delikli manyetik karıştırma plakasının (6MSP) ayarlanması

NOT: Birden fazla koşulun test edilmesi gerekiyorsa, eğirici şişelerin yerine 6MSP formatı kullanılabilir. Bileşik veya nefrotoksin tedavileri için 6MSP'yi kullanın. Bu, difüzyon yoluyla besin mevcudiyetini korurken ikinci aşamada kullanılan ortam miktarını korur.

1. Oval manyetik karıştırma çubuklarını 50 mL'lik konik bir tüp içinde doku kültürüne uygun bir deterjanda (hiç kullanılmamışsa) yıkayarak temizleyin veya daha önce kullanılmışsa 1 saat > bekletin.
2. Steril DPBS'de 3x'i kısaca yıkayın.
3. 1x'i %70 etanolde 5 dakika, steril DPBS'de 1x yıkayın.
4. Yapışma önleyici çözelti ile durulayın ve steril DPBS'de 1x yıkayın ve aspire edin.
5. Dikkatlice, uzun steril forseps kullanarak, embriyoid cisimler veya böbrek organoidleri ile 6 delikli plakanın her bir kuyucuğuna bir manyetik karıştırma çubuğu yerleştirin.
6. Plakayı 6MSP'ye yerleştirin ve hızı 120 rpm'ye ayarlayın (Şekil 2J). Böbrek organoidlerini bölüm 4.2 ve 4.3'e göre yarı orta değişiklikle koruyun.
   NOT: Manyetik karıştırma çubuklarının yerine oturması ve dönmeye başlaması için, önce güç seviyesini kısaca 100'e ayarlamanız, ardından hepsi döndükten sonra güç seviyesini 25'e indirmeniz gerekebilir.

Protokolümüzün bu en son versiyonunda, böbrek organoid farklılaşması tanımlanmış, düşük proteinli bir ortamda başlatılır. Tahliller tamamen süspansiyon halinde gerçekleştirilir ve hPSC'lerin tübülogenezin başlatılması için farklılaşma ve organizasyonun doğuştan gelen yeteneğine dayanır. 100 mm ~% 60 oranında bir akıcılık hPSC kültür plakasından kaynaklanan tek bir tahlil, önceki yayınımızda gösterildiği gibi rutin olarak 500-1.000 böbrek organoidi verir5. Üretilen bu kadar çok sayıda organoid nedeniyle, bu protokol bileşik testi için çok uygundur. Bileşik testi için rutin olarak 6 delikli bir format kullanıyoruz, ancak bu protokol ikinci aşamada (3. günden itibaren) daha yüksek verimli bileşik testi için diğer çok kuyulu formatlara kolayca ölçeklendirilebilir. Parafin kesitlerinin immünofloresansı, organoidlerde nefron segmentlerinin, yani Hepatosit Nükleer Faktör-1 beta (HNF1B) ve Lotus Tetragonolobus Lektin'i (LTL) eksprese eden renal tübüllerin (Şekil 3A - HNF1B, LTL) ve V-maf Musküloaponevrotik Fibrosarkom onkogen homolog B (MAFB) ve nefrin (NPHS1) eksprese eden podosit kümelerinin varlığını göstermektedir (Şekil 3A - MAFB, Şekil 3B - NPHS1). Ayrıca, bu protokoldeki modifikasyonlar, kültürün 26. gününde Trombosit ve Endotel Hücre Adezyon Molekülü 1 (PECAM1) ile boyanmayı gösteren Şekil 3B'de görüldüğü gibi endotel hücrelerinin genişlemesini destekleyebilir.

Tablo 1: E5-ILP orta bileşim. Kimyasal olarak tanımlanmış lipitler ve anti-mikoplazma reaktifi dışındaki tüm reaktifleri doğrudan 0.22 μm Stericup filtrasyon ünitesinin üst odasına pipetleyin. Filtrasyondan sonra, lipitleri ve anti-mikoplazma reaktifini ekleyin. İki haftaya kadar 4 °C'de saklayın.

Tablo 2: Aşama II orta kompozisyon. Anti-mikoplazma reaktifi dışındaki tüm reaktifleri doğrudan 0,22 μm Stericup filtrasyon ünitesinin üst odasına pipetleyin. Filtrelendikten sonra, anti-mikoplazma reaktifi ekleyin. İki haftaya kadar 4 °C'de saklayın.

Şekil 1: Protokole genel bakış. İki aşamanın zamanlamasını ve iplikçi şişelerinin ve 6MSP'nin kullanımını gösteren protokole şematik genel bakış. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Protokolün aşamaları . (A) GCDR ile tedavi edilen hPSC kolonisinin parlak alan görüntüsü. (B) Böbrek organoid testine başlamak için optimal akıcılık ve koloni büyüklüğü. (C) 6 dakika boyunca dispase ile muamele edilen hPSC'ler. Kırmızı oklar, kıvrılan kolonilerin kenarlarına işaret eder. (D) Yörüngesel çalkalayıcı üzerinde organoid tahliller. (E) Büyük embriyoid cisimleri elemek için 200 μm hücre süzgecinin kullanılması. (F) Evre II ortama geçmeden önce 3. günde (D3) embriyoid cisimler. (G) Tübül oluşumunun ortaya çıkışı, 8. günde (D8) ve (H) organoid hasat ve tedavi için en uygun zaman noktasında 14. günde (D14) gözlemlenebilir. (I) Çok konumlu manyetik plaka üzerinde dökme kültür için kullanılan iplikçi şişesi. (J) Çok kuyulu manyetik karıştırma plakası üzerinde tahlil. Ölçek çubukları, 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Beklenen sonuçlar . (A) Tübül epitelisi (HNF1B ve LTL) ve podosit kümeleri (MAFB) için pozitif boyama gösteren 14. günün immünofloresan olarak etiketlenmiş parafin kesitlerinin temsili konfokal görüntüleri. (B) Podosit kümeleri (NPHS1) ve endotel hücreleri (PECAM1) için etiketlenmiş 26. Gün böbrek organoid bölümleri. Ölçek çubukları, 100 μm (A); 200 μm (B). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.