RNA'nın 1 H R1φ Gevşeme Dispersiyon Deneylerinin Numune Hazırlama ve Kurulumunun Pratik Yönleri

Özet

13 C/ ^{15 N}etiketli ve etiketsiz RNA'da mikro-milisaniye dinamikleri¹H R_1φ gevşeme dağılımı nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ile ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu protokolün odak noktası, NMR deneylerinin yüksek saflıkta numune hazırlanması ve kurulumunda yatmaktadır.

Özet

RNA, yapılardaki değişikliklerin RNA moleküllerinin hücresel haberciler ve modülatörler olarak yürüttüğü işlevlerde önemli roller oynadığı son derece esnek bir biyomoleküldür. Bu dinamik durumlar çoğu yapısal yönteme gizli kalırken, R_1φ gevşeme dağılımı (RD) spektroskopisi, mikro-milisaniye rejimindeki konformasyonsal dinamiklerin atomik çözünürlükte incelenmesini sağlar. Gözlemlenen çekirdek olarak ¹H'nin kullanılması, kapsanan zaman rejimini daha da genişletir ve hidrojen bağlarına ve baz eşleştirmesine doğrudan erişim sağlar.

Böyle bir çalışmadaki zorlu adımlar, potansiyel olarak 13 C ve ^{15 N}etiketli yüksek saflık ve yüksek verimli numune hazırlamanın yanı sıra, daha önce görünmeyen devletin popülasyonunu, döviz kurunu ve ikincil yapısını çıkarmak için deneylerin kurulumu ve verilerin takılmasıdır. Bu protokol, uygun bir RNA örneğinin hazırlanmasını ve hem izotopik olarak etiketlenmiş hem de etiketlenmemiş RNA örnekleriyle ¹H R_1φ deneyinin kurulumunu sağlamak için numune hazırlamada çok önemli uygulamalı adımlar sağlar.

Giriş

RNA'lar hücrede çok sayıda düzenleyici^1,katalitik²ve yapısal 3 işlevi gerçekleştirir,^bunların çoğu esnek bir moleküler yapı ve bu yapıların karmaşık değişiklikleri ile ilişkilidir⁴,^5,6,7. Düşük nüfuslu durumlar, yapı belirleme yöntemlerinin çoğunda görünmez kalır veya bu gizli durumların yüksek atomik çözünürlükte incelenmesine izin vermez. Çözüm durumu nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, bireysel atom çekirdeklerine erişim sağlayarak ve tüm zaman rejimleri boyunca dinamikleri hedefleyen büyük bir deney araç kutusu sunarak her iki yönü birleştirir⁸. RD NMR denemeleri, temel eşleştirme desenlerinde ve yerel yapısal yeniden düzenlemelerde değişikliklerin beklenebilir olduğu ara zaman ölçeğinde konformasyonsal değişime erişim sağlar⁵,^9,10^,11,12,^13,14. RD deneyleri, Carr-Purcell-Meiboom-Gill darbe treni 15 şeklinde uzun R₂ ölçümleri veya R^1φ RD deneyleri₁₆ olarak adlandırılan dönen çerçevede gevşeme ölçümleri olarak^{gerçekleştirilir.}

Her ikisi de nüfus ve döviz kuru ve kimyasal kayma farkını küçük duruma çıkarmak için kullanılabilse de, R_1φ RD deneyleri aynı zamanda heyecanlı devletin kimyasal kayma farkının işaretini verir. Bu, RNA yapılarındaki kimyasal kayma ile güçlü bir şekilde ilişkili olan ikincil yapı üzerinde bir çıkarım sağlar¹⁷. Kimyasal kayma, nükleobazlardaki aromatik protonlar ve karbonlar, imino protonlar için baz eşleştirme ortakları ve C4' ve C1' atomları üzerindeki şeker büzücüleri durumunda helicity'nin iyi bir göstergesidir^18,19. Son zamanlarda daha yüksek spin kilidi (SL) gücü kullanan bir kimyasal değişim doygunluk transferi (CEST) deneyinin, böylece CEST deneyinin uygulanabilirliğini daha hızlı değişim zaman ölçeklerine kaydırdığı, heyecanlı bir duruma sahip sistemler için R_1φ RD deneyine alternatif olarak yayınlandığı belirtilmelidir.

Yapısal değişime erişmek için sıklıkla ¹³C ve ¹⁵N izotopları kullanılmış olsa da, bu laboratuvardan yapılan son çalışmalarda aromatik ve imino protonlar konformasyonsal değişim için prob olarak^{kullanılmıştır 9,10}. Gözlemlenen çekirdek olarak ¹H'nin kullanılması, örneğin daha hızlı ve daha yavaş zaman ölçeklerinde değişime erişim, daha yüksek hassasiyet ve daha kısa ölçüm süreleri gibi çeşitli avantajlar getirir. Bu, heteronükleer manyetizasyon transferi yerine homonükleer skaler kavramalar kullanarak tek boyutlu (1D) spektrumun kafeinsizleştirilmesi yoluyla aromatik protonlara erişim sağlayan ve izotop etiketlerine olan ihtiyacı ortadan kaldırarak SELective Optimize Edilmiş Proton Deneyi (SELOPE) yaklaşımı ile daha da kolaylaştırılmıştır²⁰. Bu protokol, eşit ¹³C/_{15 N} etiketli ve etiketsiz numunelerin ¹H R^1φRD deneylerindeki ölçümü ele alıyor. Bu nedenle, bu makale farklı numune hazırlama ihtiyaçları için en çok yönlü olduğu tespit edilen bir örnek hazırlama yöntemi sunun²¹ ve bu makalenin son bölümünde alternatifleri ele almaktadır (Şekil 1).

Bu noktada okuyucu, 1 H R ^1φRD deneyleri için diğer numune hazırlama tekniklerinin kabul edilebilir olduğunu, sunulan teknikle sentezlenen örneklerle yapısal ve fonksiyonel analizin diğer yöntemlerinin de yapılabileceğini belirtmelidir. ¹ H R_1φ RD deneyleri, moleküler dinamiklerin güvenilir bir şekilde karakterizeini sağlamak için hem RNA uzunluğunda hem de yapısal konformasyonda yüksek RNA konsantrasyonları (ideal olarak >1 mM) ve yüksek homojenlik gerektirir. In vitro transkripsiyon (IVT), etiketli nükleozid trifosfatların (NTP' ler) ve facile indüksiyonunun enzymatic reaksiyon^22'debulunması nedeniyle birçok araştırmacının ¹³C/¹⁵N etiketli RNA örnekleri üretmesi için tercih edilen yöntemdir. Bununla birlikte, yaygın olarak kullanılan T7 RNA polimeraz (T7RNAP)^23,24,25, belirli başlatma dizileri durumunda düşük 5' homojenlikten^{muzdariptir 26 , 27} ve genellikle transkripsiyon ikinci tur²⁸sırasında 3' homojenlik . Hedef RNA türlerinin saflaştırılması, büyük miktarlarda ~ 200 nmol ihtiyacı nedeniyle daha pahalı ve zahmetli hale gelir. Burada kullanılan yöntem daha önce avantajların tartışıldığı²¹. Kısacası, açıklanan sorunları, daha sonra Escherichia coli RNase H tarafından özellikle bölünen, kimerik oligonükleotid^29,30 tarafından yönlendirilen daha büyük bir tandem transkript yazarak çözer (ayrıntılar için Bkz. Şekil 2).

Tandem transkriptin 5' ve 3' uçlarında bir aralayıcı dizisinin dahil edilmesi, yüksek verimli bir başlatma dizisinin kullanılmasına ve plazmid şablonunun doğrusallaştırma bölgesine yakın terminal çıkıntilarının kaldırılmasına izin verir (Şekil 2B). Yöntemin, daha karmaşık bir şablon sentezi ve ek bir enzim ve oligonükleotid ihtiyacı ile maliyet ve işçiliği azaltırken, verimi önemli ölçüde artırdığı gösterilmiştir. RNase H bölünmesinin yüksek özgüllüğü, benzer boyut aralığında RNA türlerinin eksikliği nedeniyle arınma sağlar. Mevcut protokol, bu laboratuvar tarafından yakın zamanda yayınlanan bir iyon değişimi yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) adımı kullanır³¹Diğer yöntemler olası alternatifler olmasına rağmen. ¹ H R_1φ RD, genel olarak, iki ilgili darbe dizisine sahip etiketli veya etiketsiz örneklerde elde edilebilir, "etiketli" ¹H R_1φ heteronuclear tek kuantum korelasyonu (HSQC) tabanlı deney ^{ile 13}C dolaylı boyut¹⁰ ve "etiketsiz" ¹H R_1φ SELOPE tabanlı deney ile ¹H indirekt boyut²⁰.

Bu iki boyutlu (2D) deneyler, R_1φ zaman ölçeğindeki dinamiklerin örnekte bulunup bulunmadığına bakılmaksızın ilk denetim görevi görebilirsiniz. Spektrumdaki tüm çözümlenmiş tepeler için RD'ye genel bir bakış elde edilebilir ve daha kapsamlı bir RD analizi için ilgi çekici zirveler belirlenebilir. Bu, etiketlenmemiş numunelerin bile daha pahalı, etiketli bir örnek üretme kararı almadan önce kontrol edilebileceği anlamına gelir. Konformasyonsal değişim katkısına sahip bir zirve daha ayrıntılı bir şekilde çalışılmak üzere seçildikten sonra, yukarıdaki deneylerin 1D sürümlerine geçmek en iyisidir (zirve hala çözülebilirse) sözde rezonans dışı deneyler yapmak için. Etiketli versiyon için, ¹³C'ye HSQC aktarımı, SELOPE deneyi durumunda,13 C R ^1φdeneylerinde 32 , 33 ,^{34 ,}35 'te kullanıldığı gibi seçici bir heteronükleer çapraz polarizasyon^(HCP)adımı ile değiştirilir, deney sadece bir 1D olarak çalıştırılır, bu da özellikle 2D'de diyagonal üzerinde yatan H8 ve H2 sinyalleri için yararlıdır. Her ikisinin de etiketli ve etiketsiz bir örneğin mevcut olması koşuluyla, hangi sıranın kullanılacağına ilişkin bir kriter, iki deneyde ilgi zirvesinin ne kadar iyi yalıtılmış olduğudur.

Genel olarak, SELOPE deneyi 50 nükleotide kadar RNA örnekleri için önerilir. Daha büyük RNA'lar için çakışma daha büyük olacaktır; bununla birlikte, yapısal olarak ilginç nükleotitler genellikle daha az üst üste binen ve daha büyük RNA'larda hala erişilebilir olabilen kimyasal kayma bölgelerinde görülür. Başka bir argüman, etiketlenmemiş örneklerde, ¹H ile ¹²C arasında J bağlantısı oluşmadığıdır. Bununla birlikte, minimum döndürme kilidi gücü, etiketli deneyde bu iki dönüşü (~1 kHz) ayırmak için kullanılan minimum güçle tanımlandığı için, etiketlenmemiş deneme, daha geniş bir spin kilidi (SL) güçlü yönlerinin kullanılmasına ve bu nedenle daha geniş bir değişim zaman ölçeğine erişime izin verir. Bu rezonans dışı deneyler, heyecanlı devletin popülasyonu (alternatif konformör), p ES gibi k_ex'eek bilgiler ve_Δω (zemin durumunun kimyasal kayma farkı ve heyecanlı durum) şeklinde çok değerli kimyasal kayma bilgileri sağlar.

Şekil 1: Sunulan protokolün iş akışı. Şablon hazırlama ve başarılı in vitro transkripsiyon ve RNase H dekolte teyidsinden oluşan gerçek büyük ölçekli numune üretiminden önce hazırlık. HPLC saflaştırma, NMR tüpünün doldurulması ve RNA katlama onayı dahil olmak üzere büyük ölçekli üretim. Izotop etiketli sentez durumunda, aynı gün gradyan optimizasyonu için etiketsiz bir saflaştırma yapılmalıdır. R_1φ deneyleri ile konformasyonsal dinamiklerin NMR karakterizasyonu. Her adım bağımsız olarak gerçekleştirilebilir, örneğin ¹H R_1φ RD analizi başka bir yöntemle üretilen herhangi bir uygun RNA örneğine uygulanabilir. Kısaltmalar: IVT = in vitro transkripsiyon; HPLC = yüksek performanslı sıvı kromatografisi; NMR = nükleer manyetik rezonans; RD = gevşeme dağılımı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu protokolün amacı, RNA saç tokası moleküllerinde 1 H R _1φ gevşeme dağılımı ile konformasyonsal dinamiklerin incelenmesi için pratik ayrıntılar ve kritik parametreler sağlamaktır. ¹³C/¹⁵N etiketli sürümler olarak tüm, bazıları veya hiçbiri NTP'leri kullanılarak gerçekleştirilebilen bir hedef RNA'nın tasarımı, sentezi ve iyon değişimi HPLC saflaştırmasının ayrıntılı bir protokolünü sağladıktan sonra, NMR örneğini sonlandırma ve NMR spektroskopisi ile konformasyonel değişimi onaylama iş akışı açıklanmıştır. Son olarak, Bruker NMR spektrometresi üzerinde ¹H R_1φ RD deneylerinin kurulumu için ayrıntılar açıklanmıştır (Şekil 1). Protokol, etiketli örnekler ve ek yorumlar için 1D sürümü ayarlamak için her adımı ve SELOPE sürümünün(Tablo 2)kurulumu için ayarlamak üzere bir tablo verir. Protokolden sonra, kritik adımlar ve örnek hazırlama ve 1 H R ^1φRD kurulumu için alternatif yollar tartışılır.

Protokol

Şekil 2: Bildirilen tandem IVT protokolünün şematik gösterimi. (A) T7RNAP (solda) ile doğrusallaştırılmış bir plazmid şablonundan tandem transkripsiyon ve bir kimerik DNA kılavuzu (sağda) tarafından yönlendirilen hedef uzunluk RNA'sına ulaşmak için transkriptin RNA'sı tarafından ardışık bölünme. (B) Viral T7RNAP promotöründen başlayarak tandem şablonunun ayrıntılı şeması, bir başlatma dizisi. Hedef sıra (koyu mavi, örnek burada 20 nt uzunluğunda) "n" kez yinelenir. Tekrarlar, ilk ve son tekrar ünitesinden başlatma ve kısıtlama sıralarının kaldırılmasına izin vermek için sırasıyla son sekiz ve ilk dört nükleotitten oluşan 5′ ve 3′ ara dizileri tarafından kuşatılmıştır. (C) Tandem transkript (kırmızı) ve kimerik bölünme kılavuzlarının (yeşil) hibridizasyonu. RNase H, DNA 5′ ucunun karşısındaki RNA'yı ayırır. 2′-OMe RNA kanatları, göğüs dekolte kılavuzunun hedef RNA'ya bağlayıcı benzeşimini artırarak özgüllüğü arttırır. Bu rakam ²¹'den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: T7RNAP = T7 RNA polimeraz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Yeni bir RNA yapısı için çalışma hazırlama

1. Plazmid tasarımı ve hazırlanması
   1. Şablon dizisini bir klonlama aracına yazın, örneğinSeri Klonlayıcı.
   2. T7 promotör sırasını alın ve yüksek verimli bir başlatma dizisi ekleyin (T7: 5'-TAATACGACTCACTATA ^GGGAGA-3').
      NOT: Transkripsiyon, bir şapka (^) ile belirtilen nükleotide başlayacaktır. Başlatma sırası GGGAGA değişkendir, ancak kuvvetle sıraya bağlıdır; bu nedenle, bu sıranın kullanılması önerilir.
   3. Hedef sıranın son 8 nükleotidini (nt) 5' aralayıcı (5'ler) olarak ekleyin.
   4. Hedef sıranın (TS) yinelemelerini ekleyin.
   5. Tekrarlardan sonra ilk dört nükleotitleri 3' aralayıcı olarak ekleyin (5'ler).
   6. BamHI kısıtlama sitesi (RS) veya benzer benzersiz kısıtlama sitesi ekleyin.
      NOT: Gösterilen toplam sıra klonlanacak veya bakteriyel bir yüksek kopya plazmidinde(örneğin,pUC19): 5'-T7-5'S-(TS)_{n -3'S-RS-3'}(Şekil 2B)olarak sıralanacaktır. Tekrar sayısı gen sentezinin izin verdiği kadar yüksek olmalıdır (bu protokolde en fazla 600 nt).
   7. Ticari bir kit kullanarak E. coli'deki plazmidi güçlendirin.
   8. Saflaştırılmış plazmidi uygun kısıtlama bölgesini kullanarak 20 ng/μL'de doğrusallaştırın. Ölçek kısıtlaması BamHI ile 1 mL'ye kadar sindirilir.
   9. Sindirilen plazmidi arındırın ve% 1 agarose jel üzerinde başarılı doğrusallaşmayı onaylayın. Doğrusal plazmidi -20 °C'de birkaç ay saklayın.
2. Dekolte kılavuzu tasarımı (Şekil 2C)
   1. Hedef RNA dizisinin son sekiz nükleotidini 5'-3' yönde yazın ve hedef RNA dizisinin ilk dört nükleotidini 3' uçta da 5'-3' yönde ekleyin.
   2. Bu dizinin ters DNA tamamlayıcısını oluştur
   3. Nükleotid harfinden önce bir 'm' ekleyerek ilk ve son dört nükleotitleri 2'-OMe modifikasyonlarına değiştirin.
      NOT: Sentez için mT yerine mU kullanılır.
   4. Standart tuzdan arındırma ile oligo sipariş edin.
      NOT: Oluşturulan oligonun iki RNA dizisinin bağlantısı dışında başka bir yere bağlanıp bağlanamayacağını kontrol edin. Orta dört DNA nükleotidinde tam tamamlayıcılık gerekirken, yan bölgeler uyumsuzluklara izin verebilir. Gerekirse, benzersiz bir bağlama dizisi oluşturmak için kanatları 18 nt'ye kadar uzatın³⁶.
3. Küçük ölçekli IVT
   NOT: RNase içermeyen çalışmalar için tüm reaktifleri steril ve RNase içermeyen koşullar altında hazırlayın. Çalışma yüzeylerini ve pipetleri kullanmadan önce temizlemek için RNase dekontaminasyon reaktifi (Bkz. Malzeme Tablosu)ve % 95 v/v etanol kullanın. Eldivenleri % 95 etanol ile yıkayın ve tüy bırakmayan uzun kollu kıyafetler giyin. RNase kontaminasyonünü en aza indirmek için açık tüpler üzerinde nefes almayın.
   1. Tris-Cl (pH 8.0), dithiothreitol, MgCl₂, spermidin ve NTP/GMP (unbuffered) stok çözeltilerini hazırlayın. Reaktifleri Tablo 1'degösterildiği gibi karıştırın. Enzimlerin veya nükleik asitlerin eklenmesinden önce, bu reaktiflerin ana karışımını önceden hazırlayın.
      NOT: Donmuş reaktifler kullanıyorsanız, çözdükten sonra iyice karıştırın. Reaktifler çok yüksek konsantrasyonlarda karıştırılırsa çökelebilir, bu nedenle Tablo 1'dekisırayı izlemeniz şiddetle önerilir.
   2. Aşağıdaki sırayla ekleyin: plazmid, dekolte kılavuzu, inorganik fosfataz (IPPase), RNase H, T7RNAP. Enzim aktivitesi şirket içinde üretilen enzimler için değişebileceğinden, en iyisini seçmeden önce birkaç konsantrasyonu test edin.
      NOT: Eksik bir hedef bandı kusurlu RNase H dekoltesine bağlamak ve başarısız transkripsiyona değil, örneğin RNase H olmadan bölünme reaksiyonu için negatif bir kontrol ekleyin.
   3. Reaksiyonu 37 °C'de 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın ve denatüre poliakrilamid jel elektroforez (PAGE)(Şekil 3A)üzerindeki reaksiyonu onaylayın. Numuneyi yükleme çözeltisinde 10 kat seyreltin ve jel üzerine 1 μL yükleyin.
      NOT: Jel karışımı: 1x TBE'de 8 M üre, akrilamid (19:1 akrilamid:bisacrylamide). Yükleme çözeltisi: 5 mM etilenediamin tetraasetik asit (EDTA), formamidde 300 μM bromofenol mavisi. RNase H dekolte reaksiyonlarının 1 saat sonra tamamlanması beklenemez, çünkü sürekli yeni RNA üretilir. Bu noktada, net bir hedef bandına ve benzer moleküler ağırlıkta bir türün yokluğuna dikkat edin(örneğin,±3 nükleotid (nt) ürünleri).

Reaktif	Stok konsantrasyonu	Miktar küçük ölçekli (μL)
H2O	-	24
Tris	1 M	5
MgCl2	1 M	0.5
DTT	1 M	0.5
Spermidin	250 mM	5
GMP	100 mM	2.5
ATP	100 mM	1.5
GTP	100 mM	1.5
UTP	100 mM	1.5
CTP	100 mM	1.5
Plasmid	20 ng/μL	5
Dekolte kılavuzu	100 μM	10
iPPase	10 mg/mL	0.5
RNase H	10 μg/mL	2
T7 RNA polimeraz	5 mg/mL	2

Tablo 1: Tandem IVT ve eşzamanlı RNase H dekolte için reaktif tablo. Stok konsantrasyonlarıkullanıcınınrahatlığına uyarlanabilir. T7 IVT'den sonra RNase H dekoltesi yapılması gerekiyorsa, T7RNAP ısı inaktivasyonundan sonra dekolte kılavuzu ve RNase H ekleyin. Reaksiyon ölçeği ile doğrusal olarak ölçeklenmiş olarak kullanılan tutarlar. Kısaltmalar: T7RNAP = T7 RNA polimeraz; IVT = in vitro transkripsiyon.

2. NMR numune hazırlama

1. Reaksiyonun istediğiniz birime (genellikle 10 mL) ölçeğini yükseltin ve reaksiyonun gece boyunca çalıştırın. Ertesi gün bir denatüre PAGE jeli ile reaksiyon tamamlama testi (Şekil 3A).
   NOT: Eksik bölünme reaksiyonı, hedef bandın üzerindeki daha yüksek moleküler ağırlık türleri tarafından gösterilir.
   1. Dekolte başarılı veya eksiksiz değilse, çözeltiyi 15 s için 450 W'ta geleneksel bir mikrodalgada ısıtarak reanneal RNA ve reaksiyon kabındaki bölünme kılavuzu.
   2. Çözeltiyi 40 dakika boyunca yavaşça 37 °C'ye soğutun. 1 mL'nin altındaki hacimler için bir ısıtma bloğu kullanın. Yeni çökeltici oluşumuna dikkat edin.
   3. Daha fazla IPPase ve RNase H ekleyin ve 37 °C'de 1-3 saat daha kuluçkaya yaslanın. Dekolte reaksiyonunun tamamlandığını denatüre PAGE ile onaylayın.
   4. RNase H bölünme reaksiyonu tamamlandığında, 50 mM son konsantrasyona ve girdaplara EDTA ekleyerek reaksiyonu iyice söndürün.
      NOT: Potansiyel pirofosfat çökeltme çözünür ve yeni protein çökeltir.
   5. Çözeltiyi 0,2 μm şırındıcı filtreden filtreleyin ve enjeksiyon döngüsü boyutuna bağlı olarak HPLC sistemine enjekte edilebilen bir hacme konsantre olun.
      NOT: Protokol burada -20 °C'de numune dondurularak duraklatılabilir.
2. Büyük ölçekli HPLC saflaştırma
   1. İyon değişimi arabelleği A ve B'yi kullanımdan sonraki bir hafta içinde hazırlayın. Tamponları filtreleyin ve gazdan arındırın.
      NOT: Tampon A: 20 mM sodyum asetat; 20 mM sodyum perklorat, pH 6.5. Tampon B: 20 mM sodyum asetat; 600 mM sodyum perklorat, pH 6.5.
   2. Sütunu 0 B tamponu ve ardından 75 °C'de en az 2 sütun birimi için 0 arabellek A ile dengele.
   3. HPLC dizisini (Şekil 3B) 5,5 mL / dak'lık bir akış hızında hazırlayın. 20 ila 30 nt arasında büyüklükte bir RNA'nın saflaştırılması için aşağıdaki sırayı kullanın: 0-7 dk: %0 B; 7-16 dk: gradyan %0-20 B; 16-46 dk: tipik olarak% 20-30 B gradyan ile elution (iztiyaca göre optimize edin); 46-62 dk: 0 B; 62-73 dk: %0 B.
      NOT: Akış hızında 5,5 mL/dk'ya yapılan bir değişiklik bu protokoldeki ayrımı etkilemedi.
   4. Bir seferde 1 mL transkripsiyon reaksiyonuna (etiketsiz) eşdeğer bir enjeksiyonla elution gradyanını optimize edin.
      NOT: Daha fazla ayrıntı ve tartışma için Karlsson ve ark.³¹ ve Feyrer ve ark.²¹'e bakın.
   5. Denatüre page üzerinde toplanan kesirleri test edin. Ana elution zirvesi iyi yalıtılmışsa ve saf hedef RNA'yı içeriyorsa, saflaştırmayı 10 mL transkripsiyon reaksiyonuna eşdeğer bir şekilde ölçeklendirin.
   6. İlgi kesirlerini toplayın, yoğunlaştırın ve arabelleği NMR arabelleğiyle değiştirin. 50 mL'nin üzerindeki hacimler için ultrasantrifüj filtre ünitesi kullanın (Malzeme Tablosunabakın).
      NOT: NMR tamponu: 15 mM sodyum fosfat; 25 mM sodyum klorür; 0.1 mM EDTA, pH 6.5. Plastik boru duvarlarına bağlı kalan RNA'dan kaynaklanan kaybı en aza indirmek için, tüm sıvıları toplamak için tüm toplama tüplerini 1 mL su, girdap ve santrifüjle yıkayın.
   7. Ultraviyole spektroskopisi ile konsantrasyonu belirleyin. Reaksiyon verimini Feyrer ve^ark.
      NOT: RD deneyleri için bir NMR örneğinin konsantrasyonu, NMR tüpleri(Malzeme Masası)kullanılarak 250 μL'lik bir numune hacminde 500 μM'ye karşılık gelen 130 nmol'ün altında olmamalıdır.
3. RNA örneğinin katlanır
   1. ~10 mL'lik bir hacmin örneğini tüp başına 1 mL'ye seyreltin ve aliquot edin.
   2. RNA aliquots'ı 5 dakika boyunca 95 °C'ye ısıtın.
   3. Numuneleri buza veya su-buz-tuz karışımına yerleştirerek soğutun ve 30 dakika kuluçkaya yatırın.
   4. Havuz örnekleri ve konsantre 2 mL santrifüj filtre ünitesinde ~250 μL.
4. NMR tüpünün doldurulması
5. 
   
   1. 
      

1. 2. 
      
2. 
   
3. 1. 
      
4. 4. 
      
   5. 
      

		&

6. 2. 
      
   4. 
      

2. 2. 
      

Sonuçlar

RNA üretimi protokolü, yüksek saflıkta transkriptlerin üretilmesi yoluyla saflaştırmayı kolaylaştırır. Şekil 3A, tandem transkriptlerin birkaç bölünme reaksiyonunun sonuçlarını gösterir ve hem başarılı hem de başarısız reaksiyonlar sağlar. Lane 1, yan ürünlerin sadece silik izlerine sahip tamamen bölünmüş bir transkriptin en uygun kasasını gösterir. Lane 2a, yeniden tavlama ve daha fazla RNase H eklenmesiyle çözülebilen eksik bölünme gösterir (Lane 2b, adım 2.1.2). 1, 2a ve 2b şeritlerinin RNA yapıları aynıdır. Şerit 3'teki örnek başarısız dekolte gösteriyor. Bu reaksiyonun giderilmesi, bölünme kılavuzu dizisinin, DNA şablonunun saflığının ve tavlama sıcaklıklarının kontrolunu içerir. Potansiyel olarak, RNase H dekoltesi, örnek 2 için gösterildiği gibi T7 IVT'den sonra yapılmalıdır.

Şerit 4'teki örnek, iyon değişimi HPLC ile çıkarılması zor olan önemli miktarda bölünme yan ürünü gösterir. Böyle bir numunenin sorunlarının giderilmesi, (a) sıcaklığın, RNase H miktarının veya reaksiyon süresinin azaltılmasını, (b) elution gradyan ve enjeksiyon hacminin azaltılmasını ve hedef kesirlerin yan ürünlerden ayrılmasına çalışılmasını içerebilir. İyon değişiminde çözünürlüğün nasıl artırılacağı hakkında daha fazla bilgi HPLC saflaştırma Karlsson ve ark.³¹. HPLC, hedef RNA'yı daha uzun veya daha kısa nükleik asitlerden ve protein veya küçük moleküllü kirleticilerden ayırır. Şekil 3B, iyon değişimi HPLC saflaştırması için en uygun sonucu göstermektedir. Elution gradyanı, hedef RNA türünün bir sonraki küçük türden sonra en az bir sütun hacmini (bu örnekte: 35 mL) ve bir sonraki büyük türden önce bir sütun hacmini atlatacak şekilde seçilmelidir.

Bu yöntemdeki daha küçük türler arasında tek nükleotitler, iptal edici ürünler (8-12 nt), 3' ve 5' ara sıraları (5-14 nt) ve bölünme kılavuzu (12 nt kimerik nükleik asit) bulunurken, daha uzun diziler potansiyel olarak temizlanmamış tandem tekrarları ve plazmiddir. İyi ayrılmış bir elution zirvesi elde edildiğinde, saflaştırma enjeksiyon başına ~20 mL IVT reaksiyonuna eşdeğer olacak şekilde ölçeklendirilebilir. Bir RNA örneğinin doğru katlanmış olması RD deneyleri için çok önemlidir ve her ölçümden önce onaylanması gerekir. Şekil 4, 2.4 (mavi) adımdaki katlama protokolü uygulanmadan önce A etiketli 22 mer RNA'yı ve doğru katlama elde edildikten sonra aynı örneği göstermektedir (kırmızı). Bir Mc-Fold ikincil yapı tahmini (Şekil 4C) sunulan saç tokası yapısını 4 baz çifti ile 5 imino sinyalle sonuçlanır.

Şekil 4A'daki her iki spektrum da, biraz farklı göreceli yoğunluklarda da olsa, bu tahmin edilen sinyalleri doğrular, bu da bazı yanlış katlanmış yapının (burada, bir dimer) sadece 1 H ^1Dspektrumla değerlendirilmesinde sorunlu olabileceğini gösterir. Aromatik ¹H,¹³C-HSQC spektrumu (Şekil 4B), ancak katlama protokolünden (mavi) önce numune için aromatik sinyallerin sadece 3'ünü gösterir, ancak 2.4 adımına (kırmızı) göre katlanmış numune için 4 sinyalin tümünü gösterir. Mavi renkte gösterilen örnek muhtemelen saç tokası ile aynı imino sinyallerle sonuç olacak bir homodimer (Şekil 4D'deönerilen yapı) oluşturmuştur. A13H2 sinyali değişim açısından genişlemiş görünüyor. Bu sonuçlar, her RD deneyinden önce hem imino hem de aromatik parmak izi deneyleri ile katlama onayının önemini vurgulamaya yardımcı olur. Bu protokolde açıklanan ¹H R_1φ darbe dizileri, ara değişim rejimindeki dinamiklerin algılanmasını sağlar. Başlangıçta bir on-rezonans eğrisi kaydedilir ve belirli bir kalıntı için dinamikler varsa, elde edilen R₂+R_EX değerleri içinde bir dağılım görünürken, bu eğri değişimsiz kalıntılar için düzdür.

Şekil 5, sentetik bir RNA saç tokasında iki farklı H8 atomunda elde edilen temsili rezonans eğrilerini gösterir (Şekil 5A), burada G6H8 değişim yaşar (Şekil 5C), A4H8 ise (Şekil 5B). Değişim bu örnekte nispeten yavaş olduğundan(k_EX = 292 ± 40 Hz), SELOPE deneyinin düşük SL güçlü yanlarına ulaşma avantajından yararlanıldı ve iki rezonans eğrisi darbe dizisinin 1D sürümü kullanılarak kaydedildi. Aynı darbe dizisi daha sonra on-rezonans profilinde dağılım gösteren kalıntı için rezonans dışı veri elde etmek için kullanıldı. Şekil 5D, elde edilen R_1φ değerlerini ve eğrinin hafif bir asimetrisinin zaten Δωişaretini gösterdiği ofseti gösterir.

Bu, R₁ katkısının kaldırıldığı R₂+R_EX arsasında daha da belirgin hale gelir ( Şekil5E). Aynı şeklin sağ sütunu, iki farklı H8 atom için elde edilen temsili on-rezonans eğrilerini daha hızlı değişime sahip biraz farklı sentetik RNA saç tokasında gösterir, burada G6H8 değişim yaşar (Şekil 5G), A4H8 ise (Şekil 5F). Daha hızlı döviz kuru(k_EX = 43.502 ± 38.478 Hz), hem açık hem de rezonans dışı verileri (Şekil 5H,I'degörüntülenen G6H8 verileri) elde etmek için SELOPE 2D sürümünü kullanarak tüm aromatik protonların rd kaydına izin verdi.

Olumlu ve olumsuz sonuçlar için genel tanımlayıcılar
Tandem IVT ve RNase H dekoltesinde olumlu sonuçlar şu şekilde tanımlanabilir: 1) Hedef bant denatüre PAGE jeldeki en güçlü banttır. 2) Ana bandın etrafında zayıf bantlar yoktur veya sadece zayıf bantlar yoktur. 3) Daha yüksek moleküler ağırlıklı türler yoktur veya sadece zayıftır. 4) HPLC kromatogramı, hedef RNA'nın iyi ayrılmış bir zirvesini gösterir. 5) Ana tepe örneklendiğinde, denatüre page jel üzerinde sadece bir bant görünür.

Tandem IVT ve RNase H dekoltesinde negatif sonuçlar şu şekilde mevcuttur: 1) Denatüre page jel üzerinde hayır veya sadece zayıf bir ana bant görülebilir. 2) RNA tandem tekrarlarından yüksek moleküler ağırlıklı türlerin bir deseni görülebilir. 3) Ana bant mevcut olmasına rağmen, benzer yoğunlukta bantlar ± 3 nt içindeki ana bandın üstünde veya altındadır.

İyi katlanmış bir örnek aşağıdaki gibi tanımlanabilir: 1) Gözlemlenen imino protonların sayısı, ikincil bir yapı simülasyonundan beklenen imino proton sayısıyla eşleşir (örneğin,Mc-Fold³⁹, Şekil 4A). 2) Bir UUCG döngüsündeki (varsa) syn G-U sallantı taban çifti ~ 9,5 ppm'de görülebilir, bazen sadece daha düşük sıcaklıkta görülebilir. UUCG döngüsünün daha fazla parmak izi Fürtig ve meslektaşları tarafından tanımlanmıştır⁴⁰. 3) Aromatik parmak izi, doğru katlandığında onaylanmış daha önce atanmış bir örnekle aynı fikirdedir (Şekil 4C).

Yanlış katlanmış veya bozulmuş bir örnek aşağıdaki gibi tanımlanabilir: 1) İkincil bir yapı simülasyonunun öngördüğünden daha fazla imino sinyali vardır (NOT: daha az imino sinyali, kapanış taban çiftleri genellikle görünmediği ve konformasyonsal değişim çizgileri genişletdiği için mutlaka yanlış katlanma anlamına gelmez). 2) İmino sinyallerinin yokluğu. 3) Aromatik bölgede tek nükleotid bozunma ürünlerini gösteren yüksek yoğunluklu dar sinyaller. 4) Onaylanmış katlama referans örneğine imino veya aromatik sinyaller arasında ayrışma (Şekil 4C).

Algılanabilir zaman ölçeğinde değişim göstermeyen bir atom aşağıdaki gibi tanımlanabilir: 1) düz bir RD profilinden (uygulanan SL gücüne göre değişen eksik R_EX katkısı nedeniyle) (Şekil 5B ve Şekil 5F). 2) k_EX ve Δω aynı büyüklükteki olduğunda yavaş ara değişim durumunda dikkatli olunmalıdır. Bu durumda, on-rezonans katkısı Şekil 5C'de görülebileceği gibi çok küçük olabilir (bu durumda takılan parametreler k_EX = 292 ± 40 Hz ve Δω = 112 ± 4 Hz'dir). Şüpheniz varsa, doğrulama için düşük bir SL rezonans eğrisi kaydedilebilir.

Ara zaman ölçeğinde değişimi gösteren bir atom, 1) on-rezonans RD deneyinde düz olmayan bir gevşeme dağılımı profilinden tanımlanabilir (Şekil 5B ve Şekil 5F); 2) HSQC veya SELOPE deneyinde daha geniş bir çizgi genişliği de değişim için bir gösterge olabilir.

Rezonans dışı eğriler için iyi seçilmiş SL güç değerleri (Şekil 5E, F): 1) on-rezonans eğrisinde önemli bir k _EX katkısına sahiptir (seçilen SL güç değerleri Şekil 5C ve Şekil 5G'debelirtilmiştir). 2) En az 3 SL güç değeri için rezonans dışı eğriler ölçüldüğünden, seçilen SL güç değerleri k_EX katkı ile on-rezonans eğrisinin bölgesine yayılmalıdır. 3) Laguerre sığdıktan sonra düz olmayan R₂+R_EX eğrilerine yol açar (örneğin, Şekil 5D: SL mukavemetleri 25, 50 ve 75 Hz; Şekil 5E).

Rezonans dışı eğriler için kötü seçilmiş SL güç değerleri (Şekil 5E, F) Laguerre sığdıktan sonra düz R₂+R_EX eğrilerine yol açar. Bir örnek gösterilmiştir Şekil 5E, burada 100 Hz rezonans eğrisi çok düzdür ve bu nedenle Δωhakkında önemli bilgi sağlamaz.

Dönen çerçeveli nükleer Overhauser etkisi (ROE) eserleri için endikasyonlar: 1) Rezonans eğrilerinden elde edilen Δω, nükleer Overhauser etkisi spektroskopisi (NOESY) spektrumundaki ilginin zirvesi ile çapraz bir tepe gösteren uzaysal çevre / protonlardaki protonların kimyasal kaymalarıyla eşleşir. (örneğin, Şekil 5I, hızlı ara değişim için beklendiği gibi geniş rezonans dışı eğriler gösterir, ancak eğriler -3000 Hz ve +1500 Hz'de daha keskin özelliklere de sahiptir. Bunlar büyük olasılıkla farklı bir konformörde bu H8 için kimyasal bir kayma yerine bir ROE eserinden kaynaklanmaktadır). 2) Laguerre fit işe yarar, ancak yüksek SINO (>20)(örneğin, k_EX = 43.502 ± 38.478 Hz) ile yapılan deneylerden üsteller elde edilmiş olsa da, bir on-rezonans ve en az 3 rezonans eğrisi için iyi çalışmaz (yüksek hatalar veya fiziksel olarak imkansız değerler verir). Genellikle her SL ayrı ayrı iyi uyar, ancak bunları birbirine uydurmak çok daha yüksek bir hata verir; gerçek bir heyecanlı durum için tam tersi bir davranış beklenir.

"Gerçek" değişim endikasyonları Δω: 1) Rezonans dışı eğrilerden elde edilen Δω, NOESY spektrumunda ilginin zirvesi ile çapraz bir zirve gösteren uzaysal çevre / protonlardaki protonların kimyasal kaymalarıyla eşleşmez (örneğin, Şekil 5E). 2) Laguerre fit, on-rezonans için düşük hatalar ve en az 3 rezonans dışı eğri verir(örneğin, Şekil 5E vs. Şekil 5I, uygun sonuçlar için resim yazısına bakın).

Şekil 3: T7 tandem IVT ve RNase H dekolte reaksiyonunun örnek üretimi. (A) Tandem IVT ve RNase H dekoltesinin olumlu ve olumsuz sonuçlarının denatüre SAYFASI. Merdiven yüksekliği RNA referanslarını, 12* ise kimerik dekolte kılavuzunu ifade eder. Şerit 1: 20 nt hedef RNA'nın başarılı üretimi. Birkaç kısa ve uzun ürün mevcuttur. Şerit 2a: Tandem transkriptinin eksik bölünmesi. HPLC saflaştırması mümkün olsa da, çok fazla malzeme boşa harcanır. Lane 2b: Lane 2'nin devam eden RNase H bölünmesi, HPLC enjeksiyonuna hazır temiz bir örnek üretir (Lane 1 ile aynıdır). Lane 4: RNase H dekoltesi büyük ölçüde başarısız oldu ve hedef bant üretilmedi. Tam uzunlukta tandem transkript hala 600 nt'de görülebilir. Lane 5: Bir hedef bant üretildi, ancak güçlü bir -1 bandı mevcut. HPLC yapılabilmesine rağmen, yan ürünün dikkatli bir şekilde çıkarılması gerekir. (B) Başarılı bir HPLC enjeksiyonu örneği. 38 dakikadaki zirve, hedef uzunlukta saf RNA içerirken, daha uzun ve daha kısa ürünler hedef RNA'dan iyi ayrılır. Panel B ²¹'den değiştirildi. Kısaltmalar: IVT = in vitro transkripsiyon; HPLC = yüksek performanslı sıvı kromatografisi; nt = nükleotitler; AU = rasgele birimler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: A etiketli22-mer RNA'nın 1 H-1D spektrumunun NMR. (A ) Imino bölgesindeki katlama adımı 2.4 (bkz. protokol) öncesi (mavi) ve sonra (kırmızı) RNA saç tokası örneği. imino sinyallerinin baz çifti kimliği için beklenen bölgeler aşağıda gri ile belirtilmiştir. (B) ¹H,¹³C-HSQC spektrumu RNA'nın aromatik rezonanslarının panel A'dan. Katlamadan sonraki örnek (kırmızı) beklendiği gibi 4 sinyal gösterirken, katlamadan önceki örnek (mavi) yalnızca 3 sinyal gösterir. (C) 22-mer RNA'nın saç tokası olarak Mc-Fold tahmini. Panel A. (D) 22 mer RNA tarafından oluşturulan bir homodimerin önerilen yapısında her iki örnekte de bulunabilen bu ikincil yapıdan beş imino sinyali beklenebilir ve bu da saç tokası yapısıyla aynı 5 baz çifti ile sonuçlanır. Kısaltmalar: NMR = nükleer manyetik rezonans; 1D = tek boyutlu; HSQC = heteronükleer tek kuantum korelasyonu; ppm = milyon başına parça. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: RNA saç tokası bazlı iki farklı yapı için ¹H R _1φ RD temsili sonuçları. (A) Sol sütun, şişkin U'nun üzerinde bir C-G taban çifti ile RNA'da elde edilen sonuçları gösterirken, sağ sütun, taban çiftinin yerine G-C'ye geçirildiği bir örnekte elde edilen sonuçları gösterir. (B) ve (F) iki yapı için A4H8 için elde edilen düz dispersiyon profillerini gösterir ve konformasyonsal değişim olmadığını gösterir. (C–E) (G-C) yapısında G6 için elde edilen on-rezonans, off-rezonans ve takılı verileri gösterir. Laguerre uyumu aşağıdaki sonuca yol açar: R₁ = 2.87 ± 0.01 Hz, R₂ = 7.76 ± 0.03 Hz, k_EX =292 ± 40 Hz, p_ES = 0,31 ± %0,03, Δω = 112 ± 4 Hz. (G–I) (G-C) yapısında G6 için elde edilen on-rezonans, off-rezonans ve takılı verileri gösterir. Laguerre uyumu aşağıdaki sonuca yol açar: R₁ = 1.93 ± 0.02 Hz, R₂ = 6,71 ± 0,86 Hz, k _EX = 43,502 ± 38,478 Hz, p ES = ₂₇ ± , Δω = 203 ± 166 Hz. Bu rakam ²⁰'den değiştirildi. Kısaltma: SL = spin lock. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Burada sunulan protokol, daha önce 10^,20 ,^21,31araştırma makaleleri şeklinde yayınlanan çeşitli protokollerin bir sentezidir. Bu nedenle, protokolün bölümleri uygulanabilirken, diğerleri okuyucunun tercihine değiştirilebilir. Örneğin, R_1φ ölçümleri, katlama ve homojenlik uzunluğu varsayıldığı göz önüne alındığında, herhangi bir yöntemle üretilen bir RNA numunesi üzerinde gerçekleştirilebilir. Ayrıca, protokol RNA dizisinin rezonans ataması hakkında bilgi içermez-RD deneyleri için gerekli bir adım- bu önceki literatür^19,37^,38'dekapsamlı bir şekilde ele alınmıştır. Kısmi, segmental veya siteye özgü etiketleme şemaları^36,41,42,43,^44, rezonans atamasını kolaylaştırmak veya RD deneylerinde ilgi çekici olan ve literatürde uzun uzadıya açıklanan rezonansların çakışmasını azaltmak için yaklaşımlardır. Bu yöntem, rezonans atamasını önemli ölçüde basitleştirebilen herhangi bir nükleotid kimliğinin tekdüze etiketlemesinin kullanılmasına izin verir.

Burada sunulan IVT yöntemi, diziler ve etiketleme ile bilinen sorunların üstesinden gelir, verimi artırır ve maliyet ve çalışma süresini diğer yöntemlere göre azaltır. Viral başlatma dizisinin kullanımı reaksiyon optimizasyonu ihtiyacını azaltır, bu da alanda yapılması zaman alıcı olabilen bilinen bir sorundur ve G olmayan başlatma durumunda transkriptin sadece birkaç kopyasını verir. Tandem transkriptin T7 IVT ve RNase H dekoltesi aynı kapta aynı anda yapılabilir. Reaksiyon sırasında, RNase H reaksiyonunun tamamlanmasıyla hedef RNA'da tek bir bantta birleşen denatüre page jel üzerinde multimerik tandem tekrarlarının bir deseni görülebilir(Şekil 3A, şeritler 1 ve 2b). Bu yöntemi kullanan tipik verimler 1 mL IVT başına 30 ila 70 nmol RNA arasında değişmektedir. Yine de, tandem tekrarlarının RNase H bölünmesine dayanan yöntem, kendi başına belirli sorunlar olmadan gelmez. RNase H bölünme reaksiyoni genellikle T7 transkripsiyon ile aynı anda çalıştırıldığında tamamlanmaz(Şekil 3A, şerit 2a).

Tandem ünitelerin ayrılması, transkript için dekolte kılavuzu tavlanarak ve daha fazla RNase H eklenerek sonlandırılabilir(Şekil 3A, şerit 2b, adım 2.1.2). Büyük hacimlerin ısıtılması yavaş olduğundan ve RNA'nın Mg²⁺katalizli hidrolizine yol açtığından, numuneyi 10-15 s'de >95 ° C'ye ısıtan geleneksel bir mikrodalga fırın kullanılmıştır. Üretilen numuneler üzerinde şu ana kadar olumsuz etkiler gözlenmedi. Bazı yapılar reaksiyon koşullarının optimizasyonu ile ortadan kaldırılamayan küçük bir ikinci bant göstermektedir(Şekil 3A, şerit 4). Genellikle bunlar, iyi optimize edilmiş bir elution gradyanı kullanılırsa ve çıkarılabilirse HPLC kromatogramında bir omuz olarak oldukça net bir şekilde görülebilir (adım 2.2.5). Aşağıdaki tartışma, özellikle konformasyonsal dinamiklerin yorumlanmasına izin veren yüksek kaliteli verilerin elde edilmesiyle ilgili olarak protokoldeki kritik adımları vurgulamayı amaçlamaktadır.

RNase kontaminasyonu
Hücre dışı RNas'lar her yerde bulunur, son derece kararlıdır ve NMR örneklerinin uzun vadeli stabilitesi için en büyük tehdidi oluşturur. Bu nedenle, RNase içermeyen bir ortamda çalışmak ve tüm reaktifleri ve plastik yazılım RNase'leri içermeden tutmak çok önemlidir. Filtre uçlarının ve hatta yüz maskelerinin kullanılması önerilir. Bu, HPLC saflaştırmadan sonra özellikle önemlidir. RNases ile kontamine olmuş NMR örnekleri tipik olarak tek nükleotid bozulma ürünleri nedeniyle günler veya haftalar sonra ¹H-1D spektrumda görülebilen dar tepeler sergiler. Böyle bir örnek R_1φ ölçümleri için uygun değildir.

NMR örneği
Yüksek yüklü doğası nedeniyle, RNA çoğu proteine kıyasla yağış olmadan yüksek konsantrasyonlarda kullanılabilir. Shigemi NMR tüplerinin kullanımı (Malzeme Tablosunabakın), yüksek konsantre numunenin bobinin ortalamasına izin verirken, duyarlılıkla eşleşen cam alt ve piston nedeniyle ideal shimming ve kilitleme koşulları sağlarken avantajlıdır. Bu şekilde, B1-inhomogeneity azalır ve daha dar çizgilere yol açtı. Bir NMR tüpündeki tipik numune hacmi 250 μL'dir ve tipik konsantrasyon 1-2 mM'dir. 500 μM'nin altındaki örnekler RD deneyleri için önerilmez, çünkü deney çok uzun sürer ve iyi bir dolgu. Benzer şekilde, 200 μL'nin altındaki numune hacmi önerilmez, çünkü iyi bir dolgu ve alan stabilitesi (kilit) gereklidir. Pistonu takarken, numunede kabarcık oluşumunu önlemek çok önemlidir (adım 2.4.5). Düzgün sabitlenmezse, piston numuneye doğru kayarak algılanabilir birimi azaltabilir. Ayrıca, sıcaklıktaki hızlı değişiklikler numunede yeni kabarcıkların oluşmasına neden olabilir. Bu nedenle, numune taşınırken ve NMR spektrometresunda prob sıcaklığını değiştirirken dikkatli olunmalıdır. Daha uzun bir süre sonra tekrar ölçüm yaparken numunede kabarcık olup olmadığını kontrol edin.

RNA katlama
Dinamik RNA molekülleri düzgün katlandığında birden fazla konformasyonda bulunabilir. İkincil yapıların erime sıcaklıkları oda sıcaklığının sadece biraz üzerinde olsa da, ölçümden önce kapsamlı bir ısıtma ve snap soğutma prosedürü önerilir. Kinetik kontrol (ısıtma ve snap-soğutma) altında katlanan yüksek konsantre saç tokası örnekleri zamanla homodimer oluşturabilir ve bu da her NMR ölçümünden önce RNA katlamanın sıkı kontrolünü gerektirir. Ölçülen RNA bir saç tokası yapısı değil, RNA dubleks ise termodinamik kontrol altında yavaş katlama uygulanmalıdır.

Bu durumda, ısıtmadan sonra soğutma işlemi saat aralığında olmalıdır, RNA ise NMR numunesinde son hacminde ve konsantrasyonunda kullanılır. Beklenen imino ve aromatik rezonansların ilk sayısı, numunenin homojenliği hakkında fikir verebilir. Örnek beklendiği gibi görünmüyorsa, yeniden katlanmalıdır. Mg²⁺ (klorür tuzu olarak eklenir) katlanır RNA yapıları ile yardımcı olabilir⁴⁵. Pratikte, katlama kontrolü, en azından NMR rezonanslarını kısmen atamak ve ikincil yapıyı deneysel olarak çözmek için kullanılan bir örnekle karşılaştırma görevi görür.

Dönüş kilidi gücü ve ısıtma konuları
1 H R ^1φRD deneylerinin_2B genel bakış deneyleri olarak çalıştırılması durumunda, SL gücü 1,2 kHz'den düşük olmamalıdır. Radyofrekans verici frekansı, ilgi çekici zirvelerin ppm bölgesinin ortasına yerleştirilmelidir(örneğin,aromatik protonlar için 7,5 ppm). 1.2 kHz bant genişliği daha sonra bu protonları herhangi bir büyük rezonans etkisi olmadan spin-lock yapacak kadar büyük olacaktır. Bu tür efektler RD profilinde tanımlanabilir. Bunlar oluşursa, özellikledüşük SL gücü için artan SL güç değerleriyle R₂+R_EX değerleri azalmak yerine artar. Hesaplanan SL güç değerlerinin örneğe teslim edilen güce karşılık gelip olmadığını kontrol edin. Pratikte, ¹H 90 ° sert darbe daha yeni spektrometrelerde dikkatlice kalibre edilmişse, hesaplanan SL gücü kullanılabilir; ancak, istenen her bant genişliği için SL gücü kalibre edilerek bu kontrol edilebilir.

1 H R ^1φRD deneylerinde kullanılabilen SL güç aralığı çok geniştir ve değişen numune ısıtmasına yol açmaktadır (HCP tabanlı diziler için HSQC için 1,2 kHz ila 15 kHz ve SELOPE deneyleri için 50 Hz ila 15 kHz). Eşit olmayan numune ısıtma, düşük güçlü SL'ler için elde edilen 1D'ler karşılaştırıldığındakimyasal kaymada hafif bir değişiklik olarak tespit edilebilir. yüksek güçlü SL'ler. Bu etki genellikle heteronuclei üzerindeki R_1φ deneylerinde ısı telafilerinde dikkate alınmaz. Bu deneylerdeki ısı telafisi genellikle her spin kilidi güç serisinin vd listesinde belirtilen farklı dönüş kilidi süreleri nedeniyle farklı ısıtma için düzeltecek şekilde ayarlanır. Özellikle SELOPE deneyi için,²⁰'de açıklandığı gibi tüm uygulanan SL güçlerinde ikinci bir ısı telafisi kullanılmalıdır.

vd listesiyle ilgili önemli noktalar
Daha önce de belirtildiği gibi, vd listesi önemli bir yoğunluk bozunması elde etmek için yeterince uzun bir zaman noktası içermelidir (ideal olarak ilk sinyalin% 30'una kadar veya probun özellikleri içinde% 70'lik bir çürümeye ulaşmak mümkün değilse mümkün olduğunca düşük). VD listesi düşük bir SL gücü (1,2 kHz) için optimize edilmiş olsa da, bu vd listesi kullanılacak en yüksek SL gücünde(örneğin,15 kHz) test edilmelidir. Bunun nedeni, önemli R_EX katkısına sahip zirveler için, çürümenin yüksek SL gücünde çok daha yavaş olacağı gerçeğidir. Bu nedenle, yüksek SL gücünde yeterli bir çürüme de doğrulanmalıdır. Aynı durum, rezonans dışı deneylerde yüksek ofsetlerdeki çürümeler için de düşünülmelidir. VD listesinin ideal maksimum zaman noktası, dağılım deneyinin farklı bölgeleri için önemli ölçüde farklı olabilir. Bu durumda, vd listesine daha fazla nokta eklenebilir ve analiz sırasında daha yüksek SL gücü veya daha yüksek uzaklıklar için daha uzun vD liste noktaları, yol açacakları düşük SINO'ya bağlı olarak atılabilir. Genel olarak, 5-8 vd liste noktalarının J-kaplin gibi üstel olmayan çürümelere yol açan potansiyel eserleri tespit edebileceği düşünülmelidir (aşağıya bakın).

1D-HCP seçicilik konuları
HCP tabanlı 1D sürümü çalıştırırken, 2D HSQC tabanlı deneyin ¹H boyutunda ilginin zirvesiyle çakışan başka bir tepe varsa, özel dikkat gösterilmelidir. HCP tabanlı transferler çok, ancak asla% 100 seçicidir ve bu nedenle başka bir tepenin 1D'deki ilgi zirvesinin yoğunluğuna ve çürüme davranışına katkıda bulunduğu gerçekleşebilir. Bunun için bir gösterge, etiketli deneyin _1D ve 2D sürümleri kullanılarak elde edilen on-rezonans R 1φ değerlerinde bir fark olacaktır.

ROE ile ilgili önemli noktalar:
Yavaş ara değişime sahip atomların rezonans dışı eğrileri için, elde edilen Δω'nin NOESY veya ROESY spektrumu ile karşılaştırılması temel alınarak ROE eserleri tanımlanabilir. Bir çapraz tepe Δω'yekarşılık gelen kimyasal bir kayma farkıyla tanımlanabilirse, gözlemlenen heyecanlı durum aslında bir ROE eseri olabilir(örneğin,ROE'ler aromatik protonlar arasında bulundu, hepsi aynı kimyasal kayma aralığındadır ve bu nedenle rezonans dışı eğriler tarafından kaplanmıştır²⁰). Deneyime göre, bu her zaman büyük hatalarla zayıf uyumlara yol açtı, muhtemelen ROE'nun artan SL gücüyle R_EX ile aynı deseni takip etmemesi nedeniyle. Orta-hızlı değişim için durum daha da zorlaşır. On-rezonans eğrisi (komşu çekirdek üzerinde elde edilen ¹³C verisi ile karşılaştırıldığında) hala GS ve ES arasındaki değişim sürecini temsil ederken, rezonans dışı eğri birden fazla ROE eserinden etkilenir.

Bu durumda, değişim işlemini algılamak için SL gücü daha büyüktür (>1,5 kHz) ve bu nedenle, rezonans dışı eğriler çeşitli ROE adaylarının kimyasal kayma farklılıklarına yayıldığı için daha fazla sayıda protona yayılır (H8 için bunlar: ca'daki amino protonlar. ±1000 Hz, H5/H1'ler ca. -1200 Hz, imino protonlar yaklaşık 3500 Hz). Noe/ROE katkısı NOESY spektrası ile hariç tutulamazsa, bu yöntemle gerçek Δω hakkında güvenilir bir bilgi çıkarılamadığından, şimdiye kadar bu ROE eserlerini bastıracak bir yöntem bulunamadı (kısmen kısırlaştırılmış nükleotitler⁴⁶kullanmak dışında) ve off-rezonans verileri hızlı-ara değişim için kaydedilmemelidir.

J-Kaplin (Hartmann-Hahn) dikkat edilmesi gereken noktalar
H6 gibi homonükleer J-bağlantılı protonlar için on-rezonans eğrileri başarıyla kaydedilmiş olsa^{da, 10,20}, rezonans dışı ölçümler için özel dikkat gösterilmelidir, özellikle Hartmann-Hahn eşleştirme koşulları araştırılan ofsetlerin geniş bir yelpazesini kapsayabileceğinden düşük SL gücü için. Hartmann-Hahn eserleri, üstel çürüme üzerinde salınımlar veya on-rezonans RD arazilerinde artan SL güçleri ile artanR₂+R_EX değerleri olarak tanımlanabilir²⁰.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
%40 Akrilamid/Bis Solüsyonu	Biyo-Rad	161-0144
5-alfa Yetkin  E. coli	NEB	C2987I
Asetik Asit	Sigma-Aldrich	49199
Asetonitril	ve nbsp; Sigma-Aldrich	34851
AFC-3000, HPLC Fraksiyon toplayıcı	Thermo Scientific	5702.1
Agaroz	Sigma-Aldrich	A9414
Amersham ImageQuant 800 UV	GE Healthcare	29399482	LAS-4000 veya eşdeğeri
Amicon ultra santrifüj filtre ünitesinin	Sigma-Aldrich
Amonyum persülfat	Sigma-Aldrich	A3678
Ampisilin	Sigma-Aldrich	A9518
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
ATP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645702
BamHI kısıtlama enzimi	NEB	R0136L
Şişe üstü filtre	VWR	514-1019
Bromofenol Mavisi	Sigma-Aldrich	1081220005
Bölünme kılavuzu	IDT	N/A	veya eşdeğeri
CTP	Sigma-Aldrich	C1506
CTP-13C10 / 15N5	Sigma-Aldrich	645699
D2O	Sigma-Aldrich	151882
Dionex Ultimate 3000 UHPLC sistemi	Thermo Scientific N	/A
DL-Ditiotreitol	Sigma-Aldrich	43815
DMSO&	nbsp; Sigma-Aldrich	D8418
DNAPac PA200 22x250 Yarı Hazırlık sütunu	Thermo Scientific	SP6734
DNAPac PA200 22x50 koruma sütunu	Termo Bilimsel	SP6731
E.coli RNase H	NEB	M0297L	veya şirket içi Uniprot ref. P0A7Y4
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
Eppendorf santrifüj, rotor: A-4-44	Eppendorf	5804R
Etanol %95	Fisher scientific	11574139
Etanol %95 denatüre	VWR	85829.29
Formamid	Sigma-Aldrich	47671
JelRed	VWR	41003
GeneRuler 1kbp Plus	Fisher Bilimsel	SM1333	Opsiyonel
GMP	Sigma-Aldrich	G8377
GMP-13C10 / 15N5	ve nbsp; Sigma-Aldrich	650684
GTP	Sigma-Aldrich	G8877
GTP-13C10/15N5	Sigma-Aldrich	645680
Hidroklorik Asit	Sigma-Aldrich	H1758
İnorganik pirofosfataz	Sigma-Aldrich	I1643-100UN	veya şirket içi Uniprot ref. P0A7A9
Invitrogen UltraPure 10X TBE-tampon&	nbsp; Sigma-Aldrich	T4415
Julabo TW8 Su banyosu	VWR	461-3117
kuroGEL Midi 13 Yatay jel elektroforezi	VWR	700-0056	veya karşılaştırılabilir
LB suyu (Lennox)	Sigma-Aldrich	L3022
LB agar ile et suyu (Lennox)	Sigma-Aldrich	L2897
Düşük Menzilli ssRNA Merdiveni	NEB	N0364S	Opsiyonel
LPG-3400RS Pompa	Thermo Scientific	5040.0036
Magnezyum klorür hekzahidrat	Sigma-Aldrich	63068
mikroRNA İşaretleyici	NEB	N2102S Mikrodalga
fırın	Samsung
Mini-PROTEAN elektroforez ekipmanı	Bio-Rad	1658004
NucleoBond Xtra Maxi	Makine-Nagel	740414.10M
pUC19 tandem insert içeren plazmit	Genscript	N/A	veya eşdeğeri
RNaseZAF&	nbsp; Sigma-Aldrich	R2020
Shigemi tüpü 5mm ve nbsp;	Sigma-Aldrich	Z529427
Tek kullanımlık şırınga, Luer kilit ucu	VWR	613-2008
Sodyum asetat	ve nbsp; Sigma-Aldrich	S2889
Sodyum klorür	Sigma-Aldrich	730-1470
Sodyum perklorat	Sigma-Aldrich	71853
Sodyum fosfat dibazik	Sigma-Aldrich	S3264
Sodyum fosfat monobazik	Sigma-Aldrich	S3139
Spermidin trihidroklorür	ve nbsp; Sigma-Aldrich	85578
SYBR Altın	ThermoFisher	S11494
Şırınga filtreleri	VWR	514-0061
T7 RNA polimeraz	Sigma-Aldrich	10881767001	veya şirket içi Uniprot ref. P00573
TCC-3000RS Kolon termostatı	Thermo Scientific	5730
Tetrametiletilendiamin	Sigma-Aldrich	T9281
Tris Tabanı	Fisher Bilimsel	10103203
UMP	Sigma-Aldrich	U6375
UMP-13C9 / 15N2	Sigma-Aldrich	651370
Üre	Sigma-Aldrich	U5378
UTP	Sigma-Aldrich	U6625
UTP-13C10 / 15N5	Sigma-Aldrich	645672
VWD-3100 Dedektörü	Termo Bilimsel	5074.0005